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南京农业大学 生命科学学院 分 子 生 物 学 *南京农业大学 生命科学学院2 第五章 分子生物学研究法（上） DNA、RNA及蛋白质操作技术 *2南京农业大学 生命科学学院 *南京农业大学 生命科学学院3 第五章 分子生物学研究法（上） *3南京农业大学 生命科学学院 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速 发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作 和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分 子生物学研究的核心技术。 *南京农业大学 生命科学学院4 第五章 分子生物学研究法（上） *4南京农业大学 生命科学学院 v基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。 v基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过 它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞 中的繁衍与性状表达。 v事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的 基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因 工程技术区别于其它技术的根本特征。 *南京农业大学 生命科学学院5 第五章 分子生物学研究法（上） v内容： 1. 重组DNA技术回顾 2. DNA基本操作技术 3. RNA基本操作技术 4. 基因克隆技术 5. 蛋白质组与蛋白质组学技术 *5南京农业大学 生命科学学院 *南京农业大学 生命科学学院6 第一节 重组DNA技术回顾 *6南京农业大学 生命科学学院 v三大成就 n40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分 子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物 质基础问题； n50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交 替问题； n50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和 操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识 了遗传信息的流动和表达。 *南京农业大学 生命科学学院7*南京农业大学 生命科学学院7 重组DNA技术历史上的主要事件 年份事 件 1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。 M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959- 1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋 白质分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了 调节基因表达的操纵子模型。 1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与 该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 *南京农业大学 生命科学学院8*南京农业大学 生命科学学院8 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定； 科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒“DNA所决定。 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破 译了全部遗传密码。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸 内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转 录酶。 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一 个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技 术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体174基因组测定。 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰 岛素。 1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠； A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 *南京农业大学 生命科学学院9*南京农业大学 生命科学学院9 1982美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛素； Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986 GMO首次在环境中释放。 1988 J. D. Watson出任“人类基因组计划“首席科学家。 1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠-“Oncomouse“。 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。 2001完成第一个人类基因组全序列测定。 2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。 2005中、美、日科学家联合完成基因组全序列测定。 *南京农业大学 生命科学学院10 第一节 重组DNA技术回顾 v重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连 接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 v限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序 列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切 酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能 特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这 个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 v早在1967年，世界上有5家实验室几乎同时报道 了DNA连接酶。 *10南京农业大学 生命科学学院 *南京农业大学 生命科学学院11 几种主要DNA内切酶所识别的序列 及其酶切末端 *南京农业大学 生命科学学院12 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整 体。a. DNA的粘性末端；b. DNA的平末端； c. 化 学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。 *南京农业大学 生命科学学院13 第一节 重组DNA技术回顾 v 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行 DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将 它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主 细胞中进行繁殖。 v 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体。病毒 、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的 载体。 v 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA 分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新 导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖 *13南京农业大学 生命科学学院 *南京农业大学 生命科学学院14 第一节 重组DNA技术回顾 限制性核酸内切酶切割DNA DNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键 DNA聚合酶探针标记、补平3末端 反转录酶cDNA合成 多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记 末端转移酶3末端多聚尾 碱性磷酸酶3切除末端磷酸基 DNA外切酶3末端切除单核苷酸 噬菌体DNA外切酶5末端切除单核苷酸 重组DNA实验中常见的主要工具酶 *南京农业大学 生命科学学院15 第二节 DNA操作技术 1. 核酸凝胶电泳技术 v 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子 量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴 定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 v 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将 其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子 在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的 净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分 子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形 状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混 合物中的各种成分彼此分离。 *南京农业大学 生命科学学院16 第二节 DNA操作技术 1. 核酸凝胶电泳技术 v 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团， 呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子 ，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于 糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电 极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度 ，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电 泳技术分离DNA片段的基本原理。 *南京农业大学 生命科学学院17 第二节 DNA操作技术 1. 核酸凝胶电泳技术 v 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。 v 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 v 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔 隙越小，其分辨能力就越强。 v 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr）染料对核酸分子进 行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测 出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含 有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。 *南京农业大学 生命科学学院18 第二节 DNA操作技术 溴化乙锭染 料的化学结构及 其对DNA分子的 插入作用。由于 插入了溴化乙锭 分子，在紫外光 照射下，琼脂糖 凝胶电泳中DNA 的条带便呈现出 橘黄色荧光，易 于鉴定。 *南京农业大学 生命科学学院19 第二节 DNA操作技术 普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分 子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。 *南京农业大学 生命科学学院20 第二节 DNA操作技术 2. 细菌转化与目标DNA分子的增殖 v 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细 菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提 供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌 株则被称为受体菌株。 v 将快速生长中的大肠杆菌置于经0预处理的低渗氯化钙溶 液中，使细胞膨胀形成原生质球，与外源DNA形成粘附在细 胞表面的复合物。42下做短暂热刺激，复合物便会被细胞 所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达， 就可涂布于选择性培养基中分离转化子。 *南京农业大学 生命科学学院21 第二节 DNA操作技术 2. 细菌转化与目标DNA分 子的增殖 v 细菌转化方法除了上述的 CaCl2还有电击法，利用电 脉冲使细胞膜穿孔，外源 DNA进入从而实现转化。 v 利用噬菌体颗粒能够有效将 DNA注入到宿主细胞这一特 点，科学家又发明了DNA分 子的体外包装法。如右图 *南京农业大学 生命科学学院22 第二节 DNA操作技术 3. 聚合酶链式反应 v 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基 因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一 特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。 v 基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离 成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用 反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。 新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷 酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链(变性)、引 物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重 复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两 条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。 *南京农业大学 生命科学学院23 第二节 DNA操作技术 3. 聚合酶链式反应 v 具体过程： n首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（约 94）环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板 DNA； n然后降低反应温度（约56）冷却1min，使引物与两条单 链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序 列位置上； n最后，72左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5 3 方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR 管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成 后可以拿到产物。 *南京农业大学 生命科学学院24 多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数， 即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高 值是2n。 *南京农业大学 生命科学学院25 第二节 DNA操作技术 4. 实时定量PCR v 具体实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一 个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及 定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧 光化学物质，随着PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累 计，荧光信号强度也等比例 增加。每经过一个循环，收 集一个荧光强度信号，这样 我们就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而 得到一条荧光扩增曲线图 。 *南京农业大学 生命科学学院26 第二节 DNA操作技术 4. 实时定量PCR v 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光 背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧 光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量 之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。 v 实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素： nCt值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经 历的循环数。 nCt值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起 始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值 越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。 *南京农业大学 生命科学学院27 v 实时荧光定量PCR中荧光化学，荧光定量pcr所使用的荧光 化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如 下： v TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标 记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报 告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和 淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧 光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 v SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光 染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光 信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信 号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步 。 *南京农业大学 生命科学学院28 TaqMan荧光探针SYBR荧光染料 *南京农业大学 生命科学学院29 第二节 DNA操作技术 4. 基因组DNA文库的构建 v 从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段， 分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。这样每 一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组 DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有 基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库 。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序 列，就是该生物完整的基因组文库。 v 基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因 结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构 建和全基因组序列测定。 *南京农业大学 生命科学学院30 基因组DNA文库的构建过程 *南京农业大学 生命科学学院31 第三节 RNA操作技术 1. 总RNA的提取 v RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多 种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 v 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： v TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫 氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质 分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸 性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成 水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色 ）主要为DNA和蛋白质。 *南京农业大学 生命科学学院32 第三节 RNA操作技术 2. mRNA的纯化 v mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析 法最为有效，已成为常规方法。 v 利用mRNA的Poly A结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT 引物，与Poly A杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交 体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物 素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化寡聚 dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条 吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高严紧度盐溶液 中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与 mRNA分离，从而纯化得到mRNA。 *南京农业大学 生命科学学院33 PolyATtract mRNA的分 离纯化过程 简图 *南京农业大学 生命科学学院34 第三节 RNA操作技术 3. cDNA的合成 v cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链 cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，有反转 录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是 oligo dT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催 化。 *南京农业大学 生命科学学院35 第三节 RNA操作技术 4. cDNA文库的构建 v cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经 反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的 集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆 转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当 的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 v 步骤：在获得高质量的 mRNA 后，反转录合成cDNA，合成 接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插 入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定 。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 噬菌体，这是 因为 DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构 建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 *南京农业大学 生命科学学院36 第三节 RNA操作技术 5. 基因文库的筛选 v 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出 含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多 种，常用的有： n核酸杂交法 nPCR筛选法 n免疫筛选法 *南京农业大学 生命科学学院37 第四节 基因克隆技术 v 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表 示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群 体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 v 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 v 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载 体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 *南京农业大学 生命科学学院38 第四节 基因克隆技术 1. RACE技术 v 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知 序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR 扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE，用 于扩增3端的称为3RACE。 v 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法 显示和基因文库筛选。 *南京农业大学 生命科学学院39 第四节 基因克隆技术 1. RACE技术 v 5 RACE v 在反转录酶的作用下，以已知基因 片段内部。特异性引物启始cDNA 第一条链的合成 v RNase混合物降解模板mRNA，纯 化cDNA第一条链。 v 用末端转移酶在cDNA链3端加入 连续的dCTP v 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基 因片段内部特异的nested引物进行 PCR扩增，以期得到目的片段，并 可用nest PCR进行检测。 *南京农业大学 生命科学学院40 第四节 基因克隆技术 1. RACE技术 v 3RACE v 是在反转录酶的作用下，以连有可 以和polyA配对的oligo(dT)的锚定 引物启始cDNA第一条链的合成。 v 用RNaseH 降解模板mRNA。 v 用通用锚定引物和基因片段内部特 异引物进行PCR扩增得到目的3片 段，并可用nest PCR的方法继续 进行检测和扩增。 *南京农业大学 生命科学学院41 第四节 基因克隆技术 2. 应用cDNA差示法分析克隆基 因 v cDNA差示分析法（representational difference analysis, RAD）充分发挥 了PCR能以指数形式扩增双链DNA 模板，仅以线形形式扩增单链模板的 特性，通过降低cDNA群体复杂性和 更换cDNA两端接头等方法，特异性 扩增目的基因片断。 *南京农业大学 生命科学学院42 第四节 基因克隆技术 3. Gateway大规模克隆技术 v Gateway克隆技术是利用噬菌体与大肠杆菌的染色体之间 发生的位点特异性的重组整合与切出反应。整合反应是由Int （integrase）和 IHF（Integration Host Factor）催化的。 attB和attP之间的重组整合的噬菌体基因组DNA的5和3端 含有attL和 attR位点。 切出的重组反应需要IHF, Int 和 Xis 蛋白的参与。在插入E. coli 基因组DNA 的的噬菌体基因组 DNA的5 和3 端的attL和 attR位点发生位点特异性的重组， 重新在形成lambda DNA 的attP位点和E. coli 基因组DNA 的 attB位点。 *南京农业大学 生命科学学院43 第四节 基因克隆技术 3. Gateway大规模克隆技术 v相对酶切构建载体来说 ，该技术具有需时短、操 作简单、易于各实验室交 流的特点，即只需通过简 单、高效的BP 和LR 反应 就可实现把PCR 产物定向 转入克隆质粒和表达质粒 ，实现PCR 产物在各种质 粒间的转移。 *南京农业大学 生命科学学院44 第四节 基因克隆技术 4. 基因的图位克隆法 v 所有具有某种表现型的基因都可通过该法克隆得到。首先， 通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某染色体的特定位 点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 v 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的 分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体 步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来 *南京农业大学 生命科学学院45 第五节 蛋白质组与蛋白质组学技术 蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技 术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上 取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远 比基因技术复杂和困难。蛋白质组的研究实质上是 在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分 析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发 展高通量