的生物合成（转录）

第十二章 蛋白质的生物合成 将mRNA分子中 4 种核苷酸序列 编码的遗传信息，通过遗传密码破译的 方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基 酸的排列顺序过程，称为蛋白质的生物 合成或翻译。 参与蛋白质生物合成的物质 蛋白质生物合成的过程 第一节 参与蛋白质生物合成的物质 参与蛋白质合成的物质 原料：20种氨基酸 模板：mRNA 运载体：tRNA 场所：核蛋白体（rRNA与蛋白质构成） 蛋白质因子： 起始因子（initiation factor, IF） 延长因子（elongation factor，EF） 释放因子（release factor，RF） 其他：酶类、ATP、GTP、无机离子等 一、翻译的模板 -mRNA及遗传密码 mRNA是遗传信息的携带者、传 递者 v 遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子。 v 原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位 ，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白 质，为多顺反子。 v 真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子。 l mRNA上存在遗传密码 mRNA上每三个连续核苷酸对应一个氨基 酸，这三个相邻核苷酸就称为一个密码子， 或三联体密码。 阅读与书写方向：53 数量：64（43）,编码氨基酸 61 起始密码子：AUG（GUG） 终止密码子：UAA、UAG、UGA 第一个实验：1961年由美国的M.Nirenberg 等人完成的。他首先利用多核苷酸磷酸化酶合 成了一条由相同核苷酸组成的多核苷酸链,用 它作模板,利用大肠杆菌蛋白提取液和GTP在体 外合成蛋白质。发现多聚(U)导致多聚Phe的合 成,表明多聚(U)编码多聚Phe；类似的实验表 明,多聚(A)编码多聚Lys；多聚(C)编码多聚 Pro (图A) 证明三联体密码的三个著名实验 第二个实验：1964年也是由美国的 M.Nirenberg等人完成的。他们首先合成 一个已知序列的核苷酸三聚体，然后与大 肠杆菌核糖体和氨酰tRNA一起温育。由 此确定与已知核苷酸三聚体结合的tRNA 上连接的是那一种氨基酸。该实验对于几 种密码编码同一个氨基酸提供了直接的、 最好的证据（图B）。 第三个实验：由Jones,Khorana等人完成的 。他们利用有机化学和酶法制备了已知的核 苷酸重复序列，以此多聚核苷酸作模板，在 体外进行蛋白质合成，发现可以生成三种重 复的多肽链（图C）。若从A翻译，则合成出 多聚Ile，即AUC对应Ile；若从U翻译，则合 成出多聚Ser，即UCA对应Ser；若从C翻译， 则合成出多聚His，即CAU对应His。这是因为 体外合成是无调控的合成，可以随机地从A、 或U、或C翻译，所以有三种重复的多肽链生 成。 从mRNA 5端起始密码子AUG到3 端终止密码子之间的核苷酸序列，各 个三联体密码连续排列编码一个蛋白 质多肽链，称为开放阅读框架(ORF)。 2.密码子的不重叠 l遗传密码的特点 编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体 密码从起始密码子开始，连续阅读至终止 密码子，密码子间既无间隔也不重叠。 1.密码子无标点符号 方向5 3 基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发 生插入或缺失，可能导致移码突变。 3.密码子的简并性 遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有 一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个， 或多至6个三联体为其编码。 密码子简并性可以减少有害突变。 遗传密码的简并性 同一个氨基酸有两个或更多密码子 的现象，称为密码子的简并性。 对应同一种氨基酸的不同密码子，称 为同义密码子。同义密码子使用频率不同. 在蛋白质中出现频率越多的氨基酸， 其密码子的数量越多。 4.密码子使用频率不同 在蛋白质合成时，对简并密码子的使用 频率是不同的。 如UUU和UUC都为苯丙氨酸编码，但在 高表达的蛋白质中使用UUC的频率明显高于 UUU。 5. 密码子与反密码子配对的不严格性 tRNA上的反密码子通过碱基互补与 mRNA上的密码子反向配对结合，反密码子 第一位碱基与密码子第三位碱基间不严格遵 守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。 密码子、反密码子配对的摆动现象 tRNA反密码子 第1位碱基 IUGAC mRNA密码子 第3位碱基 U, C, AA, GU, CUG 摆 动 配 对 6. 通用性 地球上的一切生物都通用这套密码子 表。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒 体、植物细胞的叶绿体。 密码的通用性进一步证明各种生物进 化自同一祖先。 7.防错性 氨基酸的极性通常由密码子第二位 碱基决定，简并性由第三位碱基决定。 DNA突变时，保障编码的氨基酸不 变，或编码氨基酸的理化性质不变。 第2位碱基U：非极性、支链氨基酸 第2位碱基C：非极性或不带电荷的极性 氨基酸 第2位碱基A、G：除Trp外，均为极性氨 基酸 第2位碱基A，第1位碱基G：酸性氨基酸 第2位碱基A、 G，第1位碱基C 、A ：碱 性氨基酸和不带电荷的极性氨基酸 二、肽链合成的场所 -rRNA和核糖体 核糖体（核蛋白体）是蛋白质合成的场所 。 大肠杆菌核蛋白体的空间结构为一椭圆球 体，其30S亚基呈哑铃状，50S亚基带有三 角，中间凹陷形成空穴，将30S小亚基抱住 ，两亚基的结合面进行蛋白质合成。 核糖体亚单位rRNA蛋白质 原核生物 (70S) 小亚基(30S) 大亚基(50S) 16S rRNA 5S rRNA 23S rRNA 21种 34种 真核生物 (80S) 小亚基(40S) 大亚基(60S) 18S rRNA 5.8S rRNA 5S rRNA 28S rRNA 33种 49种 核糖体的组成 核 糖 体 的 组 成 核糖体的存在形式： 核糖体的存在形态有三种：核糖体亚基、 单核糖体和多核糖体。 核糖体亚基可在10mmol/L浓度的 Mg2+溶液中 聚合，在0.1mmol/L 浓度的Mg2+溶液中解聚。 真核生物：游离核糖体或与内质网结合 原核生物：游离核糖体或与mRNA结合成串状 的多核糖体(提高翻译效率)。 在蛋白质生物合成过程中，常常由若干 核糖体结合在同一mRNA分子上，同时 进行翻译，但每两个相邻核蛋白之间存 在一定的间隔，形成念球状结构。 由若干核糖体结合在一条mRNA上同时 进行多肽链的翻译所形成的念球状结构 称为多核糖体。 多聚核蛋白体（polysome） 原核生物翻译过程中核糖体结构模式 P位：肽酰位 （给位） A位：氨酰位 （受位） E位：排出位 （出位） 核蛋白体的大、小亚基分别有不同的功能： 1小亚基：可与mRNA、GTP和起动tRNA结合。 2大亚基： （1）具有两个不同的tRNA结合点。A位（右）可与 新进入的氨基酰tRNA结合；P位（左）可与延伸中的 肽酰基tRNA结合。 （2）具有转肽酶活性：将给位上的肽酰基转移给受位 上的氨基酰tRNA，形成肽键。 （3）具有GTPase活性，水解GTP，获得能量。 （4）具有起动因子、延长因子及释放因子的结合部位 。 三、氨基酸的运载 -tRNA与氨基酸活化 tRNA是将mRNA的核苷酸顺序转换成蛋 白质多肽链顺序的适配器： 在蛋白质合成中， tRNA起着运载氨基酸的作用 ，tRNA的3末端结合特定的氨基酸。 tRNA分子上三个特定的碱基组成一个反密码子， 位于反密码子环上,这是tRNA与mRNA的识别部位。 tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码 子相识别，按照mRNA链上的密码子所决定的氨 基酸顺序将所带氨基酸转运到核糖体的特定部位 。 一种氨基酸可以有一种以上tRNA作为 运载工具。通常把携带相同氨基酸而反密 码子不同的一组tRNA称为同功tRNA. 氨基酰tRNA-氨基酸的活化形式。 表示为： tRNAPhe 氨基酸的活化 -形成氨基酰-tRNA的过程 催化氨基酸与tRNA结合生成氨基酰- tRNA 具有绝对专一性： 对氨基酸及tRNA都能高度特异 识别 具有校正活性(proofreading activity) 1、氨基酰-tRNA合成酶催化 第一步反应 氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E AMP PPi 第二步反应 氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E tRNA与酶 结合的模型 tRNA 氨基酰-tRNA合成酶 ATP 2、起始肽链合成的氨基酰-tRNA tRNAiMet：进入核糖体P位点（真核） tRNAMet：进入核糖体A位点，肽链延长中。 tRNAffMet：进入核糖体P位点， Met N-甲酰化（ 原核） 真核生物：Met-tRNAiMet 原核生物：fMet-tRNAffMet 第二节 蛋白质生物合成过程 翻译过程从阅读框架的5-AUG开始，按 mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链，直 至终止密码出现。 整个翻译过程可分为 ： 翻译的起始(initiation) 翻译的延长(elongation) 翻译的终止(termination ) 一、翻译的起始 指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核 糖体结合而形成翻译起始复合物 的过程。 有多种称为起始因子（IF）的蛋白质参与这 一过程。 促进核蛋白体分离成大、小亚基eIF-6 促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合大亚基eIF-5 eIF-4F复合物成分，结合eIF-4E和PABIF-4G eIF-4F复合物成分，结合mRNA5-帽子IF-4E 结合mRNA，促进mRNA扫描定位起始tRNAIF-4B eIF-4F复合物成分，有解螺旋酶活性，促进mRNA 结合小亚基 IF-4A 最先结合小亚基促进大、小亚基分离eIF-2B，eIF-3 促进起始tRNA与小亚基结合eIF-2 真核 生物 促进大、小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA的 敏感性 IF-3 促进起始tRNA与小亚基结合IF-2 占据A位防止结合其他tRNAIF-1 原核 生物 生物功能起始因子 原核、真核生物各种起始因子的生物功能 (1). 核糖体大小亚基分离（IF3， IF1） (2). mRNA在小亚基上定位结合 (3). fMet-tRNAffMet的结合（IF2， GTP） (4). 核糖体大亚基结合 1. 原核翻译起始复合物形成 fmet-tRNA fMet -mRNA-核糖体 起始复合物 (1). 核糖体大小亚基分离 IF-3 IF-1 IF-3 IF-1 (2). mRNA在小亚基定位结合 A U G5 3 mRNA mRNA与小亚基的结合依赖于： 1. SD序列与16S rRNA 3端部分序列的互补 2. rps-1与mRNA上SD序列后的一段序列识别结合 S-D序列 (Shine-Dalgarno sequence ) mRNA起始密码AUG5端约813个核苷 酸处，有49个核苷酸组成的富含嘌呤的一致 序列，以AGGA为核心，也叫做核糖体 结合位点(ribosomal binding site, RBS) IF-2GTP (3). fMet-tRNAffmet 结合到小亚基 IF-3 IF-1 A U G5 3 (4). 核糖体大亚基结合，起始复合物形成 50S IF-3 IF-1 A U G5 3 IF-2GTP IF-3 IF-1 A U G5 3 GDPPi IF-2 mRNA 50S IF-1 IF-3 50S 50S A U G5 3 mRNA IF-2GTP IF-3 IF-1 A U G5 3 GDPPi IF-2 mRNA 50S 2. 真核生物翻译起始复合物形成 核蛋白体大小亚基分离； Met-tRNAiMet结合； mRNA在核蛋白体小亚基就 位； 核蛋白体大亚基结合。 MetMet 40S 60S MeMet t Met 40S 60S mRNA eIFeIF-2B-2B、eIFeIF-3-3、 eIF-6 elFelF-3-3 GDP+Pi 各种各种elFelF释放释放 elF-5 ATP ADP+Pi elF4E, elF4G, elF4A, elF4B,PAB Met Met-tRNAiMet-elF-2 -GTP 真核生物翻译起始 复合物形成过程 真核生物翻译起始特点 核蛋白体为80S（40S60S） 起始tRNA携带的甲硫氨酸不需要甲酰 化 mRNA5端帽子结构与其在核蛋白体上 就位有关，需要帽子结合蛋白复合物(eIF- 4F)参与 eIF2与Met-tRNAiMet和GTP结合构成复 合体后先与40S小亚基结合，然后才与 mRNA结合 二、肽链的延伸 核糖体沿mRNA53方向移动， 根据mRNA密码序列的指导，依次添 加氨基酸，肽链从N端 C端延伸， 直到终止密码子出现为止。 肽链延长在核蛋白体上连续性循环式 进行，又称为核蛋白体循环，每次循环增 加一个氨基酸，包括以下三步： 进位（注册） 转肽（成肽） 移位（转位） 需要延长因子（EF ）和GTP等 的参与 肽链合成的延长因子 EF-2有转位酶活性，协助mRNA- 肽酰-tRNA由A位前移至P位 ，促进卸载tRNA释放 EF-G EF-1 EF-1 促进氨基酰-tRNA进入A位， 结合分解GTP 调节亚基 EF-Tu EF-Ts 真核生物功能原核生物 1. 进位 根据mRNA下 一组遗传密码指导 ，使相应氨基酰- tRNA进入核糖体A 位。 2.转肽 50S大亚基有转肽酶活性，催化P位上 fMet-tRNAffMet（或延长中的肽酰-tRNA） ，将氨基酰基（或延长中的肽酰基）从 tRNA转移，与A位新进的氨酰-tRNA的-氨 基形成肽键。成肽后，P位留有卸载的 tRNA， A位是多了一个氨基酸残基的肽酰- tRNA。 肽链合成延长阶段的肽键形成过程 转 肽 Mg2+，K+ 转肽酶 O O AUG UAC 给受 C O = R-CH NH C O= H3CSCH2CH2-CH NH2 OOH AUG UAC 给受 CH2CH2-CH C= O CH-R NH2 O=C NH2 CH3 S 3.移位 延长因子EF-G有转位酶活性，可结合并 水解1分子GTP，促进核糖体向mRNA的3侧 移动。使肽酰-tRNA-mRNA相对位移进入核糖 体P位，而卸载的tRNA则移入E位，A位留空 对应下一组密码子，适当的氨基酰-tRNA准备 进位，开始下一轮核蛋白体循环。 移 位 进 位 移 位 转肽 真核生物肽链合成的延长过程与原核基 本相似，但有不同的反应体系和延长因子。 另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位 时卸载的tRNA直接从P位脱落。 真核生物延长过程 三、肽链合成的终止 当mRNA上终止密码子进入核糖体A 位点，终止因子（RF）识别终止密码， 多肽链合成停止，转肽酶活性变成水解 酶活性，肽链从肽酰-tRNA中释出，（通 过水解GTP，）核糖体与 mRNA等解离 ，蛋白质合成终止。 终止因子又称释放因子 一、识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG； 而RF-2可识别UAA、UGA。 二、诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基 转移到水分子-OH上，使肽链从核糖体上释放。 终止因子的功能 原核生物终止因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物终止因子：eRF 原 核 肽 链 合 成 终 止 过 程 动画 蛋白质合成过程 蛋白质合成的能量消耗 每形成一个肽键消耗四个高能键： 1、氨基酸的“活化”消耗二个高能键； 2、氨酰-tRNA的“进位”消耗一个高能键； 3、肽酰-tRNA的“移位”消耗一个高能键。 起始1分子GTP 终止1分子GTP 四、核糖体的跳跃式读码 翻译位移 核糖体在读码时表现为一个碱基 位移。 翻译跳跃 核糖体在读码时表现为跳跃一大 段mRNA再继续翻译。 跳跃式阅读可能与蛋白质内含子有关 。 蛋白质内含子 90年代初，发现了两类新的内含子。 一类是蛋白质内含子，其内含子DNA序列与 外显子一起转录和翻译，产生一条多肽链，然后 从肽链中切除与内含子对应的氨基酸序列，再把 与外显子对应的氨基酸序列连接起来，成为有功 能的蛋白质。 另一类是翻译内含子，mRNA中存在与内含 子对应的核苷酸序列，在翻译过程中这一序列被 “跳跃”过去，因此产生的多肽链不含有内含子对 应的氨基酸序列。 蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某 些毒素的作用靶点。它们就是通过阻断真核、 原核生物蛋白质翻译体系某组分功能，干扰和 抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。 抗生素-是微生物产生的能够杀灭或抑制 细菌的一类药物。 毒素 五、蛋白质合成的抑制剂 1、抗生素类 四环素（tetracyclin）族： 与原核生物小亚基结合，抑制氨基酰- tRNA进位 红霉素： 与原核生物大亚基结合，阻止核蛋白体在 mRNA上的移动 链霉素（streptomycin）卡那霉素（karamycin ）： 与原核生物小亚基结合，引起读码错误， 抑制起始 氯霉素（chloromycrtin）： 与原核生物大亚基结合，阻断翻译延长 过程 ，高浓度时对真核生物也有作用 嘌呤霉素（puromycin）： 结构与酪氨酰-tRNA相似，取代氨基酰 -tRNA进入A位，使肽链延长终止 放线菌酮（环己酰亚胺）： 特异抑制真核生物核蛋白体转肽酶 抗生素作用点作用原理应用 四环素族（金霉素 、土霉素） 链霉素、卡那霉素 新霉素、庆大霉素 氯霉素、林可霉素 红霉素 梭链孢酸 放线菌酮 嘌呤霉素 30S 小亚基 30S 小亚基 50S大亚基 50S大亚基 50S 大亚基 60S大亚基 真核、原核 核蛋白体 抑制氨基酰-tRNA与 小亚基结合 改变构象引起读码错误、 抑制起始 抑制转肽酶、阻断延长 抑制转肽酶、妨碍转位 与EFG-GTP结合， 抑制肽链延长 抑制转肽酶、阻断延长 氨基酰-tRNA类似物， 引起未成熟肽链脱落 抗菌药 抗菌药 抗菌药 抗菌药 抗菌药 医学研究 抗肿瘤药 抗生素抑制蛋白质生物合成的原理 嘌呤霉素 作用示意图 四 环 素 族 氯霉素 链霉素和卡那霉素 嘌呤霉素 放线菌酮 2、 白喉毒素(diphtheria toxin)的作用机理 白 喉 毒 素 + + + + 延长因子-2 （有活性） 延长因子-2 （无活性） 六、肽链的折叠、加工与转运 从核糖体释放出的新生多肽 链不具备蛋白质生物活性，必需经过不 同的翻译后复杂加工过程才转变为具有 天然构象的功能蛋白。再经过靶向输送 到特定细胞部位发挥生物学作用。 1、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质 新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成 ，新生肽链N端在核糖体上一出现，肽链的折叠 即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠 ，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完 整空间构象。 一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋 白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础 。 细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完 成，而需要其他酶、蛋白辅助。 几种有促进蛋白折叠功能的大分子 （助折叠蛋白） （1）. 分子伴侣 (molecular chaperon) （2）. 蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI) （3）. 肽-脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI) . 热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 . 伴侣素(chaperonins) GroEL和GroES家族 分子伴侣 分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可 识别肽链的非天然构象，促进各功能域和 整体蛋白质的正确折叠。 伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程 伴侣素的主要作用 为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然 空间构象的微环境。 肽-脯氨酰顺反异构酶 多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反 两种异构体，空间构象明显差别。 肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两 种异构体之间的转换。 肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象 形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时 ，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。 蛋白二硫键异构酶 多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成 对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分 重要，这一过程主要在细胞内质网进行。 二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可 在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形 成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力 学最稳定的天然构象。 （1）N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除： l N端甲酰蛋氨酸，必须在多肽链折迭成一定的 空间结构之前被切除。 去甲酰化： 甲酰化酶 甲酰蛋氨酸-肽 甲酸 + 蛋氨酸-肽 去蛋氨酰基： 蛋氨酸氨基肽酶 蛋氨酰-肽 蛋氨酸 + 肽 2、肽链的加工 （2）氨基酸的修饰： 由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、 磷酸化、甲酰化等。 （3）多肽链的水解修饰： 由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。 （4）二硫键的形成： 由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S