叶俏血浆循环dna在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮中的意义课件

血浆循环DNA在原发性干燥综合 征和系统性红斑狼疮中的意义 嘉兴市第二医院 风湿免疫科 叶俏 背景 血浆循环DNA，它具有DNA双螺旋结构， 与基因组的DNA核苷酸及碱基组成上基本 一致，能代表生物学特性，在肿瘤上研究 很多，在免疫性疾病中报道不多，尤其在 干燥综合症中报道甚少。 测定pSS、SLE血浆cDNA浓度值，旨在探 讨cDNA在pSS及SLE中的意义。 对象和方法 pSS患者 36例均符合2002年干燥综合征国际分类 标准 SLE患者（排除继发干燥综合征患者）共29例， 诊断符合美国风湿病学会（ACR）1982推荐的 SLE分类标准 健康体检者30例 排除感染、肝炎、结核、创伤、应激、严重的心 血管及脑血管疾病急性期等可致cDNA升高的因 素。 主要试剂和仪器 微量样品DNA提取试剂盒（购自天根生化 科技有限公司） LightCycler 480(Roche Diagnostics)实 时定量仪 日立7060/70C70型生化仪（日本）。 观察指标 血浆cDNA 血沉（ESR)，C-反应蛋白（CRP），免疫 球蛋白（IgA、IgG、IgM) SLEDAI，SSDAI，SSDDI 标本采集 取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中 ，离心完 全去除血细胞成分置干燥洁净冻存管中， -70C低温冰箱保存备检，统一检测 。 血清DNA的扩增 PCR扩增管家基因GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢 酶） genbank：NM_001256799.1 引物序列：Primer Forward：5- CTGGGCTACACTGAGCACC-3，Primer Reverse：5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG- 3 ，PCR产物长度186dp 血清DNA的扩增 扩增反应采用三步法PCR扩增标准程序： 50 循环数， 第一步-预变性：95 30秒 ， 第二步-PCR反应：（50个循环） 95 5秒 ， 55 30秒，72 30秒 。 标准品的制备 利用正常人血浆提取质粒，并检测质粒OD（吸光 度）值，通过所得OD值计算核酸质量，利用跨内 含子的基因GADPH的引物扩增样品，测得样品血 清中核酸的具体含量，并对质粒进行10倍的梯度 稀释，得到浓度相差10倍的一系列标准品备用 标准品的制备 利用各标准品扩增所得CT值与相应标准品 浓度，得到样品模板量计算公式为：X=（Y -28.69235）/-3.62966（Y：Ct值，X：模 板量），根据这个公式计算标本循环DNA 含量 统计学处理 采用SPSS18.0 软件对资料进行统计学分析，定 性资料的比较采用2检验，定量资料表示, 各组间 比较采用单因素方差分析，相关分析定量资料采 用Pearson相关分析；等级资料采用Spearman 相关分析，P0.05表示差异有统计学意义 。 结 果 0 100 200 300 400 500 600 700 800 SS SLE NORMAL 3组血浆循环DNA统计所得结果柱状图见图（纵坐标单位为ng/ml ） 各组间cDNA值比较 组别 浓度值 pSS组(n=36) 368.24196.68ab SLE组(n=29) 244.51164.10b 对照组（n=30） 24.5616.76 注：3组两两比较：与SLE组比较aP0.05;与对照组比较bP0.05 表1 3组循环DNA浓度值(ng/ml)比较 pSS组各指标间的相关性分析 cDNA SSDAI SSDDI ESR CRPIgAIgG IgM 浓度值 0.551* 0.198-0.089-0.252-0.2460.333*-0.086 (0.01) (0.248) (0.605) (0.137 ) (0.148) (0.047) (0.617) 表2 循环DNA浓度值与SSDAI,SSDDI等指标的相关性分析(r, n=36) 注：表内为相关系数r, 括号内为P值, *P0.05, *P0.01。 pSS组cDNA与SSDAI相关性分析 pSS组cDNA与IgG相关性分析 SLE组各指标间的相关性分析 cDNA浓度值与SLEDAI、ESR、CRP、免 疫球蛋白等指标无相关性 . 讨 论 循环DNA，又称为游离DNA，正常人血浆血清 中存在微量游离DNA，来源于各条染色体的片段 数与该染色体的大小有关 ，片段中内含子、外显 子、插入序列的比例与全基因组构成比相似，因 此循环DNA与疾病密切相关。 Suzuki N，Kamataki A，Yamaki J，el a1Characterization of circulating DNA in healthy human plasmaJClin Chim Acta，2008，387;55- 58 讨论 在pSS, SLE中循环DNA的升高,与对照组比均有 显著差异（P0.05）循环DNA的升高的原因： 1：可能与细胞的凋亡坏死、活性细胞的产生、 DNA片段的产生及清除不平衡等有关。在鼠的模 型中，细胞的凋亡和坏死已经被证实是血液循环 DNA产生的主要机制。 Pisetsky DS,Jiang N.The generation of extra cellular DNA in SLE:the role of death and sexJ.Scand J Immunol ,2006;64:200-204 讨论 2：在自身免疫性疾病活动中，T细胞和或B细胞自 主的克隆，B细胞的自动反应、T细胞的克隆和巨 噬细胞产生自身免疫性抗体、大量可溶性炎性分 子及细胞表面的蛋白质，这些物质能引起病理生 理的紊乱，产生高选择性的DNA，类似于在肿瘤 中产生的机理。 讨论 3：在死亡细胞的清除过程中产生了DNA，而 补体系统能够加速死亡细胞的清除，因此 有人认为在SLE患者中，对死亡细胞的自身 免疫应答的产生及补体的消耗也是造成循 环DNA升高的一种可能的机制。 Pisetsky DS.DNA as a maker of cell death in systemic lupus erythematosusJ.Rheum Dis Clin N Am, 2004;30:575-587. Pisetsky D.The immune response to cell death in SLEJ.Autoimmunity Rev ,2004;3:500-504. 讨论 在3组中，pSS组患者cDNA最高,其原因目 前不是很明确，在pSS患者中细胞的凋亡也 许是形成循环DNA升高的主要因素，是否 有其他途径参与cDNA合成，有待进一步研 究。 E Bartoloni, V Ludovini, A Alunno1,et,al.Increased levels of circulating DNA in patients with systemic autoimmune diseases: A possible marker of disease activity in Sjgrens syndromeJ. Lupus,2011, 20, 928935 . 讨论 结果表明pSS组中cDNA值与疾病活动度（ SSDAI）成正相关性（r=0.551，P