白血病淋巴瘤免疫分型_1课件

白血病/淋巴瘤免疫分型 苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所 卫生部 血栓与止血重点实验室 朱明清 2010年8 月 杭州 1 流式细胞术的基本概念 =流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对 特定群体加以分选 =研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等 =研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并 加以定量 2 散射光信号和荧光信号 =前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射激光的前向散射光信号 细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性 =荧光素与特异抗体结合，荧光抗体与细胞 抗原结合越多，产生的荧光信号越强。 3 CD45/SS示意图 4 实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正 ） 阳性对照：检测阴性时 5 空白对照和阴性对照的比较 ： 6 CD3 CD8 需要用多少的标志来确证感兴趣的细 胞群? 它们在细胞上的分布是不是很近? 它们是否在不同的细胞上表达不同? 他们表达强还是弱? 抗原表达 CD3 CD4 CD3 CD8 7 抗原分布 表面,胞浆,核内 是共同检测还是分别检测? 表面表面胞浆胞浆核内核内 CD3, CD4, CD8, tetramercytokinesDNA CD3,4,8, tetramer + Cytokines CD3,4,8, tetramer + DNA Cytokines + DNA CD3,4,8, tetramer + Cytokines + DNA 8 设门 08-03307 9 设门 全部 细胞门内细胞 08-03307 10 11 12 血液肿瘤分类进程 13 目前最完善的血液肿瘤免疫分型文献 14 白血病免疫分型的理论基础 白血病/淋巴瘤免疫分型采用的抗原标 志是表达于正常造血细胞不同分化发育阶 段的分化抗原。虽然是恶性肿瘤细胞，但 仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而 仍可依据其抗原的表达谱对白血病/淋巴瘤 进行免疫分型。为了正确分析白血病/淋巴 瘤细胞，必须对正常造血细胞分化抗原的 表达模式有充分的了解。只有熟悉正常细 胞的抗原表达模式，才能辨认白血病/淋巴 瘤细胞的存在。 15 细胞类型鉴定 Borowitz et al (1993) AJCP 100:534-40. Steltzer et al (1993) Ann NY Acad Sci 667:265-280 16 CD45/SS示意图 正常骨髓细胞 血液肿瘤细胞 老化粒细胞 、噬酸细胞 早幼成熟粒细胞 M3、CML 单核细胞 M4、M5 LGL 淋巴细胞 CLL、ALL、CLD 正常前体细胞 M0、M1、M2、 嗜碱性粒细胞 M4、M5、ALL 成熟红细胞、血小板 M6、M7、MM 细胞碎片 Pre-B-ALL 非血液来源细胞 17 B淋巴细胞分化与抗原表达关系图 Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine 18 T淋巴细胞分化与抗原表达关系图 Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine 19 粒细胞分化与抗原表达关系图 Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine 20 单核细胞分化与抗原表达关系图 Wood and Borowitz (2006) Henrys Laboratory Medicine 21 非肿瘤T淋巴 细胞表型 22 非肿瘤B淋巴 细胞表型 23 非肿瘤粒细胞、 单核细胞表型 24 非肿瘤粒细胞、 单核细胞表型 25 白血病免疫分型 根据白血病细胞表达的系列相关抗原， 确定其系列来源。如：淋系T/B、粒单系 、红系、巨核系等。 根据白血病细胞表达的系列分化其相关 抗原进一步分型。如：早前B，前B，普 通B 26 EGIL，1998年白血病积分系统 分值 B系 T系 髓系 2 CD79a CD3 MPO (cyt)CD22 TCR/ (cyt)IgM TCR/ 1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD65 0.5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64 *当髓系和一个淋系积分均2分时，则诊断为急性混合细胞型白 血病。 27 急性白血病的四大免疫类型 单表型急性白血病 表达某一个系列抗原为主的急性白血病 双表型/双克隆急性白血病 未分化型急性白血病 28 初治急白分型 Acute Leukemia Blasts Present 20% Myeloid Lineage CD13+ and/orCD117+ and/orCD33+CD7+ and/orCD2+CD19+ T-LineageB-Lineage Myeloid, no or minimal maturation CD34+/- CD117+/- HLADR+ CD56+ CD15-/+ CD11b-, CD14- Promyeloid CD15+/- CD117+/- CD34- HLADR- CD11b-, CD14- CD14+ CD4+/- HLADR+ CD15+ CD11b+ Myelomonocytic 17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。 50 淋巴瘤免疫分型 非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)是淋巴系统 的一类具有组织和生物学异质性的恶性克隆性疾病。世界卫 生组织（WHO）结合形态学、免疫表型、基因分型、正常细 胞组成及临床行为，新修订了欧美淋巴瘤分类系统（REAL 分类）对淋巴系统肿瘤的分类。这种分类方法在观察者的组 内及组间的重复率为85-95%。WHO淋巴瘤分类是建立在疾病 病理形态、免疫表型、遗传学特征、临床特点的综合资料基 础上：病理形态是分类的基础，大多数淋巴瘤仅靠病理形态 就能做出明确诊断；免疫表型和遗传学特征是确定每一淋巴 瘤的重要指标，是达成共识的客观依据，有助于提高诊断的 可重复性，具有鉴别诊断和预后判断的辅助作用，但在淋巴 瘤诊断中并非必不可少；临床特点，特别是肿瘤原发部位， 如节内或节外（皮肤、中枢神经、胃肠、纵膈、鼻腔），是 确定某些淋巴瘤的重要指标。虽然定义淋巴瘤是综合考虑的 结果，但在具体确定一种淋巴瘤时其侧重点有所不同。 51 淋巴瘤病理分类的演进 形态学（Kiel分期） 形态学加临床特点(IWF) 形态学、免疫表型、遗传特点和临床特点 (REAL WHO分类） 52 WHO认为，淋巴细胞性白血病和淋巴瘤为同 一种疾病：传统上淋巴瘤和白血病是两种不同的 疾病，现在从形态、免疫和遗传学来看，淋巴瘤 和白血病是同一疾病的不同时相（瘤体期或弥散 期/循环期），将它们分开纯粹是人为的。淋巴瘤 的临床行为决定了临床工作中的治疗策略，WHO分 类系统更多的采用与生物学特点相关的淋巴瘤诊 断和分类方法，基于淋巴瘤的免疫和分子生物学 特点的治疗方法也不断涌现，这些在将来会大大 提高针对淋巴瘤的不同特点进行的治疗。 53 淋巴瘤免疫分型意义 淋巴瘤免疫分型可以区分反应性与瘤性细胞： 活检、细针穿刺与体液标本均可；确定肿瘤细胞的 系列：T、B、组织细胞、髓系、非造血系。分类中 根据免疫表型和DNA含量，可确定低、中、高度恶 性程度。区别不同类型肿瘤细胞：伯基特细胞，淋 巴母细胞，滤泡型细胞（小细胞混合和/或大细胞 ），小淋巴细胞，套细胞，弥散小细胞或大细胞， 免疫母细胞。确定淋巴瘤的分期：检测有否血液、 骨髓和体液的累及。疾病监测：微小残留病的监测 ，判断疗效（血液、骨髓、细针穿刺标本），确定 瘤细胞表型变化，监测Retuximab(抗CD20)治疗前 后的CD20定量变化，自体干细胞移植中干细胞收获 时的瘤细胞检测等等. 54 淋系肿瘤WHO分类 55 淋巴瘤诊断的必查项目 根据淋巴结或骨髓活检进行诊断,至少需要对 一个肿瘤组织的石蜡块的所有切片进行血液 病理学检查.如果认为样本组织不能确诊,则 需要重新活检。 肿块细针穿刺（FNA）不宜作为淋巴瘤初始诊 断的依据。但是在某些情况下，FNA结合细胞 形态学和流式细胞学检查也可以为诊断提供 足够的信息，特别是在诊断CLL时。 某些情况下还需要进行免疫组化、分子/细胞 遗传学检查。 56 流式细胞术检测到的成熟淋巴细胞常见异常表型 淋巴细胞某一亚群的扩增 异常抗原表达高/低/缺失/异常共表达 细胞形态增大 57 淋巴细胞 正常淋巴细胞 淋巴细胞增殖性疾病（克隆扩增） 58 B B 细细胞可隆性的确定是通胞可隆性的确定是通过检测证实过检测证实 所以所以B B 细细胞胞仅仅表达一种表达一种轻链轻链 或重或重链链: : Light chains: “kappa” or “lambda”Light chains: “kappa” or “lambda” Heavy chains: Heavy chains: IgGIgG, , IgAIgA, , IgMIgM 59 B B细胞的不同克隆性表达细胞的不同克隆性表达 Normal: Normal: k 50; k 50; 39 39 k 2; k 2; 98 + 98 + k 3; k 3; 93 + 93 + k 86 k 86 ; ; 1 1 k 1; k 1; 99 99 k 5; k 5; 84 + 84 + k 99+; k 99+; 1 1 K99+K99+ ; ; 1 1 60 慢性淋巴细胞增殖性疾病 （Chronic Lymphoproliferative Disease） CLL来源于B细胞，具有免疫球蛋白重链 或轻链基因重排，CLL细胞主要为较正常 淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。免疫分型主 要为：SIgM、SIgD弱表达，B系抗原为 CD19、CD20、CD23、CD79a与CD5共 表达。而CD38,ZAP-70,Ki67等抗原的表 达与CLL预后有密切关系。CLL与其它某 些淋巴瘤在形态学上相似，但在免疫表型 上却各有特点。 61 慢淋和B淋巴瘤分类 CLL and Non-Hodgkins Lymphoma NK LGL CD2+ CD3+ T-Cell Lineage CD38+ CD2-, CD19 - Plasma Cell Leukemia/ Myeloma B-Cell Lineage CD19+ Clonal Ig CD16+ and/or CD56+ CD2+, CD3- CD5- CD10- CD10+ Follicular Cell Or Burkitts Lymphoma SLVL or Marginal Zone Lymphoma or Hairy Cell Leukemia CD5+ B-CLL or Mantle Cell Lymphoma MCL：t(11;14)；NCCN要求对所有CLL患者检测t(11;14)或CCND1表达 62 ALL/CLL? 63 评估CLD的抗体 First: CD5,CD19,kappa,lamda CD3,CD20,CD23,CD10,CD45 B-cell:CD22,FMC7,CD11c,CD103 CD38,CD25,CD79b,heavychain (约12-15Ab) T-cell:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56 CD16, TCR/，TCR/ 特殊用途: CD30,bcl-2,TdT CD1a,CD34,CD71 Total:约12-16个b 64 B-CLL与类似淋巴瘤的免疫表型 Antigen B-CLL HCL Mantle Cell Lymphoma SLVL Follocular Lymphoma SIg +/- + + + + CD5 + + CD19 + + + + + CD20 + + + + CD22 +/- + + + + CD23 + CD79b +/- + + + + FMC-7 + + + CD10 + CD103 + CD25 + + _ +/- CD11c +/- + +/- Antigen：抗原；SIg：膜免疫球蛋白；B-CLL：B慢淋；HCL：毛细胞型白 血病；Mantle Cell Lymphoma：套状淋巴瘤：SLVL：绒毛样脾淋巴瘤 ：Follocular Lymphoma：滤泡型淋巴瘤 65 滤泡中心B细胞 淋巴瘤 增殖 66 慢性B淋巴细胞白血病（B-CLL）积分系统 MarkerScore Points 10 CD5PositiveNegative CD23PositiveNegative FMC7NegativePositive SmIgWeakStrong CD22/CD79b WeakStrong B-CLL：3-5分；非B-CLL：0-2分 67 ALL/CLL？-MZL 68 CLL 69 CLL 70 MCL 71 HCL 72 HCL 73 FL 74 FL 75 DLBCL 76 DLBCL 77 CLL and Non-Hodgkins Lymphoma NK LGL CD2+ CD3+ T-Cell Lineage CD38+ CD2-, CD19- Plasma Cell Leukemia/ Myeloma B-Cell Lineage CD19+ Clonal Ig CD16+ and/or CD56+ CD2+, CD3- CD4+ T-Cell CLL T-Cell Lymphoma T-PLL ATLL (Adult T-Cell Leukemia) T-Cell LGLL CD8+ CD7- Sezary Syndrome 慢淋和T淋巴瘤分类 78 T-CLL与类似淋巴瘤的免疫表型 Antigen T-CLL ATLL T-PLL T-LGL (CD3+) NK- LGL(CD3-) TdT CD1 CD2 + + + + + CD3 + + + + CD5 + + + + CD7 +/- +/- +s + + CD16 +/- + CD56 +/- + CD57 + + CD4+CD8+ +/- +/- CD4-CD8+ +/- + +/- CD4+CD8- + + + CD25 +/- +s +/- +/- NR HLADR +/- +/- + + 79 80 T-PLL 81 T-PLL 82 T细胞克隆（TCR V分析） 83 单克隆T细胞 84 85 86 87 NK- 淋巴瘤 88 NK-