端粒端粒酶与细胞衰老和癌变课件

周俊宜 中山医科大学生化教研室中山医科大学生化教研室 与细胞衰老和癌变与细胞衰老和癌变 七十年代：七十年代：端粒分子组成端粒分子组成确定确定 八十年代：八十年代：端粒酶端粒酶的发现的发现 九十年代：端粒酶与细胞九十年代：端粒酶与细胞衰老和癌症衰老和癌症 三十年代：三十年代：端粒端粒概念首次提出概念首次提出 研究概况研究概况 “端粒和端粒酶的研究历程就象不断伸缩端粒和端粒酶的研究历程就象不断伸缩 的端粒本身变幻无穷，并且不时带给人们某的端粒本身变幻无穷，并且不时带给人们某 些惊讶。从些惊讶。从三十年代端粒概念首次提出三十年代端粒概念首次提出，一，一 直到今天直到今天活跃在恶性细胞中的端粒酶研究热活跃在恶性细胞中的端粒酶研究热 潮的兴起潮的兴起，人们眼中的端粒和端粒酶已不仅，人们眼中的端粒和端粒酶已不仅 仅限于它们所形成的仅限于它们所形成的染色体的染色体的保护帽保护帽， 它还显现出更加意味深长的内涵它还显现出更加意味深长的内涵 ” ” “人体的正常细胞人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进经过有限的分裂次数后即进 入衰老阶段入衰老阶段，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生 长的癌细胞似乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无长的癌细胞似乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无 拘无束地高速生长中获得拘无束地高速生长中获得“永生永生”。衰老和肿瘤相。衰老和肿瘤相 互对立却又同为人类的互对立却又同为人类的“天敌天敌”，两者之间千丝万，两者之间千丝万 缕的关联一直以来为人们所关注。缕的关联一直以来为人们所关注。 近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤 和衰老研究的一条全新纽带和衰老研究的一条全新纽带，国际权威期刊，国际权威期刊CellCell、 ScienceScience等逐年递增地刊载相关论文和报道，对端等逐年递增地刊载相关论文和报道，对端 粒和端粒酶这一研究方向予以相当关注，认为有可粒和端粒酶这一研究方向予以相当关注，认为有可 能对肿瘤、衰老等重大生命课题产生深远影响。能对肿瘤、衰老等重大生命课题产生深远影响。” 主要内容主要内容 端粒的结构与功能端粒的结构与功能 端粒酶的结构与功能端粒酶的结构与功能 端粒、端粒酶与细胞衰老端粒、端粒酶与细胞衰老 端粒、端粒酶与恶性肿瘤端粒、端粒酶与恶性肿瘤 二十世纪三十年代，两位著名的遗传学家二十世纪三十年代，两位著名的遗传学家 Barbava Barbava McClintockMcClintock和和Hermann Hermann J.MullerJ.Muller发现，发现，染染 色体的末端色体的末端有一种能有一种能稳定染色体结构和功能的特殊稳定染色体结构和功能的特殊 成分成分。如果缺少了这种成分，染色体之间就会互相。如果缺少了这种成分，染色体之间就会互相 粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影 响到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞响到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞 的存亡。于是的存亡。于是MullerMuller从希腊文的从希腊文的“ “末端末端“ “（telostelos） 和和“ “部分部分“ “（merosmeros）二词为这种特殊的成分创造了二词为这种特殊的成分创造了 一个全新的术语一个全新的术语“ “端粒端粒“ “（telomeretelomere）。）。 1 1 端粒的发现端粒的发现 断端降解、断端融合、结构功能破坏断端降解、断端融合、结构功能破坏 染色体染色体DNADNA X X射线射线 从希腊字的末端从希腊字的末端“telostelos”和部分和部分“merosmeros”创造了创造了 一个全新的单词：端粒一个全新的单词：端粒 telomeretelomere 端粒帽端粒帽 染色体染色体 端粒帽端粒帽 端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出 。19781978年，美国科学家年，美国科学家BlackburnBlackburn和和Joseph Joseph G. G. GallGall发现，单细胞池塘生物四膜虫（发现，单细胞池塘生物四膜虫（TetrahymenaTetrahymena ）的端粒是由的端粒是由一种极短的简单重复序列一种极短的简单重复序列TTGGGGTTGGGG多次多次 重复重复而成。而成。 从那以后，包括动物、植物和微生物在内的多种从那以后，包括动物、植物和微生物在内的多种 生物的端粒序列已被确定，它们生物的端粒序列已被确定，它们均是由富含均是由富含G G和和T T的的 简单重复序列不断重复而成简单重复序列不断重复而成。正是这些连接在染色。正是这些连接在染色 体末端的核苷酸重复序列和结合在其上的一些蛋白体末端的核苷酸重复序列和结合在其上的一些蛋白 质共同构成了真核生物染色体的质共同构成了真核生物染色体的“末端保护帽末端保护帽” 。 2 2 端粒的精确组成端粒的精确组成 19781978年首次发现四膜虫端粒的分子组成：年首次发现四膜虫端粒的分子组成： 端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒 n n（CCCCAACCCCAA） n n（GGGGTTGGGGTT） 3 3 5 5 （TTGGGGTTGGGG）n n （AACCCCAACCCC）n n n n（CCCCCCT TAAAA） n n（GGGGGGA ATTTT） 3 3 5 5 （TTTTA AGGGGGG）n n （AAAAT TCCCCCC）n n 人人端粒的分子组成端粒的分子组成 ： 端粒末端回折结构端粒末端回折结构 55 33 重复的重复的GGGGTTGGGGTT链链 重复的重复的CCCCAACCCCAA链链 5-5-CCCCAACCCCAAOH OHCCCAACCCCAACCCCAA CCCAACCCCAACCCCAAOH OHCCCAA-3 CCCAA-3 3-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-53-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-5 端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒 1) 1) GTGT链的链的5 35 3总是指向染色体的末端。总是指向染色体的末端。 2) 2) 重复次数不保守。重复次数不保守。 3) 3) 链区内有链区内有缺口缺口即游离的即游离的3-3-端羟基存在。端羟基存在。 4) 4) DNADNA的最末端不能进行末端标记，推测其分子是的最末端不能进行末端标记，推测其分子是 一个一个回折结构回折结构。 端粒结构的特征：端粒结构的特征： n n（CCCTAACCCTAA） n n（GGGATTGGGATT） 3 3 55 （TTAGGGTTAGGG）n n （AATCCCAATCCC）n n 35 DNADNA聚合酶聚合酶 - - 3232P-dNTP P-dNTP 端粒端粒DNADNA 缺口平移缺口平移 5-5-CCCCACCCCAA AOH OHC CCCAACCCCAACCCCA CCAACCCCAACCCCAA AOH OHC CCCAA-3 CCAA-3 3-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-53-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-5 DNADNA聚合酶聚合酶 5 35 3聚合酶聚合酶 5 35 3外切酶外切酶 5 5 5 5-5-CCCCAACCCCCCCAACCC 3-GTTGGG 3-GTTGGG 末端标记物末端标记物 - - 3232P-dNTP P-dNTP 5-5-CCCCAACCCCCCCAACCC 3-3-GGGGGGGTTGGGGTTGGG 端粒帽端粒帽 染色体染色体DNA DNA 端粒帽端粒帽 n n（CCCCAACCCCAA） （TTGGGGTTGGGG）n n n n（GGGGTTGGGGTT） （AACCCCAACCCC）n n 3 3 5 5 3 3 端粒结合蛋白端粒结合蛋白 保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用 一般是紧密的非共价键结合一般是紧密的非共价键结合 人类 纤毛虫类 随着对端粒分子组成结构的阐明，端粒对维随着对端粒分子组成结构的阐明，端粒对维 护染色体完整性的功能已不是一个笼统的概念。护染色体完整性的功能已不是一个笼统的概念。 活跃在细胞中枢并当担着延续生命重任的染色体活跃在细胞中枢并当担着延续生命重任的染色体 DNADNA其实面临的是一个其实面临的是一个“危机四伏危机四伏”的境界，它的境界，它 对外要对外要抵御核酸酶等各种因素袭击抵御核酸酶等各种因素袭击，对内则有一，对内则有一 个难以个难以“自圆其身自圆其身”的所谓的所谓“末端复制问题末端复制问题”。 端粒的存在正是扮演了一个卫士的角色，它就象端粒的存在正是扮演了一个卫士的角色，它就象 是一个尽忠职守的是一个尽忠职守的“生命卫士生命卫士”，不但避免了外，不但避免了外 界因素的入侵，而且在复制过程中，把基因组序界因素的入侵，而且在复制过程中，把基因组序 列包裹在内部，以牺牲自身而避免染色体结构基列包裹在内部，以牺牲自身而避免染色体结构基 因被侵蚀，从而防止了遗传信息的丢失，维护了因被侵蚀，从而防止了遗传信息的丢失，维护了 染色体结构和功能的完整性。染色体结构和功能的完整性。 4 4 端粒的功能端粒的功能 对外对外: : 抵御核酸酶等外界抵御核酸酶等外界 对内对内: : 染色体染色体DNADNA的的 因素的袭击因素的袭击 末端复制问题末端复制问题 保护染色体结构和功能的完整性保护染色体结构和功能的完整性 染色体染色体 染色体染色体DNADNA的末端复制问题的末端复制问题： 3 3 5 5 55 33 RNARNA引物引物 3 3 3 3 RNARNA引物水解引物水解 即即DNADNA复制过程不能复制过程不能“ “自始至终自始至终“ “完整地复制完整地复制 整个线性染色体，而是每次都在其整个线性染色体，而是每次都在其55末端留下一末端留下一 个空缺未能填补（即个空缺未能填补（即RNARNA引物降解），如果细胞引物降解），如果细胞 没有办法添补这些空隙，染色体没有办法添补这些空隙，染色体DNADNA将随着每一将随着每一 次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到 染色体的结构基因而使细胞消亡。染色体的结构基因而使细胞消亡。 33 55 55 33 RNARNA引物水解引物水解 端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒 1)1)纤毛原虫动物纤毛原虫动物 四膜虫：其巨核形成过程中，经历了端粒从无到四膜虫：其巨核形成过程中，经历了端粒从无到 有的发育过程。有的发育过程。 2) 2) 酵母酵母 外源外源DNADNA转化酵母细胞后，在其末端形成新端粒转化酵母细胞后，在其末端形成新端粒 的效率很高。的效率很高。 5 5 端粒的研究体系端粒的研究体系 1 1）早期的原始复制模型）早期的原始复制模型 2 2）端粒酶模型）端粒酶模型 3 3）重组模型）重组模型 6 6 端粒的复制模型端粒的复制模型 酵母细胞酵母细胞 酵母细胞酵母细胞 酵母酵母TSTS四膜虫四膜虫TSTS ShampayShampay的加尾实验的加尾实验 1 1 端粒酶的发现端粒酶的发现 Blackburn Blackburn的实验的实验 加热或加热或 蛋白酶蛋白酶 孵育孵育 四四GTGT 酵酵GTGT pBR322pBR322 四四CACA 孵育孵育 四膜虫抽提物四膜虫抽提物5 5 3 3 1 1）端粒的加尾方向是按）端粒的加尾方向是按GTGT链从链从55端端 3 3端端 。 2 2）每次加一个重复单位。）每次加一个重复单位。 3 3）似为无模板复制。）似为无模板复制。 4 4）被加尾的末端序列具有特异性。）被加尾的末端序列具有特异性。 5 5）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活 性的物质。性的物质。 实验推论：实验推论： 2 2 端粒酶的结构端粒酶的结构 19871987年，年，Blackburn Blackburn 柱层析柱层析 RNPRNP结构结构 四膜虫端粒酶四膜虫端粒酶RNPRNP 含有含有RNARNA组分和蛋白质组分组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必，两者均为酶活性所必 需。对需。对RNARNA酶极为敏感。酶极为敏感。 RNARNA组分组分 ProteinProtein CAACCCCAA CAACCCCAA CAACCCCAACAACCCCAA 端粒酶端粒酶RNARNA 1 1）CAACCCCAACAACCCCAA结构，有碱基修饰。结构，有碱基修饰。 2 2）反义）反义RNARNA封闭，能抑制酶活性。封闭，能抑制酶活性。 反义反义 RNARNA 3 3）GreiderGreider的点突变实验：的点突变实验： 点突变 端粒酶端粒酶 RNARNA序列序列 C A 端粒端粒 端粒酶端粒酶 A A C T T G C G C A T C A A 端粒酶蛋白质端粒酶蛋白质 1995 1995年，年，Collins KCollins K等首次从等首次从四膜虫四膜虫克隆到端克隆到端 粒酶蛋白质组分：粒酶蛋白质组分： p80p80 p95p95 遗传密码遗传密码 碱基互补碱基互补 人类端粒酶蛋白质人类端粒酶蛋白质 ？ 同源序列 核酸探针核酸探针 重组重组DNADNA分子分子 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 5 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG CCAACCCCCCAACCCC 3 5 oH3 5 5 CCAACCCCCCAACCCC 3 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG CCAACCCCCCAACCCC 2.2.聚合聚合 1. 1. 结合结合 3.3.移位移位 爬爬 行行 模模 式式 3 3 端粒酶的功能端粒酶的功能 TTGGGGTTGGGG TTGGGGTTGGGG CCAACCCCCCAACCCC 末端补齐机制： 5 GGGGTTGGGGTT （GGGGTTGGGGTT）n n 端粒酶端粒酶 5 G-G配对回折 35 DNADNA聚合酶聚合酶 4 4 端粒酶活性的测定端粒酶活性的测定 19941994年，年，KimKim首创首创端粒重复扩增法（端粒重复扩增法（TRAPTRAP）。 TRAPTRAP的电泳检测的电泳检测 梯梯 形形 条条 带带 加样孔 TSTS引物引物 CXCX引物引物 细胞提取物细胞提取物 端粒重复序列端粒重复序列 PCRPCR 扩增扩增 产物产物 T4g32,RnasinT4g32,Rnasin TRAP bufferTRAP buffer dNTPsdNTPs extractextract TS primerTS primer Taq ETaq E CX primerCX primer 2325 30 min PCRPCR仪仪 染色体染色体端粒端粒 端粒端粒 端粒与细胞存亡密切相关端粒与细胞存亡密切相关 细胞分裂细胞分裂 细胞分裂细胞分裂 端粒长短与细胞生命历程密切相关端粒长短与细胞生命历程密切相关 染色体染色体 端粒端粒端粒 端粒 细胞将停止分裂而趋于老化细胞将停止分裂而趋于老化 1 1）培养细胞：）培养细胞： 端粒长度随分裂次数增多而缩短。端粒长度随分裂次数增多而缩短。 端粒长度和细胞分化程度呈反比。端粒长度和细胞分化程度呈反比。 2 2）人体：）人体： 端粒平均长度随年龄增大而变短。端粒平均长度随年龄增大而变短。 体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。 相关实验证据相关实验证据 端粒酶与细胞存亡端粒酶与细胞存亡 端粒酶端粒酶 端粒端粒 端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体 复制、细胞分裂导致的复制、细胞分裂导致的DNADNA缩短，使得染色体缩短，使得染色体DNADNA 完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。 相关实验证据相关实验证据 ： 1 1）四膜虫：）四膜虫： 端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡。端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡。 2 2）酵母：）酵母： 端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老。端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老。 正常人体细胞正常人体细胞缺乏端粒酶活性缺乏端粒酶活性。 与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比, ,人体人体 细胞具有很长的端粒。细胞具有很长的端粒。 人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性 。 人的端粒与端粒酶人的端粒与端粒酶 端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒 端粒酶端粒酶 端粒酶端粒酶 胚胚 胎胎 期期 “人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在 胚系细胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶胚系细胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶 活性就被抑制。即在胚胎发育时期获得的端粒，应活性就被抑制。即在胚胎发育时期获得的端粒，应 已足够维系人体的整个生命过程中因细胞分裂所致已足够维系人体的整个生命过程中因细胞分裂所致 的端粒缩短。的端粒缩短。 所以，所以， 当人体出生以后，染色体端粒就象是一当人体出生以后，染色体端粒就象是一 个伴随着细胞分裂繁殖的个伴随着细胞分裂繁殖的“生命之钟生命之钟”，它历数着它历数着 细胞细胞可分裂的次数同时也见证了细胞由旺盛地生长可分裂的次数同时也见证了细胞由旺盛地生长 繁殖到走向衰老死亡的整个生命历程。繁殖到走向衰老死亡的整个生命历程。” 正常细胞：正常细胞： 细胞分裂细胞分裂 细胞分裂细胞分裂 衰衰 老老 死死 亡亡 细胞年轻化细胞年轻化 端粒酶端粒酶 重新引入重新引入 抗 衰 老 细胞分裂细胞分裂 细胞分裂细胞