生化课件抗原抗体的纯化

第三章 抗原抗体的纯化 免疫教研室 曾瑞红 w 抗原的纯化是制备高效价、高特异性抗 体的先决条件； w 抗体的纯化对提高免疫反应的特异性和 敏感性、定量检测抗原极为重要。 w 根据抗原抗体的来源、研究目的、结构 等的不同，其分离方法也多种多样。 w 第一节 离心分离法 w 第二节 沉淀分离 w 第三节 离子交换层析法 w 第四节 凝胶层析 w 第五节 亲和层析法 w 第六节 电泳 第一节 离心分离法 w 离心分离法是根据物质的沉降系数 、浮力、质量、颗粒大小等方面的差异 ，利用强大的离心力场，使其分离、浓 缩、纯化和鉴定的技术。 一、基本原理 w （一）离心力 F= m2r =mr(2 N/60)2 m:沉降固体颗粒的有效质量(g) r: 离心半径,转子中心轴到沉降颗粒之间的距离; N：离心机每分钟的转数 w 沉降系数 单位离心力作用下的沉降速度为沉降系数(s)。 s乘1013定义为一个沉降系数单位（S），常用S表示 生物大分子的大小，如：RNA 5S,18S. 离心机 w 离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成 。 w 转头可分为：水平转头,角度转头，垂直转头。 二、离心方法的类型 w （一）差速离心 采用不同的离心速度和离心时间，用不同的 离心力，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法 。 如:离心前盛在离心管内的是含有大、中、小三 种颗粒的悬浮液 (a)先低速离心，得到的沉淀主要是最大的颗粒 (b)进一步提高转速离心上清液，得到主要由中等 大小颗粒组成的第二种沉淀； (c)最后一步用更高转速把余下的小颗粒沉淀下来 。 差速离心 w 其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将 上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式 转子。 w 缺点是：分离效果差，不能一次得到纯颗粒 ；管壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度 很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被 挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活 （二）密度梯度离心（区带离心法） w 是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同， 使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度 层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。 w 密度梯度介质：蔗糖、甘油等。作用：支撑样品 和防止离心过程中产生的对流将已形成的区带破 坏。 w 最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度。 w 离心时间不能过长，必须在沉降速率最大的样品 区带沉降到管底之前停止离心，否则样品中所有 组分都将沉降下来。 w 步骤：在离心前于离心管内先装入密度 梯度介质溶液（从管顶到管底密度逐渐 增加），将样品小心铺在介质的表面， 经过离心，样品中各组分在密度梯度溶 液中形成若干条界面清晰的不连续区带 。 w 该法的优点是：分离效果好，S值相差 较小的组分也能得到很好的分离；颗 粒不变形，能保持颗粒活性。 w 缺点： 离心时间较长；需要制备 梯度；操作严格，不易掌握。 （三）等密度梯度离心 w 指当待分离不同颗粒的密度范围处于梯度介质的密度 范围内时，在离心力的作用下，不同密度的颗粒向上 漂浮或向下沉降，经足够时间的离心，移动到与它们 各自的密度相等的位置，形成组分区带。 w 常用介质溶液：绿化铯（ CsCl）等铯盐。 w 步骤：将介质溶液与样品混合，离心，铯盐沉降自动 形成密度梯度，颗粒在梯度中进行再分配，在等密度 处形成区带。 离心分离 三、影响因素 1、离心速度：低速离心一般用转子每分钟的转 数表示，500r/min,高速离心和超速离心一般 用相对离心力（RCF）表示，如:500g。 RCF指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值 。 2、离心时间:不能过长或过短。 w 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间是 指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到管 底的时间，即沉降时间。 w 密度梯度离心的离心时间指形成界限分明的区 带时间，即区带形成时间。 w 等密度梯度离心的离心时间指颗粒完全到达等 密度点的平衡时间，即平衡时间。 w 3、温度：室温，4 ，高速离心和超速 离心必须冷冻离心。 w 4、pH：离心介质的pH必须处于待分离物 质稳定的pH范围内，可采用缓冲液。 四、应用 分离生物大分子 第二节 沉淀分离 沉淀分离法是通过改变溶液的条件或添加某种物质 ，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析 出，与其他成分分离的技术。 一、盐析法 u向蛋白质溶液中加入大量的中性盐使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 ，这种现象称为盐析。 （一）原理 w 盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白表面的水化膜 ，导致蛋白质溶解度下降； w 盐离子所带电荷的中和部分蛋白质分子表面电荷，使蛋白质溶解 度下降。 （二）盐类和浓度的选择 中性盐：（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl，其中运用最广的是（ NH4)2SO4硫酸铵。 硫酸铵的优点：在水中化学性质稳定；溶解度大，25时 能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小， 在0-30范围内溶解度变化不大，价廉易得，性质温和 ，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。 用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需 的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和 硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分 所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几。 影响蛋白质盐析的因素 w 、蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐 析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀 ，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般为2.5%-3.0% 的蛋白质浓度较适中。 w 、p对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解 度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将p值 调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。 w 3、温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范 围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高 盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下对 温度要求不高，可在室温，温度敏感的可在-操 作。 w 4、离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大 ，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象。 （四）脱盐 透析法，凝胶过滤法，超滤法 优点：成本低，操作简便，对生物活性物质有稳定作用， 对pH和温度要求不严。 二、有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉析的特点 w 优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高， 溶剂易除去；沉淀不用脱盐，过滤比较容易。 w 缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引 起变性失活，操作常在低温下进行；有机溶剂 有一定毒性 （一）原理 1、有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后， 整个溶液的介电常数降低，带电的溶质分子之间引 力增强，使溶质分子相互吸引而聚集。 2、亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的 浓度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而 相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。 （二）有机溶剂的选择 原则：水溶性好，沉淀效率高，毒性小，惰性，便宜 常用：乙醇、丙酮、甲醇等 (三)影响有机溶剂沉析的因素 1、pH 有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的 pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通 常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。 2、温度 常温下物质结构松散，有机溶剂易渗入分子内部 ，引起变性；降低温度可降低溶解度；且有机溶剂与 水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至 较低温度，一般在0以下，操作时要在冰盐浴中进 行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓 度过浓。 3、样品的浓度 与盐析相似，样品浓度低时会增加有机溶剂投入量 和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉 的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的 生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共 沉作用大，分离效果下降。一般认为，对于蛋白质溶液 0.5%2%起始浓度较合适,对于粘多糖以1%2%为起始 浓度为宜。 4、有机溶剂的浓度 浓度过大，易共沉淀，浓度过低，沉淀不完全，有机溶 剂的用量一般为溶液体积的2倍。 5、离子强度 在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很 小，物质不能沉析时，补加少量电解质即可解 决。一般离子强度在0.05或稍低为好，既能使 沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保 护作用，防止变性。 6、金属离子 在用有机溶剂沉析生物高分子时还应注意到 某些金属离子的助沉作用，一些金属离子如Zn2+ 、Ca2+等可与某些呈阴离子状态的生物高分子形 成复合物。这种复合物的溶解度大大降低而不 影响生物活性，有利于沉析形成。 三、非离子聚合物沉淀 w 沉淀条件温和，不易引起生物大分子的变性，沉淀效 率高。沉淀物中的多聚物易除去。 w 广泛使用的是聚乙二醇（PEG),亲水性强，分子量范围 广，一般使用相对分子量2000-6000。 w 影响因素： 样品分子量：大易 样品浓度： pH: 等电点附近 离子强度：低好 PEG聚合度：大需少 w 用吸附法、乙醇沉淀法或盐析法将欲分离物吸附或沉 淀，PEG则不被吸附沉淀，从而出去PEG。 第三节 离子交换层析法 w 是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生 可逆交换时结合力的差别而进行分离的一种技术。 （一）基本原理 w 离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电 荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结 合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离 子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其 它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电 的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用， 称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与 带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂 。 w 阳离子交换反应：R-A-H+ + Y+R-A-Y+ + H+ w 阴离子交换反应：R-B+OH- + X-R-B+X- + OH- w R代表离子交换剂的高分子聚合物基质， w A- 和B+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中 与高分子聚合物共价结合的电荷基团， w H+ 和OH- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂 的平衡离子， w Y+ 和X- 分别代表溶液中的离子基团。 w 离子交换层析就是利用离子交换剂的荷 电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或 离子化合物，被吸附的物质随后为带同 类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。 由于各种离子或离子化合物对交换剂的 结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢 ，形成了层析层。 w 离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结 合力。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为： Li+ pH的蛋白带正电，不能与阴 离子交换剂结合；等电点pI pH的蛋白带负 电，能与阴离子交换剂结合；一般pI越小的蛋白 与阴离子交换剂结合力越强。 二、离子交换剂的种类和性质 w 根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其 分成两大类：疏水性离子交换剂和亲水性离子 交换剂。 (一)疏水性离子交换剂 此类交换剂的基质是一种与水亲和力较 小的人工合成树脂，最常见的是由苯乙烯与交 联剂二乙烯苯反应生成的聚合物，在此结构中 再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电 荷基团的性质不同，又可分为阳离子交换树脂 、阴离子交换树脂。又可将它分为强、中及弱三种 。 离子交 换剂的 类型 阳离子交换剂阴离子交换剂 强酸性中强酸 性 弱酸性强碱性中强碱 性 弱碱性 交换基 团 磺酸剂 -SO3H 磷酸基 -PO3H2 亚磷酸 基-PO2H2 羧基 -COOH 酚基 苯环-OH 季氨基 N(CH3)3 叔胺 -N(CH3)2 仲胺 -NHCH3 伯胺 -NH2 w 优点：交换容量大，机械强度高，膨胀率小， 便宜； w 缺点：结构紧密，大分子不易进出，疏水，大 分子易变性 w 适用于小分子的分离 （二)亲水性离子交换剂 w 亲水性离子交换剂中的基质为一类天然 的或人工合成的化合物，与水亲和性较大，常 用的有纤维素、交联葡聚糖及交联琼脂糖等。 w 纤维素离子交换剂 或称离子交换纤维 素，是以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团 构成的。根据引入电荷基团的性质，也可分强 酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。 纤维素离子交换剂中，最为广泛使用的是二乙 胺基乙基(DEAE-)纤维素（弱碱性阴离子）和 羧甲基(CM-)纤维素（弱酸性阳离子）。（表3 -6） w 交联葡聚糖离子交换剂 是以交联 葡聚糖G25和G50为基质，通过化学 方法引入电荷基团而制成的。它既有离 子交换作用，又有分子筛性质，可根据 分子大小对生物高分子物质进行分级分 离，常用的Sephadex 离子交换剂见表3- 7 w 琼脂糖离子交换剂 主要以交联琼脂糖CL 6B (Sepharose CL6B)为基质，引入电荷基 团而构成。例如，DEAESepharose CL6B为 阴离子交换剂；CMSepharose CL6B为阳离 子交换剂。它们的外形呈珠状，网孔大，特别 适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合 物的分离，即使加快流速，也不影响分辨率。 三、技术要点 1、选择离子交换剂的一般原则如下： (1)选择阴离子或阳离子交换剂，决定于被分离物 质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷，应选择阳 离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分 离物为两性离子，则一般应根据其在稳定pH范围内所带电 荷的性质来选择交换剂的种类。 (2)强型离子交换剂适用的pH范围很广，所以常用它 来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定 的物质。弱型离子交换剂适用的pH范围狭窄，在pH为中性 的溶液中交换容量高，用它分离生命大分子物质时，其活 性不易丧失。 w（一）离子交换剂的选择和处理 w (3) 强酸型和强碱型离子交换剂应分别选 择H型和OH型；弱酸型和弱碱型交换剂应分 别选择Na型和Cl型。 (4)交换剂的基质是疏水性还是亲水性 ，对被分离物质有不同的作用性质，因此对 被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。 一般认为，在分离生命大分子物质时，选用 亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分 离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易 破坏。 2、处理 商品离子交换树脂为干树脂，要用水浸透使 之充分吸水溶胀。又因含有一些水不溶性杂质 ，所以要用酸、碱处理除去。一般程序如下： 干树脂用水浸泡2小时后减压抽去气泡，倾去水 ，再用大量去离子水洗至澄清，去水后加4倍量 的2molL HCI溶液，搅拌4小时，除去酸液， 用水洗至中性，再加4倍量的2molL NaOH溶液 ，搅拌4小时，除去碱液，用水洗至中性备用。 w 市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂 为Na型（即平衡离子是Na离子），阴离 子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳 定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱 处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常 用的酸是HCl，碱是NaOH或再加一定的 NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na型 ，阴离子交换剂为Cl型。 （二）装柱和加样 w 1. 层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择 合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而 短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到 1:50之间，层析柱安装要垂直。 w 2. 装柱 湿装法：转型再生好的交换剂先放人烧 杯，加入少量水，边搅拌边倒入垂直固定的层 析柱中，使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必 须分布均匀，不应有明显的分界线，严防气泡 产生。 干装法较少用 3.上样： w 上样量也不宜过大，一般为柱床体积的10以 下为宜。 w 离子交换层析上样时应注意样品液的离子强度 和pH值，平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于 平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子 强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如 蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与 离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样 品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。 最佳Ph一般为待分离蛋白质的等电点相差一 个单位左右。 w （三）洗脱和收集 w 洗脱液中含有与离子交换剂亲和力较大 的离子，以便将吸附的离子交换下来。 亲和力小的离子先洗下来。 w 在离子交换层析中一般常用梯度洗脱， 通常有改变离子强度和改变pH两种方式 。改变Ph可能影响蛋白质的稳定性，一 般采用改变离子强度，NaCl 0.1-0.5M. 蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离、纯化和富集 氨基酸的分离 (用pH递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱) （四）离子交换剂的再生与保存 w 离子交换剂的再生是指对使用过的离子 交换剂进行处理，使其恢复原来性状的 过程。前面介绍的酸碱交替浸泡的处理 方法就可以使离子交换剂再生。 w 离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白 等杂质，并加入适当的防腐剂，一般加 入0.02 %的叠氮钠，4C下保存。 四、影响交换容量的因素 w 总交换容量：离子交换剂所能提供交换离子的总量。 仅与离子交换剂有关。 w 有效交换容量：试验条件下的交换容量。 w 影响因素： w 1、离子交换剂颗粒大小、内空隙大小以及样品组分的 质量大小。 w 2、离子强度：大-降低交换容量 w 3、pH：弱酸性交换剂：pH增大，电荷解离增加，交换 容量加大。 弱碱性相反。 五、应用 w （一）分离纯化生物大分子物质：如蛋 白质、核酸、多糖等 w （二）分离纯化小分子物质：氨基酸、 核苷酸、抗生素等 w （三）水处理 w （四）测定蛋白质等电点 第四节 凝胶层析 w 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。 w 一、基本原理 w 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶 颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小 的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的 路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。 为了精确的衡量混合物中各成分在柱内的洗脱行 为，采用分配系数Kd度量。 Kd = (Ve-Vo) / Vi Ve某一成分从层析柱内完全被洗脱出来时洗脱液的体积 Vo层析柱内凝胶颗粒之间空隙的总容积 Vi层析柱内凝胶颗粒内部的总容积 Vt柱床体积 当分子的Kd0时，VeVo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分 布于流动相里，固定相里分布为零（A);当分子的Kd1时，VeVo+Vi 即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定相里，两相比值为 1(C)；当0 Kd 1时， Ve = Vo + Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。 二、常用凝胶 w 常用的凝胶材料：交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯 酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯等。 w （一）葡聚糖凝胶 w 常见的两类：商品名为Sephadex和Sephacryl。 G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200 吸水量 （g/g干凝胶） 1.01.52.55.07.510.015.020.0 工作范围（肽 与蛋白） 700150050001500- 20000 3000- 70000 4000- 150000 5000- 300000 5000- 500000 G后面的数字为凝胶吸水值的10倍。数值越大，分离范围越大。 （二）琼脂糖凝胶 商品名： Sepharose， Bio-Gel A （三）聚丙烯酰胺凝胶 商品名： Bio-Gel P 三、技术要点 w （一）凝胶的选择 w 分组分离:将大分子和小分子分开，用排阻限较 小的凝胶-G25,G50。 w 分级分离:用排阻限略大于样品中最大分子量的 凝胶 w 颗粒的选择：样品中各组分分子量差别大选大 颗粒，反之，小颗粒。 w （二）柱的选择 分组分离用短柱即可（20-30cm),分级分离用长柱 （100cm左右)，分辨率高，直径1-5cm. (三）凝胶柱的制备 1、凝胶的处理 w 干品凝胶须在水中溶胀，常温浸泡或煮沸， w 悬浮液凝胶不需溶胀 2、装柱 3、加样 w 分级分离：上样量为柱体积的1%-5%， w 分组分离：5%-10% w 除盐：20%-30% 4、洗脱：洗脱液一般与平衡液相同，速度要适中。 w （五）再生和保存 w 可反复使用5-10次，不必特殊处理，加入 0.02%叠氮钠 w 四、凝胶层析的应用 w 1、分离纯化生物活性物质 w 2、脱盐及去处小分子杂质 w 3、高分子溶液的浓缩 w 4、测定大分子的分子量 第五节 亲和层析 w 是利用欲分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲 和力，从而达到分离目的的一种层析技术， w 一、基本原理 w 抗原和抗体 ； 酶和底物或辅酶或抑制剂 ； 激素和 受体； RNA和其互补的DNA等，它们之间都能够专一 而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析 的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分 子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 二、载体和配体的选择 （一）载体的选择要求： 1. 高度的亲水性，易于水溶液中的生物大分子 接近。 2. 惰性载体，非特异吸附性极低。 3.具有丰富的化学基团，配基可以共价地和它 结合，不改变载体和配体的基本性质。 4. 具有较好的理化稳定性，机械性能好 5. 必须具有非常有效的多孔性 常用的介质：纤维素，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰 胺凝胶和多孔玻璃球。 （二）配体 w 配体与待分离的物质有适当的亲和力。 w 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性 w 配体必须具有与载体共价结合的功能基团，而且连接 不影响配基和大分子结合的亲和力。 w 具有较好的稳定性，能耐受耦联及洗脱等剧烈操作。 常用：抗原和抗体，互补核酸，血凝素和糖基，酶与辅 酶，活性染料等 配基和支持物的结合方法：物理法（吸附，包埋法 ），化学法（交联法，耦联法）。 三、技术要点 w （一）上样 w 1、层析柱较短，10cm之内 w 2、上样速度要慢，使待分离样品与配体有足够时 间结合。 w 3、样品缓冲液要有利于特异性结合，不利于非特 异性结合。pH有利于样品稳定。 w 4、用大量上样缓冲液洗去非特异性的杂质。 （二）洗脱 亲和力较弱：直接用大量的平衡缓冲液洗脱 亲和力中等：改变pH或/和离子强度。 亲和力强：含有与配体竞争结合的物质的缓冲液。 五、应用 w 1、抗原抗体的纯化 w 2、生物素和亲和素及相关分子的纯化 w 3、其他生物大分子的纯化 第六节 电泳 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性 相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳 (electrophoresis，简称EP)。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中 迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验 技术。 一、基本原理和分类 （一）基本原理 溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸 附其它带电质点而带电，在电场中就会发生迁 移，移动方向取决于它们的带电符号。不同物 质迁移率不同。 （二）分类 1、自由电泳（无支持体） 2、区带电泳（有支持体） 二、影响泳动速度的因素 （一）带电颗粒的性质 w 颗粒的电荷量越大、直径越小、形状越接近球 形，泳动速度越快。 （二）电场强度 w 指单位长度支持物体上的电压降。电场强度越 大泳动速度越快。 （三）溶液的pH w pH离pI越远，泳动速度越快。 （四）溶液的离子强度 w 一般为0.02-0.2之间，过大过小均不利。 （五）电渗作用 电场中电泳溶液的正（负）电荷与固体支持 物表面上的负（正)电荷之间相互作用，形成一 个离子层，导致流体朝负（ 正）极方向移动， 称为电渗，如图。尽量避免选用高电渗的物质。 AB w（六）支持介质的筛孔 w筛孔大，泳动快。 w（七）其他 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 w 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂作用下 聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶 为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophorsis，简称 PAGE)。 w 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同， 主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳， 双向电泳等类型。 （一）聚丙烯酰胺凝胶的特性 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1.化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵 （Ap），此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N- 四甲基乙二胺），微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形 成自由基引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交 联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。