精品第五组利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体青蒿酸课件

第五组：利用基因工程酵母生产抗疟疾药物 前体-青蒿酸 * 选用这篇文章的原因： 符合微生物发酵的主题，且综合分子生物学、微生物 学、细胞生物学等学科 大部分为我们所学的知识：生化中的甲羟戊酸途径； 分子生物学实验手段等等 实验思路简单明了，充分体现对知识的灵活运用 实验结果影响深刻，将会对疟疾治疗带来一场革命 * 一、疟疾 俗称“打摆子”，是一种 由疟原虫（疟原虫属， Plasmodium spp.是 一类单细胞真核生物， 属于细胞内寄生虫）造 成的，通过疟蚊传播的 全球性急性寄生虫传染 病。 * 疟原虫的生命周期很复杂。通 过蚊子叮咬进入宿主体内後首 先侵入肝脏细胞，再由肝脏进 入血液感染红血球，在红血球 内无性繁殖扩增之後，受外部 环境因素的影响，它们可以继 续感染新的红血球，也可能形 成配子体（gametocyte），当 蚊子吸取受感染的血液後，雄 、雌配子体进入蚊子胃内发育 成配子并进行有性生殖，合子 最终在胃壁下形成卵囊（ oocyte）。卵囊中疟原虫进行 无性繁殖，最终形成孢子体（ sporozoite）进入蚊子唾液腺 ，准备感染新的脊椎动物宿主 。 * 疟疾在年发病率不超过十万分之三的中国可能并不为 人们关注，但是在非洲，平均每30秒就有一名儿童死于 疟疾。 世界范围内，仅是呈现临床症状的患者病例每年就在 3亿到5亿之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则则在一 到三百万之间, 这其中大部分为儿童。 * 由于传播疟疾的恶性疟原虫（ Plasmodium falciparum）具有复杂的生命周期，因而 很难根除这种疾病，治疗是唯一的选择。而抗药疟原虫 突变系Plasmodium falciparum2,3的出现更严重阻碍了对 这种疾病的控制。 而青蒿素，一种由我国学者在20世纪70年代初从 Artemisia annua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来 的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15倍半萜），通过释放 高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是 目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的 药物，被世界卫生组织称为“治疗疟疾的最大希望”。 二、青蒿素 * 人工合成青蒿素由于其工艺复杂 、毒副作用大、成本高而不能投 入生产。世界上青蒿素药物的生 产主要依靠我国从野生和栽培青 蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿 素的含量很低(0.1%- 1% w/w),且受地域性种植影 响较大。目前使用青蒿素进行治 疗每个疗程的费用是美元到 美元，对于受疟疾危害最深的 非洲和南美地区的贫困患者来说 过于昂贵。 * 基于这些因素，科学家们开始尝试利用基因工程手 段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为“ 青蒿素计划”，由美国加利福尼亚大学伯克利分校的生 化工程师Jay Keasling 主持，并且起初就获得“比 尔-梅琳达盖茨基金会”4260 万美元的资助。 2006 年，Keasling 等宣布，通过合成生物 学技术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者 可以产生高水平的青蒿酸（artemisinic acid） 青蒿素的一种直接的前体。 该成果发表于2006年4月13日英国自然杂志上， 题为“Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast ” 三、基因工程合成青蒿酸 * 但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出不知道多少倍， 而且其培养条件容易控制，不受气候、政治等因素的影 响。因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产 、高效的。 真核 糖酵解 甲羟戊酸途径 真核 糖酵解 甲羟戊酸途径 酵母与青蒿相比： * 研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内 合成的： 焦磷酸法呢 酯（FPP） Amorphadiene （合成青蒿酸及 青蒿素的最直接 的前体原料 ） 青蒿酸 青蒿素 * 由于酵母也可以合成FPP，所以我们所需要做的只是将 FPP到Amorphadiene再到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母 细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控， 使之能正常并且大量合成青蒿酸。 * 为了将流程图转 为现实，我们对 酵母细胞进行了 总共8次的基因工 程改造。 四 具体流程 * 第一步，为了能让酵母 细胞合成Amorphadiene，我 们将ADS基因插入由GAL1 启 动子控制转录的pRS425质粒 中，然后在酵母细胞中表达 ，结果显示单独转入ADS基 因的酵母只合成少量的 amorphadiene。如图中菌株 EPY201，4.4mg/L 。 * 而细胞中与amorphadiene 的量最直接相关的就是 FPP的量，所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadiene的 能力，我们对FPP合成途径（甲羟戊酸合成途径）进行了 总共5次的基因工程改造。 几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外 几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证 宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修 饰都是通过染色体融合进行的 。具体过程如下： * 首先，将一种截短的水溶性酶3-羟 基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（我 们所学生化书中为译为-羟基- 甲基-戊二酰辅酶A还原酶，简称 HMGCoA还原酶，又简称tHMGR，是固 醇合成的限速酶）过表达，可提高 amorphadiene的合成产量近五倍（ 菌株 EPY208）； * 其次，利用一个 methioninerepressible启动 子 (PMET3) ，通过对编码鲨 稀合酶（固醇生物合成途径 中FPP合成后第一步）的ERG9 基因进行负调控，可将amor phadiene的合成量再增加两 倍（菌株EPY225）； * 然后，尽管upc2-1, 一个 可以加强UPC（啤酒酵母 中调节固醇合成的一个的通 用转录因子）活性的半显性 突变体等位基因，在已有菌 株 EPY208背景下过表达（ 菌株EPY210）对 amorphadiene合成的提高起 的作用并不显著，但结合对 ERG9基因的负调控，其过表 达可将amorphadiene的合成 量提高到105mg/L（菌株 EPY213）； * 再次，在酵母染色体更 远处在转进一个tHMGR 拷贝可以将将其合成量 再增加50%达到149mg/L （菌株 EPY 219） ； * 最后，虽然编码FPP合酶的基因（ ERG20）过表达对amorphadiene合成总 量（菌株 EPY224）的提高效果非常小 ，但在细胞密度降低的情况下其合成 量却可增加10%。将所有这些对基因的 修饰综合在菌株EPY224上， amorphadiene的合成量已经达到了 153mg/L , 是之前所报道这种倍半萜( 烯)最大合成水平的几乎500倍。 * 现在我们已经得到了可以高效合成amorphadiene的 酵母菌株，但为能将amor phadiene转变成青蒿酸，我们 还需要找到并分离出青蒿中编码催化amorphadiene转变 成青蒿酸的酶的基因。 青蒿素是一种倍半萜内酯衍生物，这些衍生物在菊科 植物中普遍存在，是一类十分有特性的细胞次级代谢产 物。我们假定菊科植物在半倍半萜内酯的合成的前几步 中利用的是源于同一祖先的合成酶，据此对菊科植物进 行了一次基因组比较分析。 * 进行基因组比较分析之前，我们先接触两个概念： 1、细胞色素P450酶 细胞色素P450同工酶是血红蛋白超级家族，它是内质网 膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶。每个细胞色素P450 同工酶由一个蛋白质及一个血红素基弥补部分组成。细胞色 素P450酶系统催可催化很多反应，包括环氧化反应，N-去烷 基化，O-去烷基化，S-氧化及脂肪族和芳香族残基的羟化反 应。和所有的酶一样，细胞色素P450同工酶呈饱和 Michaelos-Meuten动力学，其活性需要辅助因子，并可被诱 导或抑制。 系统命名：比如，CYP2家族有几个亚家族，诸如CYP2C 、CYP2D、CYP2E。数字代表不同的酶，如CYP2D6，基因 同样用CYP2D6表示。不论其来源或催化活性为何，这种命名 法的优点是很易识别结构一致或高度相似的细胞色素P450酶 。 （CYP71AV1） * 2、已表达序列标志（EST） EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5端和3 端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整 基因的一小部分, EST 来源于一定环境下一个组织总 mRNA 所构建的cDNA 文库。 EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁 图和比较质量性状信息是特别有用。 EST是在随机选择并经序列分析后分离得到的和（或 ）进行了特性鉴定的核酸，当确定EST片段的序列时尚不 知道由之编码的蛋白质的功能。鉴定EST分子：首先确定 部分序列信息并将其储存在数据库中；然后用该序列信 息作为探针与数据库中的已知序列数据进行比较。在有 些情况下，经过这种同源性检索可以在核苷酸序列水平 上揭示出与编码已知功能蛋白质的另一种核酸相关的特 定EST序列。最后，选择这样的EST分子并进一步分析之 。 * 进行基因组比较分析的已知条件： 知道是一种特异的细胞色素P450酶对amorphadiene进行专一性羟化（先 前已经有文章报道），但其基因未知，我们目的就是要找到其编码基因 假定菊科植物在半倍萜内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的 合成酶 知道菊科植物的已表达序列标志（EST）数据库（由向日葵和莴苣这两种 菊科作物提供的基因数据构建，从中检索得到细胞色素P450已表达序列 标志（ESTs) 拥有针对CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的两个家族，其 序列已知）高度特异的简并引物 那么怎么通过对已知条件的运用才可以得到青蒿中 这种特异的细胞色素P450基因呢？ * 步骤如下： 高度特异的 简并引物 青蒿毛状体细胞 的互补DNA库 PCR、凝 胶电泳 回收等 几个特定的 p450片段 一个青蒿P450基因 片段 与之对应的mRNA 完整P450cDNA（CYP71AV1） RT -PCR 转录 BLAST分析法将这些片段 与向日葵和莴苣的EST 比对，我们惊奇地发现 有一个青蒿P450基因片 段与来自以上两种植物 的未知功能ESTs序列非 常相似 * 经过BLAST分析筛选出的那个青蒿P450基因片段与来 自以上两种植物的未知功能ESTs序列非常相似（氨基酸 水平上达相似度达85-88%），而同其他非菊科植物的 P450序列相似度较低（氨基酸水平上小于50%）。这表明 相对于非菊科植物，P450基因在这三个亲缘关系较远的 菊科植物属中是高度保守的。 随后相应的完整P450cDNA（CYP71AV1），一个编码 495个氨基酸的开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。 * 为了保证异源表达的 CYP71AV1可以发挥正常功能， 协同它进行氧化还原反应的天 然配体，NADPH：细胞色素 P450氧化还原酶（CPR），同 样从青蒿中成功分离，并且其 生化活性已经在体外被证实。 * 1、体内表达GC-MS检测 ： 在配体分子CPR的参 与下，我们分别在 活细胞体内和体外 研究了CYP71AV1是 否可以催化amorpha diene转变为多级氧 化产物。 * 分析结果显示：几乎 95%的这种特异化合物是来 源于细胞体的。而且这种化 合物的电子碰撞质谱和保留 时间与从青蒿中提取的青蒿 酸的完全吻合。 * 在摇瓶培养条件下，同时 表达CYP71AV1 和CPR的EPY224 菌株青蒿酸产量为32 13 mg/L (平均数 标准差, n 7)。更为重要的是，其中间代 谢产物，青蒿醇和青蒿醛在细 胞体和培养基中被检测到的量 几乎可以忽略（青蒿醇的量比 青蒿素酸的5%还少，并且根本 没有青蒿醛被检测出）。 * 从啤酒酵母菌株YPH499中分 离微体，这些微体仅表达CPR（对 照组）或者同时表达CPR和 CYP71AV1。将微体在不同的合成 途径中间体（amorphadiene，青 蒿醇，青蒿醛）条件下进行培养 。 2、体外酶法检测： * a-c每一种酶的测定分别加入 （a）10M amorphadiene， （b）25M 青蒿醇 （c）25M 青蒿醛。 底物的色谱峰用星号标出。醚提取 物经过衍生，并用GC-MS在不同的粒子模 式下分析（mlz：121，189，204，218， 220和248）。酶反应的产物按照预期得 到：1，青蒿醇（保留时间13.20分钟） ；2，青蒿醛（保留时间11.79分钟）；3 ，青蒿酸（保留时间13.58分钟，甲酯化 后检测） * 虽然先前已经有报道，使用青蒿蛋白提取物的体外 酶法测定证明可溶性的醇醛脱氢酶和一种C11，13双键还 原酶（作用于醛）参与青蒿素的生物合成 。我们不排除 在青蒿中存在其他的醇醛脱氢酶参与的催化反应，但是 体外实验中重组的CYP71AV1将amorpha-4, 11-diene高效 转化为青蒿酸，完全显示出膜结合、多功能的CYP71A V1是青蒿素的生物合成中的关键促成因素。 * 我们证实，通过用碱性缓冲液（pH为 9的Tris-HCL缓冲液中添加1.2M的山梨醇 ）清洗胞体沉淀物，绝大部分合成的青蒿 酸（96%）可以而被分离出，而且冲洗之 后细胞体和培养基中的残留量仅为2%。青 蒿酸不仅可以被高效的转移到细胞外，且 在酸性条件下经过质子化后会被束缚在细 胞表面。 五、提纯 * 利用这个特点制定了一种便捷提纯方法： 混合培养物细胞体沉淀物 碱性清洗 缓冲液 凝胶柱层析 纯度大 于95%的 青蒿酸 HCL调pH 醚抽提 抽提产物 * 在一个一升发酵罐中，青蒿酸的产量为115mg，而通这 种方法的，我们可以得到76mg的提纯产物。最重要的是，经 1H and13C原子核磁共振检测显示，这种酵母合成青蒿酸与 从青蒿中直接提取的青蒿酸分子结构完全一样。因此，可以 确定我们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功能上 完全正确的青蒿酸。 * 转基因酵母在生产青蒿酸时需要的生物量与青蒿相 比： 青蒿素（酸 ）含量 胞体干重4.5%地上部分干重 0.16% 培养时间 4-5天 数月 提纯方法简单 复杂 总之，转基因酵母菌珠的单位生产效率比 青蒿高了近两个数量级。 * 总的来说，我们采用改造 FPP生物合成途径的方法获得 了能高水平生产青蒿酸的啤酒 酵母菌株。该方法通过表达 amorphadiene合成酶，一种新 型的细胞色素P450和与之相关 的来自青蒿的氧化还原酶来提 高FPP的产量。据了解，相关 转化青蒿酸到青蒿素或其他派 生物的化学方法可能还有许多 待改进之处，但微生物法生产 青蒿酸是获得此类高效抗疟疾 药物切实可行的方法。 * 六、实验方法： 、化学和植物材料：青蒿酸标准品购买于Apin Chemicals公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取 。青蒿植株被栽培在加州大学伯克利分校的温室 当中，并且都是从种子开始培育的。 2、GCMS法分析Amorphadiene：用GCMS对不 同株系的啤酒酵母的Amorphadiene合成量进行测 定，使用十二烷阻止Amorphadiene的挥发。为了 定量衡量Amorphadiene产量水平，用于测定标准 曲线的Amorphadiene（90%纯）是通过大肠杆菌 菌株发酵制备的。 * 3、青蒿酸的胞内发酵，纯化及化学分析：将经过预培养 的在600nm（A600）下吸光度达到0.05的EPY224菌株（已 经被转入pESCURA:CPR 或者 pESCURA:CPR/CYP71AV1） 接种到25ml合成培养基中。该培养基不含组氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有0.2%的葡萄糖、 1.8%的半乳糖以及1mMol定量的甲硫氨酸。300C下恒温培 养120小时，然后将培养混合物进行离心，留下细胞体。 再用50mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）冲洗细胞体，加入 2M的HCl将缓冲液的pH调至2.0，用混入4-烷基苯甲酸（ 10ug/ml）的乙酸乙酯进行萃取。萃取馏分经50ul 2M的 四甲基硅烷-重氮甲烷和10%的甲醇衍生。在进行GC-MS分 析前，产物还要经过以（1：1）的醚和戊烷为洗脱剂的 凝胶色谱提纯。 * 最后，提纯的产物经气相色谱质谱仪（70eV， Agilent Technologies）分析，毛细管柱为DB5（0.25毫 米内径 0.2530m，J&W Scientific）。气相色谱的 加热程序从80（保持2分钟），以每分钟20的梯度递 增到140。产品分离时由5/min的速度增加到220。 采用火焰电离色谱检测标准品时为了定量，没有使用相 同的气相加热程序对柱子进行净化。 * 4、发酵及产物的核磁共振分析:使用1升的生物反应器（ New-Brunswick Scientific），在30的条件下，培养 酵母菌93个小时。2%的半乳糖的诱导酵母细胞，600nm下 测OD值为1.7，最终的细胞浓度OD值A600达到5.0。搅拌 速度从100rmp变到500rmp，每分钟通氧0.5L，使得溶氧 量始终保持在40%，青蒿酸使用碱洗的方法从细胞沉淀物 中提取出来，再使用含有78%的己烷，20%的乙酸乙酯和 2%的乙酸的硅胶管柱提纯。分离得到的青蒿酸（纯度大 于95%）的结构采用College of Chemistry NMR Facility at the University of California提供的1H 和13C NMR500MHz核磁共振仪进行分析。 * 5、体外酶法测定:用重组质粒pESCURA:CPR或者 pESCURA:CPR/CYP71AV1与1升的啤酒酵母YPH499培养物 ，加入2%的半乳糖转化24小时。微体使用聚乙二醇法沉 淀，然后超高速离心去除前面提到的细胞里的蛋白质杂 质。取大约500g的微体蛋白，100mM pH 7.5的磷酸加缓 冲液, 10或者25M 的培养基，100M NADPH和一个NADPH 的重建体系（5mM 葡萄糖-6-磷酸和2个单位的葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶）。反应在24下轻微搅拌作用24小时。反 应完成之后加酸至pH 为2，然后使用乙醚抽提。产物采 用与上面所述相同的气相加热程序。使用包含了相对于 产物典型的六种离子（121，189，204，220和248）的固 定离子检测（SIM）法进行检测。 * 七、本实验的意义： 保守分析证明，在使产品效价最优化的情况下，青蒿 素结合治疗法将会远远降低于现在用于疟疾治疗的价 格。 这种生物合成方法不会受到像天气和政治气候等因素 的影响，但这些因素可能会对植物的培育造成影响。 从微生物里得到的青蒿酸可以采用对环境友好的方式 提取，而不用担心像植物能够产生其他的萜烯致使产 物受到污染，从而减少纯化的费用。 * 转化的真菌除了用于治疗疟疾以外，也可以用来对抗 其他疾病。基因改良的菌株还可被转化用来生产其他 类异戊二烯类化学物质，只要以对工程菌做稍许的改 变，加入任何数量感兴趣的与化学物合成有关的植物 基因，几乎可得到任何一种类异戊二烯物质，包括像 调味薄荷醇、类胡萝卜素（可对抗紫外线损伤）和紫 杉醇（从太平洋紫杉所提炼的一种抗癌药）。 * 尽管这种基因工程酵母合成青蒿酸的能力相对于青 蒿来说已经十分显著，仍需急切解决问题的是如何提高 其生产效率从而扩大至工业规模生产，以便可以生产出 足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格，让青蒿素综 合疗法可以广泛地被应用到对疟疾的治疗中去。 * * oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A- w*t!qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$nVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A- x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A- x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+t$E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A- x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z- w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-gOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8H5D2A- x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#kShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z- w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+xqYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A- x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z- w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$VjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3BQfNcK8