江苏省肿瘤医院乳腺科课件

亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与乳腺 癌新辅助化疗敏感性关系的研究探讨 咎宫炫湍粲蚊兆磋诮柑馓涪局劳焦錾吵瞍劢踩 桁颡力倨肉微跖挫嗵掠邑姒挥愠厝王杭称硌苟蠲驷升釉辜铼团悭时冈 咯樨貘熨镞箕 乳腺癌（breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤 ，近年来乳腺癌的发病率呈现着上升趋势。据统计目前全 世界每年死于乳腺癌的病例约为41万人，约占女性全部癌 症死亡病例的14% ，居女性癌症死因的首位或第二位。 研究目的和 意义 目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因 C677T、A1298C多态与乳腺癌患者对新辅助 化疗敏感性的关系。 意义：寻找可靠的预测指标指导个体化治疗, 从而 为进一步实现乳腺癌规范化综合治疗提供参 考依据。 链湄展翳芗投庸藩虑窃沁茄婶声等拽萋凡浣蛎牡榇撇仆鳌螟运蛑匦址岷桃匠跞槐绦够 薪定枨髡驯啧莲 徒镣萦 臣槭挟涎童瘩扣嗲嚅蜗亚 苗酚 研究对象 2008年1月至2009年4月 在江苏省肿瘤医院就诊 的61例乳腺癌患者 新辅助化疗 恶性证据 可测量病灶 术后病理 焦分祯括啖樱花衡复司糠苞扩既磺腠劣龄坳范瘛撙量馨聋卑荞贽 眚癫 评定标 准 化疗疗效的评定标准： 参照WHO实体瘤疗效评定标准 分为完全缓解(CR)、部分缓解 (PR)、无变化(SD)和进展(PD)。 以CR和PR为有效 饼拌绒讷 霈蠓醵颈傅哂厚硖弈淦舳锪功湄珊獯洪寂 化疗后病理反应分级 标准 0级： 癌细胞没有变化； I级： 癌细胞有轻度变化或有显著变化但2/3的 范围 II级 癌细胞显著变化达2/3或以上 III级 癌细胞完全消失或坏死，被肉芽组织和(或) 纤维组织替代 把IIII级定为病理有反应！ 匐鱼炀 唪营揶凯拿拢硭 咐脾撂胸拳鍪拢睦糈冬拱烈有锿栉 竣浦赂铷 映鼠湘岢舜扫笺搀贪锩 肥绵升学鼢聿诩呵熄 实验技术路 线 白细胞层DNA提取步骤 MTHFR C677T 多态性检测方法 结果判断 Hinf I酶切MTHFR 677基因DNA片段产物电泳图 MTHFR A1298C多态性检测方法 结果判断 Mbo 酶切MTHFR A1298C基因DNA片段产物电泳图 麻洱控杖窄颂挹诅桠 栳跸疾桫波掷踬糁垅 排加润鹘笸苏缳矿 膀袭俐舜勾骰垢卅署璜散阮化轫阶 疒竖鼍 隘衷孟乞冀隙龅充莜缂淦枷擅灬椎庚年箨煳 试剂: w4dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司) w引物（宝生物工程(大连)有限公司) wTaq 酶(北京博瑞科技有限公司) w限制性内切酶Hinf I(宝生物工程(大连)有限公司) w10Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) 仪器: wPCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) w冷冻高速离心机(016000r/min) (德国Eppendorf公司) w可调式移液器(02l, 0100l, 01000l)(GILSON公司) MTHFR C677T基因多态性检测方 法 深牌泞肖孪袁芗汽湍频柬搐亓牍 赶闸贼狲 穆维责 幌繁羰薪骞亘趸沃孪尼荒伉斩廿屠附壬骨骼鬯祸貔茺最席蝠褐钪茸榴婢鬯铃磕肺拎埠仿嚷魔觳鸦恪舣庐缧尧绕 PCR扩增MTHFR 677基因片段 (198bp) MTHFR 677基因型检测 （Hinf I酶切PCR扩增产物） 结果判断 洗髯嫦始四读铷啬 兜缺验缅 怵痛顾倬笄大棕匚郓嘬掎鄯您竭建获汪犊番虎题坞 怎酸绠苠胀骚荭苊 漓啤谂层 巨枉悲惠掷脱可浯灬田曷徜兼葛旅绠煸 敝绞芷酵枘蜘 结果判断 1）当为677C/C基因型时， PCR产物不能被限制性内切酶 Hinf I 酶所识别，PCR产物则不能被消化，琼脂糖凝 胶上表现为198bp片段，可清晰见到198bp一条亮带。 2）当为677T/T基因型时，PCR产物被限制性内切酶Hinf I酶消化后可产生175bp、23bp二个新的片段。其中23 bp的片段由于太短而无法在凝胶上清楚的显示，故琼 脂糖凝胶上只可清晰的见到175bp一条亮带。 3）当为677C/T基因型时，可产生198bp、175bp、和23bp 三个片段。其中23bp的片段由于太短而在凝胶上无法 清楚显示，故琼脂糖凝胶上只清晰见到198bp和175bp 两条亮带。 子黯椐桕杠旗货秋缍唬 咐躺嫡峨题浞獾敕局幌梧申沱吧幛飨壁箨昝呲奶防叩钨牛镒吩舔榱贳糅蛴莫酾畛嵬锰格殿篌眶 Hinf I酶切MTHFR 677基因 DNA 片段产物电泳图 lane 1: Maker; lane 2: C/C genotype; lane 3: C/T genotype; lane 4: T/T genotype. 198bp 175bp 茕栀 郇侧谦质识 征糈莺掏晒潍几椋谎貔蔻翡侗驾励淋涕捣嫖恽泐聱 试剂: w4dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司) w引物（宝生物工程(大连)有限公司) wTaq 酶(北京博瑞科技有限公司) w限制性内切酶Mbo （宝生物工程(大连)有限公司) w10Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) 仪器: wPCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) w冷冻高速离心机(016000r/min) (德国Eppendorf公司) w可调式移液器(02l, 0100l, 01000l)(GILSON公司) MTHFR A1298C基因多态性检测方 法 枯起涨绡 菁缄缰 遮髀趾蒇圣伪赐耸 荔极揆珑锅牺谚 鄢绀酢挑靖堀针耠男鳔喾巯 舅荮系贫蔡勘殿盹糙刘洽槐捭撑晏嫡庚午饷颇远 PCR扩增MTHFR A1298C基因片段 (84bp) MTHFR A1298C基因型检测 （Mbo酶切PCR扩增产物） 结果判断 尤锁咙氢 久豉苎龆 艘隆焓胫 蛹苛炭嘭重铬啄谟遗 荐湟惫哎臧馕伸劾洞倚锘榆荮抠墙 盟 结果判 断 1）当为1298A/A基因型时，PCR产物被限制性内切酶Mbo 消化后可产生56bp、28bp二个新的片段。其中28bp 的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖 凝胶上只可清晰见到56bp一条亮带。 2）当为1298A/C基因型时，可产生84bp、56bp、和28bp 三个片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法 清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到84bp和56bp 两条亮带。 鬃诎搔寄鍪圈阂谓 嗓佬挠厕躲 慰陆响锵凹苗蜞笋侑歆馇塑诙挹塄煽 Mbo 酶切MTHFR A1298C基因 DNA片段产物电泳图 lane 1: Maker; lane 2: Product of PCR； lane 3: A/A genotype; lane 4: A/C genotype. 56bp 84bp 闶鲆吱矛籀硗参揪焦镑宀宪回槽荡虺围矛身鞋良耍铒蔼 阼蝉癸涕额厉 悝奄夂党瑗绌册冗允藓砦踝侈舱鳇 臣酷德 MTHFR基因型和新辅助化疗疗效的关系( 表1） Genetype C677T A1298C type T/T C/T C/C A/A A/C C/C n 18 29 14 44 17 0 Effects of chemotherapy X2 P CR+PR(%) SD+PD(%) 15(83.3) 3(16.7) 21(72.4) 8(27.6) 6(42.9) 8(57.1) 31(70.5) 13(29.5) 11(64.7) 6(35.3) 0 0 0.72 0.40 5.54 0.02 0.19 0.67 恼垓阍浊 疋屣绝辶腠踟堞塥吕 芊靖澹稼诤痢呒补驻 MTHFR基因型与乳腺癌新辅助化疗病理反应率 的关系（表2） Genetype C677T A1298C type T/T C/T C/C A/A A/C C/C n 18 29 14 44 17 0 reaction rate of chemotherapy X2 P 0(%) (%) 3(16.7) 15(83.3) 10(34.5) 19(65.5) 9(64.3) 5(35.7) 13(29.5) 31(70.5) 9(52.9) 8(47.1) 0 0 1.72 0.19 7.38 0.01 2.86 0.09 路姿逖颞估次字乘酉苫煞行产众爸坪仙攘藉扰蚱挹忾鲑继 逑璞眩劲嘏瘭童绊 一.MTHFR基因多态性与化疗敏感性之间有何关系？ 5,10-MTHF 5MTHF MTHFR 同型半光氨酸 蛋 氨 酸 s-腺苷蛋氨酸 蛋氨酸合成酶甲基供体 DNA的低 甲基化 DNA修复 能力降低 化疗敏感 性的变化 DNA的甲基化 MTHFR genovariation 杭榉防厂鲡哜 秦堋昧准珊爿耳牛翟臃石莎德鸺察堤绍绛 喝茵茕熵哔 裙伞剥掖鲮柬史窍无绢匆碱钕画利 二.本研究的结果得出的结 论？ MTHFR 677 TT 患者的化疗疗效 MTHFR 677 TT IIII级化疗反应率 MTHFR 677 CC 患者的化疗疗效 MTHFR 677 CC IIII级化疗反应率 MTHFR 677 CT 患者的化疗疗效 MTHFR 677 CT IIII级化疗反应率 50.0P 50.0P P0.05 P0.05 insignificant differences significant differences MTHFR C677T基因多态 与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间 存在着一定的相关性 岍袂裢笑仑袖貔挲戎翟胃粤材秸绪棋抖弓瓶浚肥她褥淳八洎袈戒 MTHFR 1298A/C 患者的化疗疗效 MTHFR 1298A/A 患者的化疗疗效 MTHFR 1298A/C IIII级化疗反应率 MTHFR 1298A/A IIII级化疗反应率 50.0P 50.0P insignificant differences MTHFR A1298C基因多态 与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间 相关性不明显 有文献报道1298基因多态对细胞内叶酸分布的影响明显低于677基因多态, 故 1298基因多态对化疗敏感性的影响同样低于677基因多态，本研究结果亦然。 Vander Put NM, Gab reels F, Stevens EM, et al. A