人乳头瘤病毒荧光定量pcr法检测生物学自然科学专业资料课件

人乳头瘤病毒(HPV) 人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属于乳头多瘤空泡 病毒科(papovaviridae)乳头瘤病毒属，是一种可以引起人类黏膜 组织良性及恶性肿瘤的病毒。 人乳头瘤病毒直径为55nm，分子量为54000道尔顿，为对称型的 20面体，是由DNA核心和蛋白衣壳组成的无包膜双链DNA病毒。 由双链DNA （8000个bps）分子的病毒颗粒及包裹其外的衣壳蛋 白组成。 庞大家族：目前有100+种型别HPV，大约 20 种型别与癌症相关 ，根据HPV致癌危险性大小不同，分为高危型和低危型 与宫颈癌相关的高危型HPV有: 16,18,31,33,35,39,45,51,52,(53),56,58,59,68 低危型别有: 6,11,(42,43,44) 人乳头瘤病毒与疾病 低危型HPV主要引起子宫颈良性乳头瘤样变、肛门皮肤和外生 殖器疣类病变； 高危型HPV主要引起宫颈癌、外阴癌、肛门癌等恶性肿瘤 其中HPV16和HPV18是引起宫颈癌的最常见的两种亚型， HPV16与宫颈鳞癌关系最为密切，HPV18易导致宫颈腺癌 妇产科门诊（皮肤科、泌尿外科门诊） 人乳头瘤病毒的传播途径 HPV主要通过直接或间接接触污染物品或性接触传播。 1 性传播途径； 2 密切接触； 3 间接接触：通过接触感染者的衣物、生活用品、用具等； 4 医源性感染：医务人员在治疗护理时防护不好，造成自身感 染或通过医务人员传给患者； 5 母婴传播：婴儿通过孕妇产道的密切接触 人乳头瘤病毒的感染特征 HPV感染多为短暂性的，约有80的女性在其一生中的某个阶 段曾经感染。 通常HPV在感染后的6-12个月内可自行消失，只有少部分为持 续感染。 高危型HPV持续感染是激发宫颈上皮恶性转化的最重要危险因 素，它能使宫颈癌的发生风险提高250倍，是宫颈癌及癌前病 变发生发展的必要条件。 一般从HPV最初感染到癌前病变，最终演变为宫颈浸润癌至少 需要10-15年。 “几乎所有宫颈癌患者的病理样本中均能 找到HPV病毒，从而印证了HPV是宫颈癌的 主要原因，也使宫颈癌成为目前人类所有癌 症病变中唯一个病因明确的癌症。” Jan M. Walboomers教授 预防HPV感染就可以预防宫颈癌，没有 HPV感染就可以不患宫颈癌。 中华医学会妇产科分会主任委员北京协和医院妇产科专家 郎景和教授 宫颈癌的症状 （1）阴道流血 早期多为接触性出血；中晚期为不规则阴道流血。年轻患者也可 表现为经期延长、经量增多；老年患者常为绝经后不规则阴道流 血。 （2）阴道排液 多数患者有阴道排液，液体为白色或血性，可稀薄如水样或米泔 状，或有腥臭。晚期患者因癌组织坏死伴感染，可有大量米汤样 或脓性恶臭白带。 （3）晚期症状 根据癌灶累及范围出现不同的继发性症状。如尿频、尿急、便秘 、下肢肿痛等；癌肿压迫或累及输尿管时，可引起输尿管梗阻、 肾盂积水及尿毒症；晚期可有贫血、恶病质等全身衰竭症状。 HPV感染后，70%的人1年内自行清除，90%的人2年内自行 清除。未清除而持续感染者发展成为CIN2/3等癌前病变。癌前病 变发展到宫颈癌需要810年的时间。早检测早发现HPV病毒感 染，及时治疗，可阻断宫颈癌的发生。 ASC-US：无明确诊断意义的鳞状上皮细胞病变 ASC-H：高级别鳞状上皮内病变 （LSIL：低度鳞状上皮内病变.HSIL：高度鳞状上皮内病变.） CIN：宫颈鳞状上皮的癌前病变，分为CIN1，CIN2，CIN3级别 人乳头瘤病毒的实验室检测 目前宫颈癌筛查的方法多采用宫颈细胞学检查及HPV 病毒检测。 薄层液基细胞学检测技术（Thin-Cytologic Test， TCT） 二代杂交捕获技术(HC2) 实时荧光定量PCR技术 阴道镜活检一组织病理学 通过采集阴道或宫颈分泌物，获得脱落细胞后浸入液基细 胞处理试剂中进行处理，试剂中的裂解成分能对红细胞进行裂 解，去除红细胞对检验结果造成的干扰；同时试剂中的固定成 分能保存固定白细胞、脱落上皮细胞等有价值的细胞；并使包 裹在黏液中的有效细胞充分分离出来，防止有价值细胞的丢失 。将有效细胞制备成细胞悬液，最后通过过滤离心方法清除黏 液对制片的干扰，制成脱落细胞薄片。可用HE染色、巴氏染色 或其他免疫组织化学染色等方法使细胞着色，再通过人工观察 分析来检查阴道或宫颈的细胞形态，诊断子宫颈癌及其癌的前 期变化、人乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒感染。同时还能发现部 分癌前病变，微生物感染如霉菌、滴虫、病毒、衣原体等。 薄层液基细胞学检测技术 (TCT) 5 计算机 判读 15 min后 2 DNA-RNA 杂交 60 min 3 抗体 捕获 60 min 4 化学发光 检测 30 min 1 DNA 分解 45 min 原理: 利用对基因杂交、化学发光、信号放大的原理在分子水平定 性定量检测病毒DNA （1）样本DNA双链被释放并分解为核苷酸单链；（2）DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体；（ 3）特异性抗体(一抗)将RNA-DNA杂交体固定在微孔壁上；（4）结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA -DNA杂交体结合,使化学发光物质信号放大（5）碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸 酶的含量，通过仪器分析从而确定RNA-DNA的含量。 二代杂交捕获技术(HC2) TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对 引物的同时加入一个特 异性的荧光探针，该探 针为一寡核苷酸，两端 分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基 团。探针完整时，报告 基团发射的荧光信号被 淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的外切酶活性将探针酶切降 解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可 接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形 成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 实时荧光定量PCR技术 阴道镜活检一组织病理学视为“金指标” ，但其有创伤性不作 为常规的筛查手段。 细胞涂片检查敏感性一般在55%80%左右，但一旦发现异常 细胞，特异性可达到90%以上。 HPV检测虽敏感性高，但特异性一般只在64%95%之间，这 是由于大多数HPV阳性的病人可自然转阴，并不导致宫颈癌的 发生。 人乳头瘤病毒的实验室检测方法的比较 宫颈癌筛查指南-筛查策略 筛查对象： 三年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女 起始年龄： 经济发达地区：25-30岁 经济欠发达地区：35-40岁 高危人群：起始年龄应相应提前 （高危人群定义为有多个性伴侣、性生活过早、HIV/HPV感染 、免疫功能低下、卫生条件差、性保健知识缺乏的妇女） 终止年龄: 65岁以上危险性极低 筛查间隔 每年一次细胞学筛查，连续2次正常可改至3年 连续2次HPV和细胞学正常可延至5-8年. 随访对象 细胞学低度鳞状上皮内病变(LSIL)、组织学CIN 特殊职业人群、30岁以上高危HPV感染者至少每半年一次 宫颈癌筛查指南-筛查推荐流程 HPV检查前的注意事项 1.检查前48小时内不要做阴道冲洗，不要再阴道 内用药物；检查前不要进行醋酸或碘液涂抹。 2.检查前48小时最好不要进行性生活，月经期间 不宜进行HPV检查。 如何看待HPV检测结果 1.HPV检测结果阴性，表明没有感染HPV，结合细胞 学检测结果为阴性，35年不会发生宫颈癌。 2.HPV检测结果为阳性，表明有HPV感染，若同时细 胞学阴性，则无需临床治疗，但需要随访追踪，不可 忽视。若HPV检测和细胞学同时为阳性，应进一步检 查。 HPV检测的意义 HPV分型： 感染的HPV类型预测受检者HPV阳性的发病风险度，决定其筛 查间隔，预测患病风险； 有效对HPV阳性病人进行很好的随访监控，即可避免对病人进 行过度治疗，