薄层色谱分离菠菜叶中的色素一实验目的课件

薄层色谱分离菠菜叶中的色素 一、实验目的 l l 1.1.学习色谱法的原理和方法。学习色谱法的原理和方法。 l l 2.2.学习薄层色谱法进行定性分析的原理。学习薄层色谱法进行定性分析的原理。 l l 3.3.学习并掌握薄层色谱法的操作技术。学习并掌握薄层色谱法的操作技术。 l l 4. 4. 练习植物中色素提取的基本思路和方法。练习植物中色素提取的基本思路和方法。 二、实验原理 l色谱法最初是由俄国植物学家茨维特在1906研究用碳酸钙 在玻璃柱中分离植物色素时发现，色谱法（ Chromatography)因之得名。色谱法发展到今天，已有柱 色谱、薄层色谱、纸色谱、液相色谱、气相色谱等多种形 式。 l色谱法又称层析法、色层法，是分离、提纯和鉴别有机化 合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各 组分在某一物质中的吸附或溶解性能 (即分配)的不同，使 混合物的各组分流经该种物质，进行反复的吸附或分配等 作用，从而将各组分分开。 l这一方法在化学化工、生物学、医学中得到了普遍应用。 三、实验用品 l 1.仪器：展开缸 、分液漏斗、 研钵、玻璃板 (3cm1Ocm)、锥形瓶(50mL)、量筒 (10mL) 、点样用毛细管，烧杯（100mL） l 2.试剂：硅胶G、石油醚 (60-90)、饱和 NaCl溶液、C2H5OH、C6H6、CH3COCH3、 无水Na2SO4 四、实验步骤 l 1.薄层板的制备 (1)制备薄层载片 将玻璃板要用洗衣粉和水洗涤，再用水 淋洗，然后用50%甲醇溶液淋洗，让片完全 干燥，取用时应让手指接触玻璃片的边缘， 因为指印沾污片的表面上将使吸附剂难于铺 在片上。 (2)制备浆料 不同吸附剂所用溶剂量有所不同： 一般1g硅胶G需要0.5%CMC清液3- 4mL或约3mL氯仿或水；1g氧化铝需 要0.5%CMC清液约2mL； 本实验用蒸馏水为溶剂 要求：制成的浆料要求要均匀，不带团块 ，粘稠适当。 方法： 应将吸附剂慢慢地加至溶剂中，边加边 搅拌，最好用广口瓶，旋紧盖子，将瓶剧烈 摇动，保证充分混和； 或用磁力搅拌器搅拌； 或用匀浆机匀浆； 或用研钵研匀 (3)铺板 要求：薄层板制备的好坏是薄层色谱法成败的关键，为 此，薄层必须尽量均匀且厚度 (0.25-1mm)要固定。 方法： 平铺法倾注法浸涂法 固化: 将铺好的薄层板放在己 校正平面的平板上晾干。 活化： 将干透的薄层板置于烘箱中 加热活化。活化时需慢慢升温，硅 胶在约110左右活化30-60分钟可 得-级活性的薄层板。 l2.配制展开剂 将 苯:丙酮:石油醚按2 : 1 : 2V/V混合共 20mL倒入干净且干燥的层析缸中，盖好盖子 ，备用。一般展开剂要配好后饱和15-30min 后才可使用。 四、实验步骤 3. 叶绿素的提取 在研钵中放人几片 （约 5g）菠菜叶 (新鲜的或冷冻 的都可以，如果是冷冻的。 解冻后包在纸中轻压吸去水 分)，加入1OmL2:1的石油 醚和乙醇混合液，适当研磨 (不要研成糊状，否则会给 分离造成困难)。 将提取液用滴管转移至小分液 漏斗中，加入10mL饱和NaCl溶液 (防止生成乳浊液)除去水溶性物质 ，分去水层； 再用蒸馏水洗涤两次； 将有机层转入干燥的小锥形瓶 中，加2g无水Na2SO4干燥； 干燥后的液体倾至另一锥形瓶 中。 四、实验步骤 4.点样 在距薄层一端8-10mm处，划一条线，做为起点线。 用毛细管 (内径小于1mm)吸取样品溶液垂直地轻轻接触到 薄层的起点线上。如溶液太稀，一次点样不够，第一次点样干 后，再点第二次，第三次。多次点样时，每次点样都应点在同 一圆心上，点的次数依样品溶液浓度而定，一般为2-5次，若样 品量太少时，有的成分不易显出；若量太多时易造成斑点过大 ，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。 点样后的斑点直径一般为1-2mm为圆点。若为多处点样 时，则点样间距为1-1.5cm。 5.展开 当展开剂上升到薄层的前沿 (离顶 端5-10mm)或各组分已明显分开时， 取出薄层板用铅笔或小针划出前沿的 位置即终点线，放平晾干，之后即显 色，如果为无色物质，需喷显色剂显 色。 薄层的展开需 在密闭的容器中进 行。 将点好样的 薄层板放人色谱器 中进行展开。 点 样的位置必须在展 开剂液面之上 起 点 线 6.计算比移值 显显色后，记记下各斑点 中心位置，通常用比移值值Rf 表示物质质移动动的相对对距离 。 影响Rf值的因素： 分析方法（薄层色谱、纸色谱 ）；固定相的种类，流动相的种类（ 展开剂）；温度；物质的分子结构等