克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中应用课件

克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用 Clinically Suspicious LN Biopsy Morphology with IHC If necessary, Molecular Dx Cytogenetics/ FISH Evaluation of the Suspicious Lymph Node Carcinoma v. Lymphoma FNA With Flow Cytometry Suspect Lymphoma Carcinoma CLL Suspect Lymphoma, Negative or Non-diagnostic Workup for PrimaryDiagnosis Staging and Treatment FISH Treatment NCCN NHL Lymphoma Guidelines （5-10%） 分子和细胞遗传学异常 抗原受体基因的克隆性重排 与类型相关的染色体异常 l简要原理 l检测方法 l应用和策略 l注意事项 淋巴细胞表面受体 l IG： IGH （14q32) IGL (2q12) (22q11) l TCR: TCR 14q11 TCR 7q32 TCR 7p15 TCR 14q11.2 IG和TCR基因结构及重排过程 胚 系 可变区恒定区 胚系 D-J重排 V-D-J重排 转录与拼接 各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性 IGH IGKIGLTCRATCRBTCRGTCRD V664338464768 D277656546798 J655611354 淋巴细胞发育过程中基因重排顺序 IG: H重排: IgH/ 缺失 ： IgH/ TCR: ：TCR ：TCR 淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排 不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标 克隆性重排的检测方法 Southern 杂交 PCR法 特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段 Southern 杂交 优点： 敏感性较高 可靠性高 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代 PCR法 原理: VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增 出重排片段 新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高， 是目前最常用的克隆性重排的检测方法。 引物的选择原则 l引物位置：PCR产物长度10-15bp l引物本身的长度0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无应用价 值。 必须结合临床病史 Ig和TCR基因重排不一定是谱系的标志： 某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉 T,B之间：不成熟的T或B相对频繁 TCRab, TCRrd之间 前T细胞性白血病/细胞淋巴瘤几乎所有都存在TCR克隆性重排，但大 约20%同时伴有IGH基因重排 前B细胞性白血病/淋巴瘤，非特殊类型均有IGH DJ 区克隆性重排 70% 存在TCR， 重排对谱系鉴定无帮 助 毛细胞白血病共同表达多克隆性IG亚型，认为存在多 点亚型转换阻滞 T细胞大颗粒淋巴细胞白血病TCR，TCR克隆性重排，存在TCR ，TCR交叉 NK细胞慢性淋巴细胞增生异常没有IG和TCR克隆性重排 侵袭性NK细胞白血病没有IG和TCR克隆性重排 结外NK/T 细胞淋巴瘤，鼻型大多IG及TCR无重排，少数因存在反应 性细胞毒性T细胞导致TCR克隆性重排 肝脾T细胞淋巴瘤TCR克隆性重排 来源的存在等位的TCR克隆性重排 来源的一部分存在TCR克隆性重排 ，一部分未产生TCR克隆性重排 蕈样霉菌病部分存在TCR克隆性重排 原发性皮肤CD30+T细胞淋巴增生性 疾病 60%存在TCR克隆性重排，TCR克隆 性重排与淋巴瘤相关 原发皮肤T细胞TCR克隆性重排；TCR克隆性重 排可能存在或缺失，但不表达 血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤75-90%：TCR克隆性重排 25-30%：IG克隆性重排，与EBV+B 细胞相关 间变大细胞淋巴瘤，ALK+90%存在TCR克隆性重排与是否表 达T细胞抗原无关，10%不存在IG和 TCR克隆性重排 间变大细胞淋巴瘤，ALK-多数存在TCR克隆性重排与是否表 达T细胞抗原无关 肠病型T 细胞淋巴瘤（EATL）TCR，TCR克隆性重排在各种形 态学亚型均存在 T细胞幼淋巴细胞白血病TCR、TCR克隆性重排 (1) 少量淋巴细胞 (2) 小标本或高负荷B细胞淋巴瘤中有少量反应性T细胞 (3) EBV或CMV感染 (4) 免疫抑制患者 (5) 淋巴结或外周血中TCR的某些组分重排占优势,重排多样性受限 制,可出现寡克隆信号。 假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带 辨别方法： 多次重复，大小不同的条带 只有那些可重复的相同大小的条带是可信的单克隆性条带 3. 假克隆和寡克隆 4.淋巴瘤重排检出率不是100% 假阴性 原因： （1）早期未完成重排；有些类型淋巴瘤缺乏 基因重排 （2）引物不全 （3）与其他基因重排、突变； （4）体细胞超突变(eg. MCL vs FL) （5）检测敏感性限制 （6）所用检测技术分析技术 （7）不合适的退火温度 解决办法：多组引物组合， 仔细分析 仅用一对引物时 滤泡性淋巴瘤IG重链和轻链重排；由于其可变区存在大量的体细胞突 变，导致单对引物不易扩增出单克隆产物（10-40%）。 多重PCR(BIOMED-2)引物可以检测出90%的IGH(V-D- J)基因重排，用此引物可以检测出100%IGH(D-J)和轻 链基因重排 慢性淋巴细胞性白血病/ 小淋巴细胞性淋巴瘤 40-50%未突变的病例中存在IG基因重排，在未突变的病 例BCR的意义非常重要，常和自身抗体反应相关 幼B淋巴细胞白血病50%：IG未突变的重链克隆性重排。所有病例具有VH3 （68%）和VH4（32%）基因家族 MALT淋巴瘤IG重链，轻链重排以及可变区体细胞突变 结内边缘带淋巴瘤VH3和VH4家族明显突变的IG基因克隆性重排 儿童结内边缘带淋巴瘤IG基因克隆性重排在区别该病和反应性增生作用大 原发皮肤滤泡中心淋巴 瘤 具有体细胞高突变的克隆性IG重排，但有些不能被PCR 检测到 套细胞淋巴瘤IG克隆性重排，可变区基因大多未突变，但15-40%存在 低量的突变。 弥漫性大B细胞淋巴瘤非特殊类型可检测到IG重链和轻链的克隆性重排 可变区存在体细胞高突变 富于T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴 瘤 肿瘤B细胞存在IG克隆性重排，IG存 在体细胞突变和生发中心的细胞一致 。 5假阳性： 技术原因；PCR法影响因素多，严格分区 各种原因所致的假克隆或寡克隆 产物分析区 空气流向 空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间 专用走廊工作流向 扩增区标本制备区试剂准备区 产物分析区 空气流向 空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间 专用走廊工作流向 扩增区标本制备区试剂准备区 设计A 设计B 专门人员：完善技术和内容 专门空间：防止污染 结果分析：注意可能的陷阱，必要时重复 综合判断：结合形态、免疫表型和病史 谢 谢 ! 本文观看结束！ 谢 谢 欣 赏！ 5-Aza-CdR对人食管癌细胞株 生物学行为及TFPI-2 mRNA表 达的影响 5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的 影响 作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣 作者单位：( 郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州 450002) 【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza- CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物 2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取 食管鳞癌细胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。 MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡 率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的 表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果 食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处 理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高 (P0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较 处理前明显提高(P0.05)。结论 食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑 制其mRNA表达，当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋 亡率相应提高。 【关键词】 食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫 组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡 ABSTRACT： Objective To explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza-CdR) intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2 (TFPI-2). Methods Eca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations; MTT， flow cytometry， immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine the cell growth， apoptosis， and the expression of TFPI-2 gene and its protein. Results Eca9706 cell line had hypermethylation of TFPI-2. After demethylation by 5-Aza-CdR treatment， the proliferation of Eca9706 was inhibited， the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner. RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly (P0.05). Conclusion 5-Aza-CdR can slow the growth of Eca9706 cell， increase the apoptosis rate， reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation. KEY WORDS： esophageal carcinoma; tissue factor pathway inhibitor-2; 5 -Aza-CdR; methylation; immunohistochemistry; RT-PCR; apoptosis 组织因子途径移植物2(tissue factor pathway inhibitor， TFPI-2)是丝氨酸蛋 白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2 在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失 活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。 1 材料与方法 1.1 材料 RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天 津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自 MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤 生物学研究室惠赠。 1.2 细胞培养和药物处理 人食管癌细胞Eca9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 、50 mL/L CO2培养箱培养，每23 d消化传代1次。 1.3 MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 取对数生长期细胞，调整密度至5104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓 度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，每组复设5个孔。待细 胞贴壁后，分别于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后弃去上清液，每孔加 DMSO 150 L，在490 nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增 殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate， CPIR)按公式计算：CPIR=(1- 实验组A均值/对照组A均值)100%。 1.4 流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药 ，分组如下：对照组(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR组，25.6 mol/L 5-Aza- CdR组，102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收 集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。 1.5 RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分别 为5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3， 合成产物为440 bp;-actin作为内参照，上下游引物分别为5- AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合 成产物为301 bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外 分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游 产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94 预变性3 min，然后94 变性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循环30次，最后72 延伸5 min,4 保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.6 免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待 细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定 30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动 物血清封闭，室温下10 min，滴加1100的稀释的TFPI-2抗体4 过夜，二 抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 孵育30 min，DAB显色， 苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照 。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。 光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞 所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 000)100%。 1.7 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数标准差(x-s)表 示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准=0.05。 2 结 果 2.1 干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作 用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1 不同浓度的5-aza-CdR对 Eca9706细胞增殖的影响 2.2 干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞 各处理组凋亡率分别为(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%， 与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组(1.390.27)%比较差异有统计学 意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以 上实验重复5次。 2.3 干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在 各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未 见表达。经1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA 表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达 逐渐增强(图2)。图1 各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 mol/L 5 -Aza-CdR组;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR组 。图2 5-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达 M：DNA marker;-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4mol/L组;3： 25.6 mol/L组;4：1.6 mol/L组;5：H2O对照组。,2.4 干预前后TFPI-2蛋 白的表达情况 免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h， TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6 mol/L组、25.6 mol/L组、 102.4 mol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.101.42)%、 (9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同浓度组之间以及用 药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。 图3 各组 TFPI-2蛋白的表达情况 3 讨 论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其 cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没 有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过 80%1。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤 ，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降2。有研究证实，在绒毛膜癌、乳 腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与 肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关 1,3-5。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚 ，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和 转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一6-8。 目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲 基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复 抑癌功能9。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表 达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出 现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。 MIZUNO等10研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高412倍 ，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据 MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受 抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析， DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂 量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转 录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而 通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的 Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加， 并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等11在同等条件 下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细 胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对 Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因 为使TFPI-2重新表达的结果。 目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断 、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的 研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株， 检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤 的新靶点。 【参考文献】 1HUBE F， REBERDIAU P， IOCHMANN S， et al. Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line J. Thromb Res， 203， 109(4)：207-215. 2MIYAGIi Y， KOSHIKAWA N， YASUMITSU H， et al. cDNA cloning and mRNA expression of a serine protein 5 and tissue factor pathway inhibitor-2 J. J Biochem， 1994， 116(5)：939-942. 3RAO CN， SEGAWA T， NAVARI JR， et al. Methylation of TFPI-2 gene is not the sole cause of its silencing J. Int J Oncol， 2003， 22(4)： 843-848. 4KONDURI SD， SRIVENUGOPAL KS， YANAMANDRA N， et al. Promoter methyl and silencing of the tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2) ， a gene encoding an inhibitor of matrix metalloproteinases in human glioma cells J. Oncogene， 2003， 22(29)：4509-416. 5STEINER FA， HONG JA， FISCHETTE MR， et al. Sequential5-Aza-2- deoxycytidi- ne/depsipeptide FK228 treatment induces