肺炎球菌结合疫苗质量控制李凤祥课件

肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所 1 大纲大纲 n n 肺炎球菌疾病概况肺炎球菌疾病概况 n n 肺炎球菌疫苗肺炎球菌疫苗 n n 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 2 SerotypeSerotype 19F; Photograph by Rob Smith 19F; Photograph by Rob Smith 格兰氏阳性双球菌格兰氏阳性双球菌 外覆多糖荚膜外覆多糖荚膜 根据荚膜构成不同，分为根据荚膜构成不同，分为4040 个血清群（个血清群（serogroupserogroup) )和和9090多多 个血清型（个血清型（serotypeserotype) ) 荚膜是主要的毒力因子荚膜是主要的毒力因子 针对荚膜多糖产生的抗体具针对荚膜多糖产生的抗体具 有保护性，是疫苗的基础有保护性，是疫苗的基础 肺炎球菌肺炎球菌 100 nm 3 肺炎球菌性疾病肺炎球菌性疾病: : 发病机理发病机理 菌血症性菌血症性 肺炎肺炎 脑膜炎脑膜炎 败血症败血症 中耳炎中耳炎, , 鼻窦炎鼻窦炎, , 非菌血症性肺炎非菌血症性肺炎 进入血流进入血流局部侵润局部侵润 定植定植 穿越粘膜屏障穿越粘膜屏障 侵袭性疾病（侵袭性疾病（IPDIPD）非侵袭性疾病非侵袭性疾病 4 疫苗可预防的死亡疫苗可预防的死亡 20022002年年WHOWHO报告报告 5 5岁岁岁岁以下以下5 5岁岁岁岁以上以上总计总计总计总计 脊髓灰脊髓灰质质质质炎炎1001001,0001,0001,0001,000 乙型肝炎乙型肝炎1,0001,000599,000599,000600,000600,000 白喉白喉4,0004,0001,0001,0005,0005,000 流行性流行性脑脑脑脑膜炎膜炎10,00010,00016,00016,00026,00026,000 黄黄热热热热病病15,00015,00015,00015,00030,00030,000 破破伤风伤风伤风伤风198,000198,00015,00015,000213,000213,000 百日咳百日咳294,000294,0001,0001,000294,000294,000 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 B B386,000386,000 0 0 386,000386,000 轮轮轮轮状病毒状病毒402,000402,00047,00047,000449,000449,000 麻疹麻疹*480,000480,00050,00050,000530,000530,000 肺炎球菌716,000896,0001,612,000 * Source: WHO Global Immunization Vision and Strategy, April 2005 /vaccines/GIVS/english/Global_imm._data_EN.pdf *2003 data 5 肺炎球菌侵袭性疾病（肺炎球菌侵袭性疾病（IPDIPD）( (按年龄分按年龄分) ) *Rate per 100,000 population Source: Active Bacterial Core Surveillance/EIP Network 6 肺炎球菌是引起儿童脑膜炎的肺炎球菌是引起儿童脑膜炎的 主要致病菌之一主要致病菌之一 n n 安徽大学附属医院脑膜炎研究安徽大学附属医院脑膜炎研究 1-161-16岁脑膜炎脑膜炎分离株共岁脑膜炎脑膜炎分离株共109109株株 n n 脑膜炎球菌脑膜炎球菌3434株株 n n 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2525株株 n n 肺炎球菌肺炎球菌1717株株 周仲松，于鑫之，李家斌。中枢神经系统感染280例的类型与病原菌分析J. 中国抗感染化疗杂志, 2002,2(3):173-176 7 1982-19851982-1985年全国年全国1818省市肺炎球菌调查省市肺炎球菌调查 n n 由中国药品生物制品检定所负责，由中国药品生物制品检定所负责，2929个省个省 市级医疗科研单位参加市级医疗科研单位参加 n n 与与WHOWHO进行国际合作进行国际合作 n n 在肺炎（血液）、脑膜炎（脑脊液）和中在肺炎（血液）、脑膜炎（脑脊液）和中 耳炎（中耳渗出液）患者采集标本，分离肺耳炎（中耳渗出液）患者采集标本，分离肺 炎球菌炎球菌 n n 总例数总例数1044610446，分离出肺炎球菌，分离出肺炎球菌782782株株 肺炎球菌分型研究协作组. 我国18省（市）肺炎球菌血清型及其感染的流行病学研究J. 中华流行病学杂志, 1989,10(3): 133-136 8 1982-1985年全国18省市肺炎球菌调查 n n 肺炎球菌对婴幼儿的威胁很大肺炎球菌对婴幼儿的威胁很大 1 1岁以下婴儿占岁以下婴儿占46.5%46.5% 1 1岁以下的婴儿肺炎的病死率达岁以下的婴儿肺炎的病死率达28.6%28.6%，脑膜炎，脑膜炎 的病死率达的病死率达17.2%17.2% n n 成人和儿童的常见血清型差别较大成人和儿童的常见血清型差别较大 成人常见的前成人常见的前6 6个血清群为：个血清群为：1 1，5 5，3 3，6 6，8 8， 1818 儿童常见的前儿童常见的前6 6个血清群为：个血清群为： 5 5，6 6，1919，2 2，4 4 ，2323 9 肺炎球菌耐药已迅速发展为国际性问题肺炎球菌耐药已迅速发展为国际性问题 一些国家世界问题 1967 1970 1978 1980 1991 1967 1970 1978 1980 1991 传播传播 首个耐青霉素肺炎链球菌（首个耐青霉素肺炎链球菌（ PRSPPRSP） 首个多重耐药肺炎链球菌（首个多重耐药肺炎链球菌（MDRMDR） PRSP PRSP 耐药机制耐药机制 19501950 10 我国肺炎球菌对抗生素耐药呈升高趋势我国肺炎球菌对抗生素耐药呈升高趋势 1123 1.李洁, 杨永弘,等. 肺炎链球菌对抗生素耐药性的研究. 中华儿科杂志, 1999,37(7):408-411 2.姚开虎，陆权等. 2000-2002年北京、上海和广州儿童肺炎链球菌携带和耐药监测. 中华医学杂志，2005; 85(28): 1957-1961 3. 中国住院儿童肺炎流行病学调查：4家医院研究结果. Data on file. 惠氏制药有限公司 耐药率 11 肺炎球菌多重耐药增加 n同时对3种或3种以上抗生素耐药的比例 1997年对北京244株儿童鼻咽拭子分离菌株的 研究1 n48.7%菌株同时对氯霉素、红霉素、四环素、和/或 TMP/SMZ耐药 2000-2002年北京、上海、广州研究结果达 88.7% 2 1.王辉, 陈民均. 北京地区肺炎链球菌的耐药性及其分子流行病学调查. 中华医学杂志, 1999, 79(4):253-256 2.姚开虎，陆权等. 2000-2002年北京、上海和广州儿童肺炎链球菌携带和耐药监测. 中华医学杂志，2005; 85(28): 1957-1961 12 大纲 n n 肺炎球菌疾病概况肺炎球菌疾病概况 n n 肺炎球菌疫苗肺炎球菌疫苗 n n 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 13 肺炎球菌疫苗肺炎球菌疫苗 目前已上市可用于预防肺炎球菌性疾病的疫苗有两种目前已上市可用于预防肺炎球菌性疾病的疫苗有两种； n n 二十三价肺炎球菌多糖疫苗（二十三价肺炎球菌多糖疫苗（PPV23PPV23），PPV23PPV23为多糖为多糖 疫苗，疫苗，不能诱发不能诱发T T细胞依赖的免疫反应，在细胞依赖的免疫反应，在2 2岁以内的幼儿岁以内的幼儿 不能诱发有效的免疫应答，因此主要用于不能诱发有效的免疫应答，因此主要用于6565岁以上的老年岁以上的老年 人和人和2 2岁以上的高危人群。岁以上的高危人群。 n n 七价肺炎球菌结合疫苗（七价肺炎球菌结合疫苗（PCV7PCV7）。）。PCV7PCV7是目前唯一的是目前唯一的 肺炎球菌结合疫苗，由七种常见致病血清型（肺炎球菌结合疫苗，由七种常见致病血清型（4 4，6 6B B，9V9V， 1414，18C18C，19F19F，23F23F）荚膜多糖分别与白喉类毒素载体蛋荚膜多糖分别与白喉类毒素载体蛋 白白CRM197CRM197结合构成。结合构成。肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白结合肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白结合 后能够诱发后能够诱发T T细胞依赖的免疫反应，因此可以在细胞依赖的免疫反应，因此可以在2 2岁以内的岁以内的 幼儿产生有效的免疫应答，并且产生免疫记忆。这已经在幼儿产生有效的免疫应答，并且产生免疫记忆。这已经在 PCV7PCV7的免疫原性研究中得到证实。的免疫原性研究中得到证实。 14 肺炎球菌疫苗肺炎球菌疫苗 n n 在美国进行的随机、双盲、对照研究中，共入选在美国进行的随机、双盲、对照研究中，共入选 3783037830名健康儿童，结果显示对疫苗血清型名健康儿童，结果显示对疫苗血清型IPDIPD的有效性的有效性 为为97.4%97.4% i i 。 n n 在美国纳入国家计划免疫后，至在美国纳入国家计划免疫后，至20032003年，年，人群监测数人群监测数 据显示疫苗血清型据显示疫苗血清型IPDIPD的发病率在的发病率在5 5岁以下儿童中下降了岁以下儿童中下降了 94%94% ii ii 。 。并且由于接种疫苗切断了肺炎球菌由儿童向成并且由于接种疫苗切断了肺炎球菌由儿童向成 人的传播，使得人的传播，使得5050岁以上的成人疫苗血清型岁以上的成人疫苗血清型IPDIPD的发病率的发病率 下降了下降了55%55% iii iii ， ，产生了群体免疫产生了群体免疫效果。效果。 n n 在加拿大、澳大利亚和西班牙等国家的人群监测结果在加拿大、澳大利亚和西班牙等国家的人群监测结果 也显示出类似的有效性。也显示出类似的有效性。 15 肺炎球菌疫苗 n n PCV7PCV7对儿童肺炎和中耳炎的有效性也得到证实。临床研究对儿童肺炎和中耳炎的有效性也得到证实。临床研究 显示，显示，PCV7PCV7使使1 1岁以内全部新发临床和放射确诊的肺炎下降岁以内全部新发临床和放射确诊的肺炎下降 32%32% i i ，疫苗血清型急性中耳炎下降疫苗血清型急性中耳炎下降57%57% ii ii 。 。而在美国纳入而在美国纳入 计划免疫后，至计划免疫后，至20042004年，使全部年，使全部2 2岁以内因肺炎住院的病例减岁以内因肺炎住院的病例减 少少39%39% iii iii ； ；至至20032003年，使年，使2 2岁以内儿童中耳炎就诊率下降 岁以内儿童中耳炎就诊率下降 20%20% iv iv 。 。 n n PCV7PCV7还表现出控制肺炎球菌抗生素耐药的作用。美国人群还表现出控制肺炎球菌抗生素耐药的作用。美国人群 监测数据显示，全部肺炎球菌青霉素耐药率从监测数据显示，全部肺炎球菌青霉素耐药率从20002000年的年的17.6%17.6% 下降到下降到20052005年的年的9.9%9.9% i i 。 n n PCV-7 PCV-7 疫苗已在世界各地进行过不同试验，结果证明具有疫苗已在世界各地进行过不同试验，结果证明具有 良好的安全性和耐受性良好的安全性和耐受性. .2006 2006 年年 WHO WHO 的疫苗安全全球顾问委的疫苗安全全球顾问委 员会评估了员会评估了 PCV-7 PCV-7 疫苗的安全性疫苗的安全性 i i 16 大纲大纲 n n 肺炎球菌疾病概况肺炎球菌疾病概况 n n 肺炎球菌疫苗肺炎球菌疫苗 n n 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 17 种子批系统种子批系统 n n 用于制备多糖的生产菌株应该符合国家法规的规定，用于制备多糖的生产菌株应该符合国家法规的规定， 建立原始种子批、主种子批和工作种子批库。建立原始种子批、主种子批和工作种子批库。 n n 每一菌株均应具有产生特定荚膜多糖的能力。应保存每一菌株均应具有产生特定荚膜多糖的能力。应保存 历史记录，包括获得来源和进行的所有鉴别实验。历史记录，包括获得来源和进行的所有鉴别实验。 n n 肺炎球菌的培养物有以下特性：在显微镜下应该能够肺炎球菌的培养物有以下特性：在显微镜下应该能够 观察到培养物复染有典型的肺炎球菌特征，菌株在观察到培养物复染有典型的肺炎球菌特征，菌株在3737 C C 培养生长良好，而且应该有培养生长良好，而且应该有 溶血性光滑型菌落；胆汁溶溶血性光滑型菌落；胆汁溶 解度试验发现应该被溶解解度试验发现应该被溶解; ;而且对奥普托欣很敏感；荚膜而且对奥普托欣很敏感；荚膜 膨胀反应阳性。可使用核磁共振波谱法（膨胀反应阳性。可使用核磁共振波谱法（ 1 1 H H或或13 13C C） ）来对来对 提纯后的多糖进行鉴定。提纯后的多糖进行鉴定。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 18 肺炎球菌生产用菌株肺炎球菌生产用菌株 n n 肺炎球菌荚膜多糖的生产是基于工作种子批（肺炎球菌荚膜多糖的生产是基于工作种子批（ working seed lotworking seed lot）。）。工作种子批要和原始、主种子批工作种子批要和原始、主种子批 具有相同的特征。具有相同的特征。 n n 用于种子生产的培养基使用了来自动物的材料，则这用于种子生产的培养基使用了来自动物的材料，则这 些材料应该符合与生物医药品有关的传染性海绵状脑些材料应该符合与生物医药品有关的传染性海绵状脑 病指导方针中所给出的指导，而且应该得到国家管理病指导方针中所给出的指导，而且应该得到国家管理 机构的批准。应尽量避免采用动物来源的培养基。在菌机构的批准。应尽量避免采用动物来源的培养基。在菌 种每一步扩增过程进行纯度检测及菌种鉴定。种每一步扩增过程进行纯度检测及菌种鉴定。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 19 生产肺炎球菌多糖所使用的培养基生产肺炎球菌多糖所使用的培养基: : n n 疫苗生产所使用的液体培养基应该不含有会疫苗生产所使用的液体培养基应该不含有会 在提纯荚膜多糖时形成沉淀的成分。在提纯荚膜多糖时形成沉淀的成分。 n n 应尽量避免采用动物来源的培养基。如果使应尽量避免采用动物来源的培养基。如果使 用了来自动物的材料，则应该符合与生物医药用了来自动物的材料，则应该符合与生物医药 品有关的传染性海绵状脑病指导方针中所给出品有关的传染性海绵状脑病指导方针中所给出 的指导，而且应该得到国家管理机构的批准。的指导，而且应该得到国家管理机构的批准。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 20 单次收获液单次收获液 n n 应该通过生长率、应该通过生长率、pHpH值和最终生产的值和最终生产的 多糖来验证肺炎球菌生长的一致性。多糖来验证肺炎球菌生长的一致性。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 21 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 肺炎球菌纯化肺炎球菌纯化 n n 培养物在灭菌之前应该对培养液进行取培养物在灭菌之前应该对培养液进行取 样，并检查是否有微生物污染。应该使用样，并检查是否有微生物污染。应该使用 适当的方法（包括接种到适当培养基中的适当的方法（包括接种到适当培养基中的 方法）来验证培养物的纯度方法）来验证培养物的纯度。如果发现有如果发现有 任何染污，则应该废弃该培养物或由其所任何染污，则应该废弃该培养物或由其所 得到的任何产品。杀菌工艺也应该进行充得到的任何产品。杀菌工艺也应该进行充 分验证。分验证。 22 肺炎球菌结合疫苗质量控制 多糖的纯化多糖的纯化 n n 在灭菌之后，可收获培养物，可采用分级沉淀在灭菌之后，可收获培养物，可采用分级沉淀 法、色谱法、酶处理法和超滤法等技术分离并提纯法、色谱法、酶处理法和超滤法等技术分离并提纯 多糖。用来提纯多糖的方法应该得到国家药品管理多糖。用来提纯多糖的方法应该得到国家药品管理 机构的批准。为了确保稳定性，一般情况下将纯化机构的批准。为了确保稳定性，一般情况下将纯化 的肺炎球菌多糖以及纯化的中间物在的肺炎球菌多糖以及纯化的中间物在-20-20 C C以下保以下保 存。存。 23 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 肺炎球菌多糖的检测肺炎球菌多糖的检测 n n 鉴别试验：可采用鉴别试验：可采用对流免疫电泳法和适宜的方法对流免疫电泳法和适宜的方法 n n 多糖的组分：从多糖的组成可以了解纯度，应该多糖的组分：从多糖的组成可以了解纯度，应该 根据多糖的干重来进行分析。可以使用多种方法来根据多糖的干重来进行分析。可以使用多种方法来 确定多糖的组成，具体取决于所采用的分析方法以确定多糖的组成，具体取决于所采用的分析方法以 及多糖的具体类别。所使用的标准应该得到国家管及多糖的具体类别。所使用的标准应该得到国家管 理机构的批准。理机构的批准。 n n 水分含量：水分含量：如果要以冻干粉形式来贮存纯化多糖如果要以冻干粉形式来贮存纯化多糖 ，则要使用适当的检测方法来测定冻干粉的水分含，则要使用适当的检测方法来测定冻干粉的水分含 量，以便确定水分含量是否在所规定的范围之内。量，以便确定水分含量是否在所规定的范围之内。 24 n n 蛋白杂质：蛋白杂质： 采用采用LowryLowry等人所建立的方法或其它经等人所建立的方法或其它经 过验证的方法来测定蛋白含量。应该使用足够多过验证的方法来测定蛋白含量。应该使用足够多 的多糖来进行分析，以便能够准确地检测到的多糖来进行分析，以便能够准确地检测到1%1% 的蛋白杂质。每批纯多糖的蛋白百分含量一般来的蛋白杂质。每批纯多糖的蛋白百分含量一般来 说不应该超过说不应该超过3%3%。但是，蛋白含量可能会随着。但是，蛋白含量可能会随着 血清型的不同而不同，合格的蛋白杂质含量应该血清型的不同而不同，合格的蛋白杂质含量应该 与国家管理机构的规定相符。与国家管理机构的规定相符。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 25 n n 核酸杂质核酸杂质： 使用紫外分光光度测定法进行测定时，所测使用紫外分光光度测定法进行测定时，所测 得的每批多糖所含有的核酸不应该超过得的每批多糖所含有的核酸不应该超过2%2%（重量百（重量百 分含量）。分含量）。 n n 致热原含量：致热原含量： 应该测定纯多糖的致热源含量，而且检测结应该测定纯多糖的致热源含量，而且检测结 果要在国家监督管理机构所规定的合格范围之内。果要在国家监督管理机构所规定的合格范围之内。 可以对兔子进行公认的致热性试验，也可以通过鲎可以对兔子进行公认的致热性试验，也可以通过鲎 变形细胞溶解物试验来测定致热性。变形细胞溶解物试验来测定致热性。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 26 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 n n 分子大小分布分子大小分布 可以根据每批产品的纯化多糖分子大小分可以根据每批产品的纯化多糖分子大小分 布情况来确定生产工艺的一致性。可以通过工艺布情况来确定生产工艺的一致性。可以通过工艺 验证或检测每个批次来确定。通过测定多糖在洗验证或检测每个批次来确定。通过测定多糖在洗 脱曲线（使用适当的色谱分析法来获得洗脱曲线脱曲线（使用适当的色谱分析法来获得洗脱曲线 ）主峰处的分子大小分布来测定分布常数（）主峰处的分子大小分布来测定分布常数（KDKD ）。）。应该确定应该确定KDKD值和值和/ /或分子量分布范围。一般或分子量分布范围。一般 采用琼脂糖采用琼脂糖CL-4BCL-4B或或CL-6BCL-6B凝胶过滤法或适宜的凝胶过滤法或适宜的 方法进行检测。应该对所使用的分析法和色谱柱方法进行检测。应该对所使用的分析法和色谱柱 进行验证，以便证实在适当的分子量范围之内具进行验证，以便证实在适当的分子量范围之内具 有足够分辨率。有足够分辨率。 27 n n 载体蛋白的质控载体蛋白的质控 生产载体蛋白的微生物培养基应不含在人类致毒生产载体蛋白的微生物培养基应不含在人类致毒 性或致过敏的物质。种子批系统有历史记录并定期验证性或致过敏的物质。种子批系统有历史记录并定期验证 菌株特性。如果种子制备、保存或生产时使用了任何来菌株特性。如果种子制备、保存或生产时使用了任何来 自动物的原材料，则这些材料应该符合与生物医药品自动物的原材料，则这些材料应该符合与生物医药品 有关的传染性海绵状脑病指导方针中所给出的指导（有关的传染性海绵状脑病指导方针中所给出的指导（ 3131），而且应该得到国家监督管理机构的批准。），而且应该得到国家监督管理机构的批准。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 28 n n 载体蛋白的特性和纯度控制载体蛋白的特性和纯度控制： 许多蛋白可以用作肺炎球菌结合疫苗的载体。载许多蛋白可以用作肺炎球菌结合疫苗的载体。载 体蛋白最重要的特性一是具有安全性，二是与多糖结合体蛋白最重要的特性一是具有安全性，二是与多糖结合 后可以诱发针对多糖抗原的后可以诱发针对多糖抗原的T T细胞依赖性的免疫反应。细胞依赖性的免疫反应。 以常用的载体蛋白以常用的载体蛋白CRM197CRM197为例，在发酵和收获为例，在发酵和收获 的过程中要进行纯度检测和菌种鉴定，来证实的过程中要进行纯度检测和菌种鉴定，来证实CRM197CRM197 的抗原特性。进行的抗原特性。进行ADP-ADP-核糖基化活性分析及其他分析方核糖基化活性分析及其他分析方 法（包括法（包括HelaHela细胞及细胞及VeraVera细胞分析和豚鼠致死性分析）细胞分析和豚鼠致死性分析） 来检测来检测CRM197CRM197的残基毒性。的残基毒性。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 29 n n 多糖与蛋白载体可通过多种方法进行结合。无论多糖与蛋白载体可通过多种方法进行结合。无论 采用何种结合方法，都要建立质控程序来确保重复采用何种结合方法，都要建立质控程序来确保重复 性、结合物的稳定性和安全性。应通过分析特定反性、结合物的稳定性和安全性。应通过分析特定反 应产物或其它方法来监测衍生和结合过程。结合过应产物或其它方法来监测衍生和结合过程。结合过 程采用的条件可能会导致不稳定基团的丢失，从而程采用的条件可能会导致不稳定基团的丢失，从而 影响多糖链的结构。如果对单价原液的各种特性检影响多糖链的结构。如果对单价原液的各种特性检 测不能确认多糖链结构保持完整，应该进行多糖完测不能确认多糖链结构保持完整，应该进行多糖完 整性的鉴定检测。整性的鉴定检测。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 30 n n 应该对单价批量结合物的特性进行鉴定。鉴定应该对单价批量结合物的特性进行鉴定。鉴定 方法需经过验证方法需经过验证. . n n 结合物提纯工序应该可以清除结合反应和封端结合物提纯工序应该可以清除结合反应和封端 反应的残余试剂。应该通过适当的检测或通过对反应的残余试剂。应该通过适当的检测或通过对 提纯过程的验证来确认已经将残余试剂和下述反提纯过程的验证来确认已经将残余试剂和下述反 应副产物清除：氰化物、应副产物清除：氰化物、1-1-乙烷基乙烷基-3,3-(3-3,3-(3-二甲氨二甲氨 基丙基基丙基)- )-碳二亚胺（碳二亚胺（EDACEDAC）以及取决于化学结合以及取决于化学结合 反应的其它各种产物。反应的其它各种产物。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 31 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 n n 多糖多糖- -蛋白比和结合标记物；蛋白比和结合标记物；对各血清型的每对各血清型的每 批结合物而言，多糖批结合物而言，多糖- -载体蛋白比是结合化学反载体蛋白比是结合化学反 应的一致性标志。该比率应该在国家管理机构所应的一致性标志。该比率应该在国家管理机构所 批准的适用于此特定结合物的范围之内，而且应批准的适用于此特定结合物的范围之内，而且应 该和经临床试验验证有效的疫苗的比率一致。该和经临床试验验证有效的疫苗的比率一致。 32 n n 对于肺炎球菌结合疫苗来说，该比率一般在对于肺炎球菌结合疫苗来说，该比率一般在0.3-0.3- 3.03.0的范围之内，具体取决于血清型。该比率可以的范围之内，具体取决于血清型。该比率可以 通过分别测定蛋白和多糖的含量来测定（进行未结通过分别测定蛋白和多糖的含量来测定（进行未结 合蛋白和未结合多糖的校正），也可以使用能够直合蛋白和未结合多糖的校正），也可以使用能够直 接测定该比率的方法来进行测定。接测定该比率的方法来进行测定。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 33 n n 封端标记物封端标记物 （Capping markerCapping marker） 每批产品都不应含有活化的功能基团，无论是每批产品都不应含有活化的功能基团，无论是 多糖的还是载体蛋白的。另外一个选择是通过监测多糖的还是载体蛋白的。另外一个选择是通过监测 封端反应的产物，或者验证封端反应过程来显示所封端反应的产物，或者验证封端反应过程来显示所 有未反应的功能基团已经被去除。如果在疫苗研发有未反应的功能基团已经被去除。如果在疫苗研发 期间，生产工艺已经得到验证，则不再需要在常规期间，生产工艺已经得到验证，则不再需要在常规 质控中进行这类分析。质控中进行这类分析。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 34 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 n n 结合和未结合（游离）的多糖结合和未结合（游离）的多糖；只有与载体只有与载体 蛋白共价结合在一起的肺炎球菌多糖（即结合多蛋白共价结合在一起的肺炎球菌多糖（即结合多 糖）才是免疫学上对临床保护作用有重要意义的糖）才是免疫学上对临床保护作用有重要意义的 物质。每批纯化后的单价结合物应进行游离多糖物质。每批纯化后的单价结合物应进行游离多糖 检测，以保证其在国家管理机构所批准的范围之检测，以保证其在国家管理机构所批准的范围之 内。内。 下列方法可以在检测前分离未结合多糖，下列方法可以在检测前分离未结合多糖， 也可能适用于肺炎球炎多糖结合物：疏水色谱法也可能适用于肺炎球炎多糖结合物：疏水色谱法 、酸性沉淀法、使用载体特异性抗体进行的沉淀、酸性沉淀法、使用载体特异性抗体进行的沉淀 法、凝胶过滤法和超滤法。法、凝胶过滤法和超滤法。 35 n n 蛋白含量蛋白含量 结合物的蛋白含量应该在限定范围之内。应该结合物的蛋白含量应该在限定范围之内。应该 对每批产品的结合蛋白和游离蛋白（对每批产品的结合蛋白和游离蛋白（unbound unbound proteinprotein）进行检测。进行检测。如可能，还应该测定未结合蛋白如可能，还应该测定未结合蛋白 ( (unconjugatedunconjugated protein) protein)的含量。测定结合蛋白和未的含量。测定结合蛋白和未 结合蛋白可采用结合蛋白可采用HPLCHPLC（高效液相色谱法）或毛细管高效液相色谱法）或毛细管 电泳法。电泳法。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 36 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 n n 多糖多糖- -蛋白结合物的分子大小分布：蛋白结合物的分子大小分布： 多糖多糖- -蛋白结合物的分子大小对于确定生产一致蛋白结合物的分子大小对于确定生产一致 性以及贮存稳定性来说，是一个非常重要的参数。性以及贮存稳定性来说，是一个非常重要的参数。 每批产品都应使用与结合物分子大小匹配的凝胶每批产品都应使用与结合物分子大小匹配的凝胶 基质（基质（matrixmatrix）来测定多糖来测定多糖- -蛋白结合物的相对分子大小蛋白结合物的相对分子大小 。检测方法应该进行验证，验证时要侧重于证实该方法。检测方法应该进行验证，验证时要侧重于证实该方法 有足够的特异性可以将多糖有足够的特异性可以将多糖- -蛋白结合物与其它可能存在蛋白结合物与其它可能存在 的组份（如游离蛋白或多糖）区分开。分子大小标准各的组份（如游离蛋白或多糖）区分开。分子大小标准各 疫苗有所不同，应该与临床试验中证实有免疫原性的批疫苗有所不同，应该与临床试验中证实有免疫原性的批 次相一致。次相一致。 37 n n 无菌性：应该使用国家管理机构批准的方法来检测纯无菌性：应该使用国家管理机构批准的方法来检测纯 化后的结合物的无菌性（细菌和真菌）。如果产品中加化后的结合物的无菌性（细菌和真菌）。如果产品中加 入了某种防腐剂，则应该采取适当的措施来防止防腐剂入了某种防腐剂，则应该采取适当的措施来防止防腐剂 对无菌性检测的干扰。对无菌性检测的干扰。 n n 载体蛋白的特定毒性：载体蛋白的特定毒性：必要时（如使用了破伤风或必要时（如使用了破伤风或 白喉类毒素）应该对单价批量结合物进行载体蛋白特定白喉类毒素）应该对单价批量结合物进行载体蛋白特定 毒性检测。也可以通过生产工艺的验证来证明载体蛋白毒性检测。也可以通过生产工艺的验证来证明载体蛋白 没有特定毒性。没有特定毒性。 n n 内毒素含量内毒素含量：为了确保最终产品中的内毒素在可接受为了确保最终产品中的内毒素在可接受 范围，可以测定单价批量结合物的内毒素含量，检测结范围，可以测定单价批量结合物的内毒素含量，检测结 果要在国家管理机构所规定的范围之内。果要在国家管理机构所规定的范围之内。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 38 半成品原液（半成品原液（final bulkfinal bulk） n n 制备半成品原液，可将各型单价原液混合，制备半成品原液，可将各型单价原液混合， 在进行最终稀释之前加入佐剂、防腐剂和在进行最终稀释之前加入佐剂、防腐剂和/ /或稳或稳 定剂。也可以各型单价原液分别与佐剂吸附，然定剂。也可以各型单价原液分别与佐剂吸附，然 后再混合成半成品原液。后再混合成半成品原液。 n n 无菌性无菌性 ：按照与单价原液同样的要求进行无按照与单价原液同样的要求进行无 菌性（细菌和真菌）检测。菌性（细菌和真菌）检测。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 39 成品质控检测成品质控检测 n n 特性鉴定：特性鉴定：应该对成品进行鉴定，以证明成品应该对成品进行鉴定，以证明成品 包括了预计的所有肺炎球菌血清型多糖，但如果包括了预计的所有肺炎球菌血清型多糖，但如果 已经在半成品原液中进行过此项检测的情况则不已经在半成品原液中进行过此项检测的情况则不 需要重复进行。可以通过血清学试验（使用对纯需要重复进行。可以通过血清学试验（使用对纯 化多糖具有特异性的抗体）来进行检测。化多糖具有特异性的抗体）来进行检测。 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 40 肺炎球菌结合疫苗质量控制肺炎球菌结合疫苗质量控制 n n 无菌性无菌性：按照与单价原液同样的要求进行无菌按照与单价原液同样的要求进行无菌 性（细菌和真菌）检测。性（细菌和真菌）检测。 n n 肺炎球菌多糖的含量肺炎球菌多糖的含量：要检测最终包装成品的要检测最终包装成品的 各型肺炎球菌多糖含量，检测结果要在国家管理各型肺炎球菌多糖含量，检测结果要在国家管理 机构所批准的范围之内。不同生产商所生产的结机构所批准的范围之内。不同生产商所生产的结 合疫苗配方不同。应该对最终包装成品的各型肺合疫苗配方不同。应该对最终包装成品的各型肺 炎球菌多糖进行定量分析。不同产品使用的分析炎球菌多糖进行定量分析。不同产品使用的分析 方法有所不同，包括色谱分析法或血清学检测法方法有所不同，包括色谱分析法或血清学检测法 。也可以使用免疫学分析法来进行检测，如速率。也可以使用免疫学分析法来进行检测，如速率 比浊法比浊法 或或ELISAELISA抑制法。抑制法。 41 n n 残余水分残余水分 ；如果为冻干制剂，则应该使用国家管如果为冻干制剂，则应该使用国家管 理机构所接受的分析方法来测定水分的平均含量。理机构所接受的分析方法来测定水分的平均含量。 一般来说，残余水分的平均含量不得超过一般来说，残余水分的平均含量不得超过2.5%2.5%，而，而 且单瓶疫苗的水分含量不得大于或等于且单瓶疫苗的水分含量不得大于或等于3%3%。