王春来猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的的研制 ppt课件

猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的研制 王春来 细菌动物病创新团队 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪病论坛 深圳 2014.04.29 概 述 病 原 菌：胸膜肺炎放线杆菌（APP） 疾病特征：肺脏出血、坏死以及与胸膜 发生纤维素性粘连 危 害：世界范围内的多发病、常见病 规模化猪场猪呼吸系统综合征 （PRDC）的主要病原之一 急性爆发：致死率可高达100 慢性感染：高发病率，患猪表现为生长迟 滞、饲料利用率低、日增重明显 下降等，可谓损失巨大。 APP 包括15个血清型，各个血清型间毒力差 异较大，但引起的疾病症状相同。 主要毒力因子： Apx毒素（ Apx、Apx、Apx 和Apx ） 荚膜多糖（CP） 脂多糖内毒素（LPS） 外膜蛋白（OMP） 转铁蛋白结合蛋白（Tbp） 粘附素（Adhesin） 蛋白酶（Protease） 铁摄取调控因子（Fur） 我国APP疫苗研究进展 灭活苗 (全菌体通过加热或用甲醛灭活后制备的一种疫苗) 血清1、2、7型三价苗（武汉科前） 血清1、3、7型三价苗（中农威特） 血清1、7二价苗（山东华宏） 亚单位疫苗（APP主要毒力因子及保护性抗原为主要组分的疫苗） 保猪利爱普克（ Porcilis APPR , Intervet）（Apx Apx Apx OMP ） 哈尔滨兽医研究所 （目前处于临床前研究阶段） 弱毒活疫苗 （人工缺失或灭活某一种或几种毒力因子致弱的活疫苗） 华中农业大学 （APP1apxICapxIICORF1，注册新兽药证书） 哈尔滨兽医研究所（APP7clpPapxIICfur，申报转基因安全评价） Ghost（菌影）疫苗 （细菌裂解后剩下的空壳制备的一种疫苗） 哈尔滨兽医研究所 目前处于临床前研究阶段 疫 苗 优 点 缺 点 灭活苗 安全，易于生产同型保护，交叉保护性 差，只能减少死亡率， 不能阻止感染和发病 亚单位疫苗 包含毒素等分泌性成分 ，交叉保护性好 生产过程繁琐，成本高 弱毒活疫苗 免疫原性及交叉保护性 好，能够阻止APP在呼 吸道定居 安全性差，有返祖的可 能，因为APP毒力因子 众多，只缺失一个或几 个毒力因子尚不能使毒 力减弱到安全使用的水 平，所以目前尚无一种 活疫苗被批准上市 Ghost（菌影） 疫苗 兼具灭活苗的安全性和 活苗的有效性，能够阻 止APP在呼吸道定居 未知 猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗的研制 Ghost（菌影）简介 n近年来出现的一种新概念、新技术 n一种没有细胞浆和核酸的空细菌体 n利用噬菌体X174 裂解基因E 在革兰氏阴性细菌 中表达后，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁 上可形成穿膜孔道，在渗透压的作用下使菌体破 裂，细菌内细胞浆和核酸等成分通过此孔道被排 出，形成的一种空的细菌外壳，即为“菌影”，也 称“菌蜕”。 Ebensen et al., J Immunol, 2004Witte et al., J Bacteriol, 1990 扫描电镜 透射电镜 Ghost 制作流程示意图 电转化电转化 诱导表达诱导表达 宿主菌宿主菌 GhostGhost 提取X174X174 DNA PCRPCR Lysis ELysis E 插入插入pBV-220pBV-220中中 pBV-EpBV-E PCRPCR 插入插入 穿梭载体中穿梭载体中 pXXX-E pXXX-E 28 42 目前，国外已经成功制备成菌影的细菌包括大肠杆菌、鼠 伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败 血博特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆 菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓杆 菌、恶臭假单胞菌等。说明只要具备合适的遗传操作系统，基 于噬菌体裂解基因的裂解系统几乎适用于所有的革兰氏阴性 细菌。目前我们实验室已成功制备了胸膜肺炎放线杆菌和副猪 嗜血杆菌的菌影。 Ghost疫苗的优点 是一种基因工程死苗，不含任何核酸成分，安全； 由于ghost疫苗利用的是基因工程方法使菌体裂解灭活， 没有经过物理或化学的变性过程（如甲醛灭活处理），所 以菌体表面构象与活菌相似，提呈的是天然抗原决定簇， 免疫原性好； 可以激发特异的体液免疫和细胞免疫应答；交叉保护能力 优于灭活苗； 优良的佐剂效应，菌影细胞表面含有脂多糖和肽聚糖，具 有佐剂作用；诱导的免疫反应水平达到或超过福氏完全佐 剂； 生产工艺简单，不需添加佐剂，可冻干保存，不需冷链条 件运输和保存。 App及菌影透射电镜照片 正常APP细菌APP 菌影 重组菌株APP1（pGZRS-E） 正常APP细菌 APP 菌影 App及菌影扫描电镜照片 批次接种剂量（ CFU） 猪数猪体反应体温 体重 1X109 5精神、食欲正常 正常 正常 100606 1X1010 5精神、食欲正常 正常 正常 1X1011 5精神、食欲正常一过性升高 正常 1X109 5精神、食欲正常 正常 正常 100612 1X1010 5精神、食欲正常 正常 正常 1X1011 5精神、食欲正常一过性升高 正常 正常剂量及大剂量免疫情况 App ghost对断奶仔猪的安全性试验 App ghost不同剂量免疫对仔猪体温的影响 App ghost不同剂量免疫对仔猪体重的影响 App ghost对怀孕母猪的安全性试验 批次 接种剂量（CFU ） 猪数猪体反应体温 100606 1x1093精神、食欲、产仔正常正常 1x10103精神、食欲、产仔正常正常 100612 1x1093精神、食欲、产仔正常正常 1x10103精神、食欲、产仔正常正常 正常剂量及大剂量免疫情况 App ghost不同剂量免疫对怀孕母猪体温的影响 App ghost免疫效力试验 45头4-6周健康断奶仔猪 App ghost（BGs, 15头）灭活苗（IB, 15头） PBS 对照组（PC, 15头） 免疫2次，间隔2周，1ml/头（ 510 9 CFU/ml ） 2免后14天用App 1、5、7型气管攻毒，5头/组/型，1ml/头，1x107-8CFU/ml 0、7、14、21、 28、35天分别采血 攻毒后死亡猪剖杀，14天存活猪 采血、剖杀 脏器细菌载量 病理组织学观察 数据分析 * * * * * * * * * * * 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差异极显著（P0.01）； * * *与对照比相比 差异极显著（P0.001）； 与灭活苗组相比差异显著（P0.05） ； 与灭活苗组相比差异极显著 （P0.01） IgG 免疫后抗体动态变化 攻毒 细胞因子产生情况 IFN- * * * * * * * 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差异极显著（P0.01）； * * *与对照比相比 差异极显著（P0.001）； 与灭活苗组相比差异显著（P0.05） ； 与灭活苗组相比差异极显著 （P0.01） * * * * * * IL-4 攻毒 攻毒 * 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差异极显著（P0.01）； 与灭活苗组相比差 异显著（P0.05） * * * * * T淋巴细胞亚类 攻毒 攻毒 攻毒保护情况APP1攻毒 组别 临床症状 发病数 死亡数 保护率 肺损伤 App ghost （BGs） 呼吸正常或呼 吸率增加 1 0 80% （1/5） 灭活苗 （IB） 体温升高，咳 嗽 2 0 60%（3/5） 对照组 （PC） 体温升高，咳 嗽，呼吸困难 5 4 0%(5/5) ：125%肺损伤； ：2650%肺损伤； ：5175%肺损伤；：76100损伤 攻毒保护情况APP5攻毒 组别 临床症状 发病数 死亡数 保护率 肺损伤 App ghost （BGs） 呼吸率增加 ， 体温升高 2 0 60% （3/5） 灭活苗 （IB） 体温升高，咳 嗽，呼吸困难 4 1 20%（1/5） 对照组 （PC） 体温升高，咳 嗽，呼吸困难 5 5 0%(5/5) ：125%肺损伤； ：2650%肺损伤； ：5175%肺损伤；：76100损伤 攻毒保护情况APP7攻毒 ：125%肺损伤； ：2650%肺损伤； ：5175%肺损伤；：76100损伤 组别 临床症状 发病数 死亡数 保护率 肺损伤 App ghost （BGs） 呼吸正常或呼 吸率增加 2 0 60% （3/5） 灭活苗 （IB） 体温升高，咳 嗽，呼吸困难 3 1 40%（2/5） 对照组 （PC） 体温升高，咳 嗽，呼吸困难 5 3 0%(5/5) 临床病理变化 App ghost免疫组 灭活苗免疫组 对照组 肺脏组织病理变化 App ghost免疫组 灭活苗免疫组 对照组 肺脏免疫荧光检测 对照组 灭活苗免疫组 App ghost免疫组 hilar lymph nodeLungSpleen * * * * * * * 与对照比相比差异显著（P0.05）；* *与对照比相比差异极显著（P0.01）； 与灭活苗组相比差 异显著（P0.05） 脏器细菌载量 小结 n猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗安全性好，接种后无 任何不良反应。 n猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗通过肌肉注射免疫猪 后，可刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫，对 App强毒菌的攻击可产生良好保护，明显优于灭活苗免 疫组和对照组。 n猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗已与动物用生物制品 国家工程研究中心（哈尔滨）达成了合作开发的意向 n很多生物制品企业对猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗 感兴趣，并初步达成了成果转化的意向。 副猪嗜血杆菌病ghost疫苗的研制 正常Hps Hps ghost Hps及菌影透射电镜照片 试验进展 n基本完成了实验室研究工作，正在进行转基因安全评价 ，已完成中间试验。结果表明，Hps ghost疫苗对靶动 物猪是安全的，已申报环境释放并获得批文； n初步动物免疫试验结果表明， Hps ghost疫苗具有良好 的免疫效力，能够保护猪抵抗Hps强毒菌的攻击，保护 效力要优于灭活疫苗。 申请和获得的专利 n重排噬菌体溶菌基因及其打孔载体和在制备疫苗中的应 用(ZL 2009 1 0018379.5） n增强噬菌体溶菌基因打孔效率的DNA序列及其应用（ZL 2009 1 0018380.8） n突变的噬菌体裂解基因E、含有该裂解基因的裂解质粒 载体和在制备菌影疫苗中的应用（申请号： 201310409238.5） n一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应 用（申请号：201310409237.0） 获得的转基因安全证书及安全评价 n表达溶解基因E和温敏调控基因cIts85