肿瘤的分子诊断课件

肿肿 瘤瘤 的的 分分 子子 诊诊 断断 器官病理学 组织病理学 细胞病理学 免疫病理学 分子病理学 应用分子诊断技术，对肿瘤发 生发展的病理学机制及生物学行为 能从分子水平上加以认识，其范围 覆盖分子生物学和细胞生物学。研 究较为深入当属癌基因、抑癌基因 及其它相关基因。 第一节第一节 肿瘤肿瘤基因过表达及其检测基因过表达及其检测 一、基因过表达的形式 癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋 白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制 过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均 染区，各种基因的扩增常产生基因产物过表达 ，表现为RNA和蛋白质量的增加。 二、基因过表达的检测 （一）表达产物的检测 n免疫组织化学（immunohistochemistry） n酶联免疫吸附实验 （enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA ） n蛋白印迹（Western blot） n流式细胞仪测试法 （二）基因扩增的检测 基因拷贝数的增加和转录产物的mRNA 的增加 分子诊断检测方法: 原位杂交 （in situ hybridization,ISH） 荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization, FISH） 原位PCR（in situ polymerase chain reaction） Southern杂交（DNA杂交） Northern杂交（RNA杂交） 原位杂交（in situ hybridization,ISH） 将分子杂交与组织化学相结合的一 项技术，属固相核酸分子杂交范围，它 用标记的DNA或RNA为探针在原位检测 组织细胞内特异的DNA或RNA序列。 优点： 1、具有分子杂交的特异性强、灵敏高特点，同 时又具有组织细胞化学染色的可见性； 2、即可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回 顾性研究； 3、所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞 涂片； 4、应用范围广泛，可对特定的基因（如癌基因 、 病毒基因）DNA、mRNA的表达进行定位、定 性和定量。组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞 定位研究。 分类： DNA-DNA杂交 DNA-RNA杂交 RNA-RNA杂交 直接法 间接法 同位素标记 非同位素标记 生物素、地高素、荧光素等 双重标记原位杂交技术 荧光原位杂交（FISH） 将荧光素标记克隆的DNA片段与染 色体或细胞间期染色质杂交，以测试该 特定的DNA片段是否有缺失或扩增。 比较基因组杂交 （comparative genome hybridization CGH） 即将荧光素分别标记在去除了重复 序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA上， 然后分别与正常染色体进行原位杂交， 对该二种不同探针与各个染色体杂交后 的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞 在不同染色体上缺失或扩增的状态。 原位PCR （in situ polymerase chain reaction） 将PCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通 过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细 胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原 位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、 定位、定量分析。 一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞 原位进行低拷贝数基因定性的研究方法。 Southern杂交： 一种DNA特定序列定位技术。 以组织或细胞中获取基因组DNA， 用一种或多种限制性内切酶酶切，通过 电泳、转印、原位变性固定于一固相支 持物，用已标记的特异性DNA或RNA的 探针与固定有DNA的固相支持膜杂交， 经过放射自显影或化学发光自显影，对 显影条带进行分析。 Northern blot： 用于分析细胞总RNA或含有poly A 尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和 丰度的分子杂交技术，可了解被测靶基 因在细胞内有无过表达。 注意问题： 1、提取组织或细胞中的RNA，不需酶切而 直接采用电泳。 2、操作过程要严格控制RNase的污染。 3、RNA只与双链DNA样本中的一条链互 补，因此杂交时所需双链DNA探针的量 加大；如采用单链探针，无论是DNA抑 或RNA探针，或是寡核苷酸探针，均需 确定所用探针能与目标RNA互补。 第二节 基因突变及其检测 癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生 中出现频率较高的分子事件，突变的结 果则使癌基因激活或抑癌基因失活，导 致细胞表型发生变化和肿瘤发生。 基因突变是一复杂的过程，不仅在 肿瘤细胞中检测到突变基因，对于某些 癌前病变或癌前状态的组织细胞中也存 在不同形式和不同程度的基因突变，在 同一肿瘤的不同发展阶段，可能会涉及 多种基因不同形式的突变，说明肿瘤的 发生发展是一个多基因参与、多步骤的 复杂的生物学过程。 一、基因突变的形式 点突变（point mutation） 基因缺失(gene losses) 基因异位或重排 （gene translocation and rearrangment） （一）点突变（point mutation） 指基因在特异位置发生一个核苷酸的改变 ，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变 了蛋白质的空间构型和生物学功能。 错义突变（missence） 无义突变（nonsence） 终止码突变（stop codon） 移码突变（frame shift）等 （二）基因缺失 (gene losses) 基因片段缺失是另一种主要的突变 形式，缺失的范围差别较大，可以是1-2 个碱基，也可以是一个片段甚或一个外 显子的缺失。基因片段的缺失可使该基 因激活，转录异常，使基因正常的生物 学功能丧失。基因缺失与肿瘤的临床病 理及生物学行为密切相关。 基因缺失中较为频发的分子事件是 存在于抑癌基因中的等位基因杂合型和 纯合型丢失。 基因缺失是肿瘤形成的原因还是细 胞恶性转化的结果，尚值得深入探讨。 （三）基因异位或重排 （gene translocation and rearrangement） 某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位 置转移到其它染色体的某个位置上称为易位或 重排。易位与重排易使癌基因被激活，或是抑 癌基因失活，从而使细胞恶变。 细胞癌基因的编码序列在DNA分子上是不 连续的，由内含子分隔，其中有些序列起到促 进子和调节基因的作用，如染色体出现易位、 重排等改变时，可使细胞癌基因于正常的抑制 子分开而被置于活化DNA序列的控制之下，其 中具有代表性的例子为Burkitt淋巴瘤。 (四) 其它类型的基因突变 n插入 n甲基化 n染色体非组蛋白改变 等 癌基因或抑癌基因甲基化（methylation ） 状态改变与肿瘤发生存在密切关系。 二、基因突变的检测方法 目前几乎所有的基因突变检测的分 子诊断技术都是建立在PCR的基础上， 由PCR衍生出的新方法不断出现，自动 化程度越来越高，分析时间大大缩短， 分析结果的准确性也有了很大提高。 （一） PCR-SSCP法 单链构像多态性 (single-strand conformational polymorphism, SSCP) 基本原理： 单链DNA在中性条件下会形成二级结构 ，这种二级结构依赖于其碱基组成，在非变 性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA 分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一 个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶 上移动速度改变，不同的二级结构而出现不 同的迁移象。 该法不能测定突变的准确位点，还 需通过序列分析来确定。对于大于200bp 的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高 其灵敏度。 该法简单快速，被广泛用于未知基 因突变的检测。由于该法的简便快速， 特别适合大样本基因突变研究的筛选工 作。 应用PCR-SSCP检测点突变已见报道 于人类大部分的肿瘤组织或细胞，检测 的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也 是检测抑癌基因p53突变最常用的方法。 （二）杂合双链分析法 （heterodulex analgsis, HA） 直接在非变性凝胶上分离杂交的突变 型-野生型DNA双链。由于突变型和野生 型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错 配处会形成突起，在非变性凝胶中电泳 时，会产生与相应同源双链DNA不同的 迁移率。 HA对一些不能用SSCP检出的突变 有互补作用，二者结合使用，可使突变 检出率提高近100%。 （三）突变体富集PCR （mutant-enriched PCR） 利用癌基因或抑癌基因某个编码子 部位存在已知的限制性内切酶位点，用 连续二次的巢式PCR来扩增包括存在酶 位点编码子的DNA片段，在两次扩增反 应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA 片段，野生型因被酶切而不能进入第二 次PCR扩增，而突变型则能完整进入第 二次PCR扩增并得到产物的富集。 （四）变性梯度凝胶电泳法 （denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE） 双链DNA在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳 ，凝胶中自上而下所含变性剂浓度线性增长， DNA片段进行到变性剂某一浓度，与DNA变性温 度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳 迁移率下降，但解链的DNA链中有一个碱基改变 时，会在不同时间解链，则因影响电泳速度变化 的程度而被分离。 在DGGE基础上，又发展了用温度梯 度代替化学变性剂的TGGE法（temperature gradient gel electrophoresis,TGGE），由于 DGGE和TGGE是利用温度和梯度凝胶迁 移率来检测，均需专用的电泳装置。 （五）化学切割错配法 （Chemical cleavage of mismatch,CCM） 基本原理： 将待测含DNA片段与相应的野生型 DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在 异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能 被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化 锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存 在突变。 该法检出率很高，也是检测片段最 长的方法。应用荧光检测系统可增强敏 感度。该法中的化学试剂有毒，故又发 展了碳化二亚胺检测法（Carbodiimide， CDI），CDI为无毒物质。 （六）等位基因特异性寡核苷酸分析法 (allele-specific oligonucleotide ASO) 设计一段20bp左右的寡核苷酸片段 ，其中包含了发生突变的部位，以此为 探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样 品DNA杂交。 可以选用各种突变类型的寡核苷酸 探针，同时以野生型探针为对照，如出 现阳性杂交带，则表示样品中存在与该 ASO探针相应的点突变。 （七）DNA芯片技术（DNA Chip） 基本原理： 将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一 块固体材料如玻璃片、硅片（集成电路板）上， 彼此之间重叠一个碱基，并覆盖所需测定的基因 ，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块 DNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异， 正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经 过共聚焦显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧 光信号，即可确定是否存在突变。 可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗 传图谱的构建等，在基因突变检测方面DNA芯片 也有广阔的前景。 （八）RNA酶A切割法 制备RNA探针，与待测DNA或RNA 片段杂交，在一定条件下，异源双链核 酸分子RNA ：RNA或RNA ：DNA的错 配碱基可被RNase A切割，切割产物可通 过变性凝胶电泳分离。 该法可用于1-2kb的大片段进行检测 ，并能确定突变位点。 （九）染色体分析（analysis of chromosome） 1、荧光原位杂交技术（FISH） 2、寡核苷酸引物原位DNA合成技术 （Oligonncleotide primed in situ DNA synthesis, PRINS） 重复引物原位标记技术（repeated PRINS） 多色原位引物标记（multicolor PRINS） 3、比较基因组杂交 （comparative genomic hybridization, CGH） 基本原理： 用不同的非同位素标记物，分别标记被检 测的基因组DNA（常为肿瘤DNA）和正常人基 因组DNA，两者以1：1混合后制备探针，共同 与正常人中期染色体标本进行染色体原位抑制 杂交，杂交后对不同荧光物分别进行检测，以 每条染色体长轴各位点的被测DNA与正常基因 组DNA荧光强度比，反映两组DNA不同序列的 拷贝数。 只能检测肿瘤基因组中相对于正常 基因组平均拷贝数的变化，而不能检测 易位、倒位及其它拷贝数没有变化的染 色体畸变，基因重排和点突变，也不能 检出小于2Mb的缺失。 （十）DNA序列分析（DNA sequencing） 应用各种突变检测技术检测到的基因突 变，最后都需要用DNA序列分析才能确定 突变的类型及突变的位置 。 直接测序法（direct sequencing，DS） PCR循环测序法 双脱氧终止法 基本原理 第三节 限制性酶切片段长度多态性分析 一、等位基因不平衡 应用同一肿瘤的正常体细胞（常分为 血细胞或肿瘤旁正常组织）和肿瘤细胞的 DNA，检测DNA多态性座位上等位基因不 平衡性。当两个等位基因的相关性密度在 正常与肿瘤细胞之间出现显著性差异时， 就提示肿瘤细胞中多态序列座位处出现突 变。 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 当DNA序列的差异发生在限制性内切 酶识别位点，或当DNA片段的插入、缺失 或重复，可使基因组DNA经限制性内切酶 水解后发生片段长度改变。因为这些特异 基因片段是限制性内切酶产生的，在不同 个体间可出现不同长度的限制性片段类型 ，故称为限制性片段长度多态性 RFLP的研究可以观察到同一患者 的正常细胞DNA中存在二个等位基因， 而肿瘤组织DNA中仅存在一个等位基因 ，因为肿瘤细胞单条染色体中一个等位 基因缺失，这种改变称为杂合缺失（ loss of heterozygosity, LOH）。 人类基因组中含有一些复杂序列家族 ，有些重复序列分散在基因组中，有些是 以一系列短的重复序列排列组成高变区， 其串联重复序列拷贝数可相差很多，出现 可变数的串联重复，约占单倍体DNA的 10%，基本上位于非编码区，重复单位以6- 70bp为多，重复次数约6-100次，称为数量 可变的串联重复序列（variable number of tandem repeat, VNTR）。由于高变区的长度 变化很大，使高变区两侧限制性内切酶识 别位点的固定位置随高变区的大小而发生 相对位移，由此造成RFLP，称之为VNTR 多态性。 采用RFLP技术可直接分析、测定人 体癌组织中某些基因在染色体上的变异 及其与肿瘤发生的关系。精确位点的 RFLP分析还是发现新的肿瘤基因的有效 研究手段。 二、RFLP的检测 采集配对样本，既肿瘤组织和同一 患者的正常体细胞（可用周围血细胞或 肿瘤旁组织），分别提取基因组DNA， 特定的内切酶酶切、电泳、转印，与标 记探针进行Southern杂交后，分析等位基 因的变化。 PCR-RFLP 一种PCR结合RFLP的方法。 首先设计PCR引物，并使其扩增片段 包含多态性限制性酶切位点序列，PCR 扩增后，用相应的酶酶切PCR产物，直 接电泳以观察酶切片段的长度多态性变 化。 该方法快速、简便、灵敏度高，以 及DNA样本用量低 。 第四节 微卫星不稳定性分析 一、微卫星不稳定性与肿瘤 小卫星DNA（minisatellite DNA），又称 VNTR。 微卫星DNA，又称简单重复序列（simple repeat sequence，SRS）。 SRS是一种最常见的重复序列之一 ，具有丰富的多态性、高度杂合性、重 组率低等优点。最常见的为双核苷酸重 复，即(AC)n和(TG)n。在n14时，2bp重 复序列在人群中就呈高度多态性。 SRS广泛存在于原核和真核基因组 中，约占真核基因组的5%，是近年来快 速发展起来的DNA多态性标志之一。 微卫星不稳定性（microsatellite instability, MI）是指简单重复序列的增 加或丢失，特别是在DNA错配修复系统 缺损的肿瘤基因组中常显示大量的MI。 MI可能是肿瘤细胞的一种重要分子 标志。 二、微卫星不稳定性的检测 基本方法为首先用PCR技术扩增所需 的双核苷酸重复序列，然后用凝胶电泳 分析DNA序列。分析时条带长度的确定 可用已知长度梯度标准带为参考，也可 以用频率最高的带（优势带）为基准。 MI分析是与PCR技术联系在一起的 ，由此也衍生不同的方法和引物标记物 。 第五节 端粒酶与肿瘤的关系及检测 一、端粒酶与肿瘤 染色体端粒（telomere）是位于细胞 染色体末端的一种有2-20kb串联的短片段 重复序列(TTAGGG)n及一些结合蛋白组 成的特殊结构。人的端粒长度大约15kb， 随着细胞的每次分裂，端粒逐渐缩短，每 次丢失50-200个核苷酸。端粒的缩短限制 了细胞增殖能力，对端粒长度的计算是计 数细胞分裂次数的生物钟。端粒在染色体 定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等 方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞 转化和永生化密切相关。 端粒序列的复制依赖于一种特殊的 DNA聚合酶即端粒酶（telomerase）的作 用。端粒酶为由RNA和蛋白质组成的一 种核糖核蛋白复合物（RNP），含有端 粒重复序列的模板，即以自身RNA组分 为模板，复制合成端粒序列。 正常细胞周期中，细胞每分裂一次 ，端粒子链即缩短一次，经过若干分裂 周期后，端粒缩短到临界长度时，细胞 进入凋亡，端粒酶检测为阴性。 癌细胞在某些机制作用下，启动端 粒酶表达而使染色体端粒稳定维持在一 定长度，从而使癌细胞得以增殖，并获 得永生化，此时端粒酶检测阳性。 端粒的长度不能作为衡量端粒酶活 性的可靠标记，而端粒酶活性表达的高 低可作为恶性肿瘤发展的衡量指标。 端粒酶的表达水平有可能为肿瘤的 发生发展、诊断、预后等提供指标，并 有可能以抑制端粒酶表达为手段作为肿 瘤治疗的新方法。 二、端粒酶活性的检测 TRAP法 （telomeric repeat amplification protocal，TRAP） ELISA法 TRAP法 （telomeric repeat amplification protocal，TRAP） 首先从肿瘤细胞或组织中制备端粒酶提取液 ，然后进行TRAP反应，即在含有一条引物、 dNTP和TRAP缓冲液的反应体系中，加入端粒酶 提取液，使端粒以其RNA组分为模板催化合成端 粒DNA重复序列，并以此为模板，加入另一条引 物进行PCR扩增，扩增体系中加入标记的dATP （同位素、荧光素或地高辛等标记物），扩增产 物可通过凝胶电泳、放射自显形（同位素为标记 物）后分析，以荧光素为标记物者可通过扫描仪 分析荧光曲线。应用地高辛标记试剂盒，还可进 行半定量分析。 ELISA法 利用端粒酶在生物素标记的引物上 加入多个6核苷酸端粒重复序列，反应产 物用生物素标记的引物进行PCR扩增， 再与链霉菌抗生物素蛋白包被的微量滴 定板结合，与地高辛标记的探针杂交， 产生的有色底物用酶标仪测量结果。 该法省时简便。 结 语 分子诊断是具有划时代意义的检测 手段，在生物医学领域中正发挥着巨大的 作用，在肿瘤基础和临床研究中也显示了 极大的优越性和应用前景。 分子诊断的任务不完全在于去寻找 和发现新的理论、机制，更应致力于如 何将实验研究成果转化到临床应用阶段 。 需解决的问题如： 建立费用低廉、结果可靠、操作方便的分 子诊断技术； 建立标准化的实验操作程序和标准化的分 子诊断实验室，实现分子诊断标准化； 除了要在诊断技术方面逐步实行标准化外 ，对肿瘤诊断指标也要进行标准化。 随着人类基因组计划和后基因组（ 蛋白质组）计划的实施，分子诊断也将 得到进一步完善和成熟，使人类最认清 肿瘤的本质并攻克它。 相关技术参考文献 原位杂交 Herrington CS. Mol Pathol, 1998; 51: 8 Levy ER and Herrington CS. Oxford: Oxford University Press Inc,