乙肝丙肝核酸检测的新平台（临床）课件

乙肝丙肝核酸检测的新平台 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 全自动荧光定量分子诊断系统 顾 剑 罗氏分子诊断 自动化程度 1992 1996 1998 2001 2003 2006 MWP COBAS AMPLICOR COBAS AMPLIPREP COBAS AMPLICOR MONITOR 罗氏分子诊断 标准化 自动化 重复性 COBAS TAQMAN 48 COBAS TAQMAN 96 一直以来，罗氏分子诊断对临床 核酸检测市场提供完善可靠和创 新性的产品及解决方案 目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题 治疗终点无法准确判定 有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳，但临 床症状依然明显 不能及时预测耐药（病毒学突破） 核苷（酸）类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下 ，不久却发现病毒出现反跳 疗效的准确监测？ 治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后 问题的根源在哪里？ 内 容 HBV核酸检测的现状与需要 HCV核酸检测的现状与需要 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处 总结 HBV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用 HBV DNA是监测抗病毒治疗响应和时间的关键标志物 HBV 治疗的路线图理念，为HBV DNA监测用于临床实践提供 了指导 对用药耐药性的监测（拉米夫定YMDD，） 肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后） HBV DNA监测监测 的临临床应应用 HBV治疗疗路线图线图 Keeffe E. Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897. 侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗疗方案优优化，中国肝脏脏病杂杂志 国产试剂现状 目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题： HBV试剂盒说明：5005107 IU/mL 较可信的测试范围：1045107 IU/mL 对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测 注：1 IU/mL= 1 copy/mL 内 容 HBV核酸检测的现状与需要 HCV核酸检测的现状与需要 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处 总结 HCV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用 HCV病毒感染是可治愈的疾病 HCV RNA检测可以有效指导临床用药 治疗的终点是核酸检测为阴性（核酸检测可以直接指导停 药时机） 慢性HCV治疗方案 治疗应答名称描述 快速病毒学应答（RVR）4周时未检测到HCV RNA 早期病毒学应答（EVR） - 完全早期病毒学应答（ cEVR） 未RVR，但12周时未检测到HCV RNA - 部分早期病毒学应答（ pEVR） 未RVR，12周时HCV RNA拷贝数下降 2log10，但仍检测到HCV RNA 没有应答12周时HCV RNA拷贝数下降2log 继续治疗至48周 继续治疗至24周考虑停药 国产试剂现状 目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题： HCV试剂盒说明：5005107 IU/mL 较可信的测试范围：1045107 IU/mL 注：1 IU/mL= 1 copy/mL 内 容 HBV核酸检测的现状与需要 HCV核酸检测的现状与需要 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处 总结 全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统 真正实现 “样品进，结果出” 全球安装超过 2,000台，国内安装超过 40台 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系统 COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48系统 COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系统（带连接系 统） COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系统 （无连接系统） COBAS AmpliPrep仪器简介 全自动系统，自动进行核酸提取纯化和 PCR反应体系配制 基于MGP磁珠分离技术，确保高质量的核 酸提取纯化 最多72个样品可以同时上机，运行中可连 续装载上架，提高工作效率 包括耗材、样品、试剂均可以连续上 样 DNA 或者 RNA 1.裂解、稳定和去蛋白 2.核酸捕获 病毒或细胞 3.冲洗4.洗脱 37C孵育 COBAS AmpliPrep仪器 MGP 磁珠分离技术 室温80C孵育 取SPU枪头 样本管/反应管管盖抓手 样本初始体积感应器 取试剂钢针 CAP机械臂介绍 样本管/反应管结构 COBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48分析仪简介 检测通量可达4*24测试 独立的24孔热循环仪 TaqMan 48有2个模块，TaqMan 96有4个模块 最多可同时进行4个不同的分析检测 操作简单，核酸扩增和检测全部自动完成 实时定量PCR检测技术，卓越的检测性能，灵敏 度高和特异性好，动态范围宽 HBV-DNA定量测试用于药品FDA注册试验 通用名商品名 FDA 批准日期 关键的 HBV-DNA测试 Interferon alfa-2b -2b 干扰素 INTRON A1991N/A Lamivudine 拉米夫定 EPIVIR-HBV1998杂交研究解决方案 1 Adefovir dipivoxil 阿德福韦酯 HEPSERA2002Amplicor Monitor 2 Entecavir 恩替卡韦 BARACLUDE2005Cobas Amplicor 3 Peginterferon alfa-2a 聚乙二醇干扰素-2a PEGASYS2005Cobas Amplicor 4 Telbivudine 替比夫定 TYZEKA2006Cobas Amplicor 5 Tenofovir 替诺福韦 VIREAD (HIV)Phase 3Cobas TaqMan 6 INTRON A (Interferon alfa-2b) package insert. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV INTRON A (Interferon alfa-2b) package insert. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV (Lamivudine) package insert GlaxoSmithKline, Research Triangle park, NC 3. HEPSERAHEPSERA (Adefovir dipivoxil) package insert Gilead Sciences. Foster City, CA 4. 4. Pegasys (Peginterferon alfa-2a) package insert. Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ 5. TYZEKA (Telbivudine) Package Insert. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART TYZEKA (Telbivudine) Package Insert. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART 2007 Meeting 2007 Meeting Abstract 63, Dec 9-13 2007, Lahaina, HI 国外发表的文献 Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B. Gallego et al., Journal of Viral Hepatitis, 2008, 15, 392398 Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM) for quantification of HCV RNA. Christoph Sarrazina et al., Journal of Clinical Virology ,2008, 43, 162168 COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV) Test: a Novel Automated Real -Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma. Tiziano Allice et al., Journal of Clinical Microbiology, Mar. 2007, p. 828834 Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay. Ronsin C et al., Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4) Comparison of the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum. Simon Siu-Man Sum et al., Journal of Medical Virology 2005, 77:486490 Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 in serum and plasma matrices. Goedel S et al., Journal of Clinical Virology 2009 Jul;45(3):232-6 Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation : Possible clinical implications. GARBUGLIA A. R. et al., Journal of virological methods 2007, vol. 146, no1-2, pp. 274-280 Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. Stephane Chevaliez et al., Journal of Clinical, May 2008, p. 17161723 HBV的定量检测性能指标 国产HBV试剂CAP/CTM HBV 灵敏度 (LOD)500 IU/mL？12 IU/mL 检测范围 1045107 IU/mL54 - 1.1108 IU/mL 定量方法外标法定量内标法定量 其它 对部分发生HBV病毒突变 的病人无法准确检测 涵盖亚型: A-G 加强pre-core突变检测 注：国产试剂1 IU/mL= 1 copy/mL HCV的定量检测性能指标 国产HCV试剂CAP/CTM HCV 灵敏度 (LOD)500 IU/mL？15 IU/mL 检测范围 1045107 IU/mL43 6.9107 IU/mL 定量方法外标法定量内标法定量 其它未知 1-6 型 (能区分 0.5 log浓度变化) 定量原理 外标法定量（国产试剂） 使用一组（4管）外部标准品定量，分别为5104到5107 IU/mL 未考虑各患者血液成分间的差异性对结果的影响 定量原理 内标定量Internal Quantitation Standard(CAP/CTM) 内标是已知拷贝数的人工构建核酸，加入每一反应管，与靶核酸竞 争扩增，管内定量 可提示反应是否存在反应抑制，避免假阴性结果 充分考虑管间反应效率的差异，得到可靠精确的结果 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统 封闭样品管输入，封闭PCR管输出 标准化，重复性 纯化好 的核酸 主反应液 PCR反应体系的配制 试剂、样品和耗材的装载上机 样品处理单 元 K-枪头 K-管 样品 试剂 Branchburg生产厂房 罗氏投资超过1.5亿美金，建成全球最大分子诊断试剂生产基地 目前每月生产14万套试剂 罗氏分子诊断严格的生产和质控体系 为整个行业设定了高标准 1. 原料严格把关3. GMP生产2. 原料质检 4. GMP生产 6. 成品质检5. 试剂盒成品7. 资料入档 COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan 全自动荧光定量分子诊断系统的应用 抗病毒治疗评估和监测（HBV/HCV），为临床医生和病人 提高更准确的结果，指导用药。可针对疑难病例、低病 毒载量、长期用药或高端病人 肝移植的术前术后监控 全国药物、诊断试剂临床评估实验基地 CAP室间质评时有与国际接轨的平台，评价更科学 基础研究的工具，文章可信度大大增加 国内部分用户 省份用户主要检测项目仪器类型 北京北京大学人民医院肝炎所（魏来）HBV/HCVCAP/CTM 48 北京北京大学基础医学院（庄辉）HBV/HCVCAP/CTM 48 北京北京友谊医院（贾继东）HBV/HCVCAP/CTM 48 浙江浙江大学附属第一医院（李兰娟）HBV/HCVCAP/CTM 48 广东南方医院（侯金林）HBV/HCVCAP/CTM 96 北京北京大学第一医院HBV/HCVCAP/CTM 48 北京北京协和医院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48 上海上海瑞金医院（张欣欣）HBV/HCVCAP/CTM 48 四川华西医科大学附属华西医院（唐红）HBV/HCVCAP/CTM 96 湖北武汉同