酶法在中药提取中的应用和进展课件

酶法在中药提取中的应用和进展酶法在中药提取中的应用和进展 华华 东东 理理 工工 大大 学学 中药现代化工程中心中药现代化工程中心 韩韩 伟伟 酶法在中药提取中的应用和进展酶法在中药提取中的应用和进展 l l 概概 述述 l l 酶法提取的原理酶法提取的原理 l l 酶法提取的优点酶法提取的优点 l l 酶法提取的工艺酶法提取的工艺 l l 酶法在中药提取中的应用酶法在中药提取中的应用 l l 酶法提取灵芝多糖的研究酶法提取灵芝多糖的研究 l l 展展 望望 一一 概概 述述 l l 中药所含的成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成中药所含的成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成 分和有毒成分。分和有毒成分。 l l 为了提高中药的治疗效果，降低毒副作用，选用合理的为了提高中药的治疗效果，降低毒副作用，选用合理的 提取工艺是非常重要的。提取工艺是非常重要的。传统提取方法传统提取方法( (如煎煮法、回如煎煮法、回 流法、浸渍法、渗漉法等流法、浸渍法、渗漉法等) )在提取中药有效成分方面，在提取中药有效成分方面， 存在着损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点。存在着损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点。 l l 2020世纪世纪9090年代中期以后，我国陆续有研究报道将酶用于年代中期以后，我国陆续有研究报道将酶用于 中药提取，并且取得较好的效果。中药提取，并且取得较好的效果。酶法酶法为中药提取提供为中药提取提供 了一种新的途径，具有较大的应用前景。了一种新的途径，具有较大的应用前景。 二二 酶法提取的原理酶法提取的原理 l l 中药中植物药占中药中植物药占90%90%，植物细胞由，植物细胞由细胞壁细胞壁及及原生质体原生质体组组 成。细胞壁由成。细胞壁由纤维素纤维素、半纤维素半纤维素、果胶质果胶质和和木质素木质素等物等物 质构成（致密结构）。质构成（致密结构）。 l l 在中药提取过程中，细胞原生质体中有效成分向提取介在中药提取过程中，细胞原生质体中有效成分向提取介 质扩散时，必须克服质扩散时，必须克服细胞壁细胞壁及及细胞间质细胞间质的双重阻力。的双重阻力。 二二 酶法提取原理酶法提取原理 溶剂相原生质体 细胞结构示意图 细胞壁 酶 二二 酶法提取的原理酶法提取的原理 l l 选用一些恰当的选用一些恰当的酶类酶类（纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶（纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶 等）作用于植物细胞：等）作用于植物细胞： 使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素，果胶等物质使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素，果胶等物质 降解降解，破坏细胞壁的致密结构破坏细胞壁的致密结构，引起细胞壁及细胞间质结，引起细胞壁及细胞间质结 构产生局部构产生局部疏松疏松、膨胀膨胀、崩溃崩溃等变化。等变化。 减小减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提 取介质扩散的取介质扩散的传质阻力传质阻力，从传质角度促使有效成分提取率，从传质角度促使有效成分提取率 提高。提高。 二二 酶法提取原理酶法提取原理 实验流程图与实验思路实验流程图与实验思路 升 温提 取分 析过 滤 溶 剂 酶制剂酶 解 灵 芝 提取过程 提取过程动力学 酶解过程 酶解反应动力学 酶解产物灵芝多糖得率 三三 酶法提取的优点酶法提取的优点 l l 对原料进行酶解预处理，不仅提高有效成分的提取率，对原料进行酶解预处理，不仅提高有效成分的提取率， 而且改善了有效组分的分布，提高了产品的药用价值。而且改善了有效组分的分布，提高了产品的药用价值。 l l 酶法提取缩短了提取时间，同时又提高了有效成分的提酶法提取缩短了提取时间，同时又提高了有效成分的提 取率，具有很大的应用价值。取率，具有很大的应用价值。 l l 酶法反应条件温和，能保持天然产物的构象，不破坏立酶法反应条件温和，能保持天然产物的构象，不破坏立 体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效。体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效。 三三 酶法提取的优点酶法提取的优点 l l 酶法在原工艺基础上仅增加一个操作单元，而勿须对原酶法在原工艺基础上仅增加一个操作单元，而勿须对原 有工艺进行大的改变，而且操作简便易行，对设备要求有工艺进行大的改变，而且操作简便易行，对设备要求 不高。不高。 l l 近几年有人提出的近几年有人提出的“ “仿生提取仿生提取” ”。酶法的引入有利于实现。酶法的引入有利于实现 低温下中药有效成分的提取。低温下中药有效成分的提取。 四四 酶法提取的工艺酶法提取的工艺 l l 酶法提取的工艺流程酶法提取的工艺流程 l l 酶法提取的影响因素和优化酶法提取的影响因素和优化 4.1 4.1 酶法提取的工艺流程酶法提取的工艺流程 l l 酶法提取过程的步骤：酶法提取过程的步骤： 酶解处理酶解处理：用酶降解细胞壁和胞间连接物。：用酶降解细胞壁和胞间连接物。 提取过程提取过程：通过提高温度使酶失活，再用溶：通过提高温度使酶失活，再用溶 剂浸提有效成分。剂浸提有效成分。 4.2 4.2 酶法提取的影响因素和优化酶法提取的影响因素和优化 l l 酶的种类和配比酶的种类和配比： 药材品种不同，其生物体细胞结构和有效成分也有很药材品种不同，其生物体细胞结构和有效成分也有很 大的差异。大的差异。 在酶类的选择方面，必须根据实际情况选用合适的酶在酶类的选择方面，必须根据实际情况选用合适的酶 类，以达到最佳的提取效果。类，以达到最佳的提取效果。 目前酶法采用的酶类主要是目前酶法采用的酶类主要是纤维素酶纤维素酶和和果胶酶果胶酶，此外，此外 也有中性也有中性蛋白酶蛋白酶等。等。 4.2 4.2 酶法提取的影响因素和优化酶法提取的影响因素和优化 l l 酶法提取的工艺条件及其优化：酶法提取的工艺条件及其优化： 酶是一类酶是一类生物催化剂生物催化剂，反应的，反应的pHpH值、温度、酶的浓度值、温度、酶的浓度 、配比和作用时间、激活剂和抑制剂等都会对酶的活、配比和作用时间、激活剂和抑制剂等都会对酶的活 性产生影响，从而影响整个提取过程。性产生影响，从而影响整个提取过程。 根据实验来对酶反应的工艺条件进行根据实验来对酶反应的工艺条件进行优化优化，确定各参，确定各参 数的最佳值。数的最佳值。 4.2 4.2 酶法提取的影响因素和优化酶法提取的影响因素和优化 l l 酶法提取和其他技术的结合：国内一些学者把酶法提取和其他技术的结合：国内一些学者把酶酶 法法与其他一些与其他一些新的提取工艺新的提取工艺结合取得了一定的进结合取得了一定的进 展：展： 酶法膜分离技术酶法膜分离技术 酶法超声提取技术酶法超声提取技术 酶法微波技术酶法微波技术 酶法大孔树脂分离技术酶法大孔树脂分离技术 五五 酶法在中药提取中的应用酶法在中药提取中的应用 l l酶法提取多糖酶法提取多糖 酶法提取酶法提取真菌真菌多糖多糖 酶法提取酶法提取植物植物多糖多糖 酶法提取酶法提取动物动物多糖多糖 l l酶法提取黄酮类化合物酶法提取黄酮类化合物 l l酶法提取皂甙类化合物酶法提取皂甙类化合物 5.1.1 5.1.1 酶法提取真菌多糖酶法提取真菌多糖 l l 沈爱英等比较了沈爱英等比较了热水热水、碱碱、酸酸、复合酶法复合酶法浸提等多种浸提等多种 提取方法提取姬松茸子实体多糖提取方法提取姬松茸子实体多糖 采用复合酶法浸提，即采用由采用复合酶法浸提，即采用由纤维素酶纤维素酶、果胶酶果胶酶和和蛋白蛋白 酶酶按一定比例组成的复合酶，对姬松茸子实体在按一定比例组成的复合酶，对姬松茸子实体在4545酶酶 解解40min40min，然后升温至，然后升温至8585热水浸提热水浸提lhlh，多糖得率为，多糖得率为 15.6715.67。 所需时间为单纯热水浸提的一半，而提取率明显高于水所需时间为单纯热水浸提的一半，而提取率明显高于水 浸提，也高于酸、碱浸提。浸提，也高于酸、碱浸提。 5.1.2 5.1.2 酶法提取植物多糖酶法提取植物多糖 l l 吴茄笛等在苦瓜水溶性多糖的浸提及脱蛋白过程中分吴茄笛等在苦瓜水溶性多糖的浸提及脱蛋白过程中分 别加入别加入纤维素酶纤维素酶和和中性蛋白酶中性蛋白酶 通过正交实验确定其最佳水解条件分别为：纤维素酶，通过正交实验确定其最佳水解条件分别为：纤维素酶， 提取温度提取温度5050，pHpH值值6.06.0，酶用量，酶用量5%5%；中性蛋白酶，；中性蛋白酶， 水解时间水解时间48 h48 h，pHpH值值7.07.0，酶用量，酶用量10%10%。 与常规的水溶醇沉法法相比，双酶法苦瓜水溶性多糖的与常规的水溶醇沉法法相比，双酶法苦瓜水溶性多糖的 收率提高了收率提高了1 1倍多，含糖量提高了倍多，含糖量提高了11.5%11.5%，蛋白含量降，蛋白含量降 低了低了75.2%75.2%。 5.1.3 5.1.3 酶法提取动物多糖酶法提取动物多糖 l l 孙兴权等采用孙兴权等采用酶制剂酶制剂( (胰匀浆胰匀浆) )提取林蛙多糖提取林蛙多糖(TCPS)(TCPS) 通过正交试验确定了提取林蛙多糖通过正交试验确定了提取林蛙多糖(TCPS)(TCPS)的适宜条件的适宜条件 为：酶制剂用量为为：酶制剂用量为2020，pHpH值为值为9.09.0，水解温度为，水解温度为5050 ，水解时间为，水解时间为6 h6 h。 TCPSTCPS粗提物的产率按鲜组织计算达粗提物的产率按鲜组织计算达1.4%1.4%，高于其他条，高于其他条 件的件的2323倍。倍。 5.2 5.2 酶法提取黄酮类化合物酶法提取黄酮类化合物 l l 奚奇辉等对竹叶经奚奇辉等对竹叶经纤维素酶纤维素酶处理后，再进行水回流提处理后，再进行水回流提 取竹叶总黄酮，并与未加酶的提取进行对比，结果发取竹叶总黄酮，并与未加酶的提取进行对比，结果发 现：现： 总黄酮含量总黄酮含量比直接水提比直接水提提高提高23.5%23.5%。 经经t t检验，两种提取方法的检验，两种提取方法的P0.001P0.001。 5.3 5.3 酶法提取皂甙类化合物酶法提取皂甙类化合物 l l 杨军宣等将杨军宣等将纤维素酶纤维素酶用于三七总皂甙的提取，并且对用于三七总皂甙的提取，并且对 加酶和不加酶两种提取方法行比较研究，结果发现：加酶和不加酶两种提取方法行比较研究，结果发现： 加酶组三七皂甙加酶组三七皂甙提取率提取率比不加酶组比不加酶组提高了提高了23.523.5。 薄层层析检验，两种方法所得成分没有差异，说明薄层层析检验，两种方法所得成分没有差异，说明 酶的加入对所提有效成分没有影响。酶的加入对所提有效成分没有影响。 5.4 5.4 酶法提取其他有效成分酶法提取其他有效成分 l l 薛伟明等采用薛伟明等采用纤维素酶纤维素酶法提取红花中的红花黄色素，法提取红花中的红花黄色素， 与传统水浸提取相比，与传统水浸提取相比，提取率提高了提取率提高了9.40%9.40%13.35%13.35% 。 l l 马桔云等在用穿心莲提取穿心莲内酯前，用马桔云等在用穿心莲提取穿心莲内酯前，用纤维素酶纤维素酶 进行酶解，结果发现可以提高穿心莲内酯的收率。经进行酶解，结果发现可以提高穿心莲内酯的收率。经 薄层层析检验，酶的加入对所提有效成分也没有影响薄层层析检验，酶的加入对所提有效成分也没有影响 。 六六 酶法提取灵芝多糖的研究酶法提取灵芝多糖的研究 l l 灵芝又名仙草、神草，具有极高的营养、保健、医疗灵芝又名仙草、神草，具有极高的营养、保健、医疗 价值。价值。多糖类化合物多糖类化合物是灵芝的主要有效成分，具有显是灵芝的主要有效成分，具有显 著的抗肿瘤作用。著的抗肿瘤作用。 l l 灵芝的细胞质地坚硬，灵芝的细胞质地坚硬，细胞壁比较厚细胞壁比较厚，在提取过程中，在提取过程中 的的传质阻力比较大传质阻力比较大，传统的提取方法效率很低。而灵，传统的提取方法效率很低。而灵 芝多糖，由于其分子量很大，仅靠单纯的扩散原理很芝多糖，由于其分子量很大，仅靠单纯的扩散原理很 难通过细胞壁。难通过细胞壁。 l l 本文选取灵芝为提取对象，试图破坏灵芝的细胞壁结本文选取灵芝为提取对象，试图破坏灵芝的细胞壁结 构，提高灵芝有效成分的提取效率。构，提高灵芝有效成分的提取效率。 六六 酶法提取灵芝多糖的研究酶法提取灵芝多糖的研究 l l 酶解过程的单因素实验酶解过程的单因素实验 酶制剂的选择酶制剂的选择 酶量对灵芝多糖得率的影响酶量对灵芝多糖得率的影响 酶解时间对灵芝多糖得率的影响酶解时间对灵芝多糖得率的影响 酶解温度对灵芝多糖得率的影响酶解温度对灵芝多糖得率的影响 溶剂溶剂pHpH对灵芝多糖得率的影响对灵芝多糖得率的影响 液固比对灵芝多糖得率的影响液固比对灵芝多糖得率的影响 六六 酶法提取灵芝多糖的研究酶法提取灵芝多糖的研究 l l 提取过程的单因素实验提取过程的单因素实验 提取温度提取温度 提取时间提取时间 粒度粒度 搅拌搅拌 l l 酶法提取正交实验酶法提取正交实验 l l 酶法和传统热水浸提法的比较酶法和传统热水浸提法的比较 酶制剂的选择酶制剂的选择 结论：纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶与不加酶的提取方法相比，灵芝多糖的收率要高。纤维素酶的效果最佳，木瓜蛋 白酶其次，果胶酶的收率与不加酶相比，没有明显的提高。 酶量对灵芝多糖得率的影响酶量对灵芝多糖得率的影响 结论：当加酶量在0.5%2.5%范围内，灵芝多糖的得率均高于不加酶的情况。在加酶量为01.0%时，随着酶量的增加，灵 芝多糖的提取率逐渐上升；当加酶量超过1.0%时，得率随加酶量的增加而下降。 酶解时间对灵芝多糖得率的影响酶解时间对灵芝多糖得率的影响 结论：灵芝多糖的得率随着酶解时间的增加而增大，当酶解时间达到60min时，得率增加趋势变缓，到90min以后，得率 反而下降。选择60min为最佳的酶解时间。 酶解温度对灵芝多糖得率的影响酶解温度对灵芝多糖得率的影响 结论：在较低温度(3050)时，灵芝多糖的得率随着酶解温度的升高而逐渐增加，当酶解温度为50时，得率达到最大 值；继续升高温度，得率反而下降。选择50作为最适合的酶解温度。 溶剂溶剂pHpH对灵芝多糖得率的影响对灵芝多糖得率的影响 结论：当溶剂pH为5.00时，灵芝多糖的得率最高，此时纤维素酶的活性也最大。pH高于或者低于5.00时，均会使蛋白质 变性，影响酶的活性，得率较低，选择溶剂pH为5.00作为酶解合适的条件。 液固比对灵芝多糖得率的影响液固比对灵芝多糖得率的影响 结论：起始阶段灵芝多糖的收率随着液固比的增加而增大，液固比为15:1时，收率达到最大；随着液固比的继续增加， 收率逐渐降低。选择液固比为15:1比较合适。 提取温度对灵芝多糖得率的影响提取温度对灵芝多糖得率的影响 结论：提取温度升高，多糖得率也随之增大，温度为80后，收率增加显著。提取温度为95后，收率增加趋于平缓， 温度100为沸腾状态，一方面溶剂损失较大；另一方面可能会破坏灵芝多糖的结构，影响生物活性。 提取时间对灵芝多糖得率的影响提取时间对灵芝多糖得率的影响 结论：随着提取时间的延长，多糖收率在逐步增加。当达到60min后，增加的趋势开始平缓，可以认为药材与溶剂中的多 糖浓度趋于平衡，再延长提取时间，收效不大。 粒度对灵芝多糖得率的影响粒度对灵芝多糖得率的影响 - 酶法 - 不加酶 结论：三种粒度下，酶法收率均高于传统热水浸提法。大颗粒下，二者差异很大；这是因为在提取过程中，搅拌速率较 大，基本上消除了外扩散，传质主要受内扩散控制。颗粒越小，这种差异也减小。 搅拌对灵芝多糖得率的影响搅拌对灵芝多糖得率的影响 - 酶法 - 不加酶 结论：对于酶法和传统热水浸提法，有搅拌下的多糖收率均高于无搅拌的情况。搅拌使酶法和传统方法的收率分别提高 17.3%和13.9%，说明酶解破壁增大了孔隙率，使搅拌对传质影响变大。 酶法提取正交实验酶法提取正交实验 水平水平A A 酶酶量量/(%)/(%)B B 酶酶解解时间时间 (min)(min)C C 液固比液固比 1 1 0.50.545451010 2 2 1.01.0 6 60 0 1515 3 3 1.51.575752020 方差方差 来源来源 离差平方和离差平方和 SSSS 自由度自由度 dfdf 均方均方 MSMS F F F F检验检验显显著性著性 A A 0.0120.012 2 2 0.0060.0062.4002.400 F F 0.050.05(2,2)=19.00 (2,2)=19.00不不显显著著 B B 0.0020.002 2 2 0.0010.0010.4000.400不不显显著著 C C 0.1130.113 2 2 0.0560.05622.6022.60显显著著 D(D(误误差差) )0.0100.010 2 2 0.0050.005 总总和和0.1370.137 8 8 酶法与传统热水浸提法的比较酶法与传统热水浸提法的比较 提取方法提取方法操作时间操作时间(min)(min)操作温度操作温度( () )灵芝多糖收率灵芝多糖收率(%)(%) 酶酶 法法 105105 ( (酶解酶解45+45+提取提取60)60) 50 50/45min/45min 95 95/60min/60min 1.811.81 传统热水浸提传统热水浸提120120100100/120min/120min1.521.52 实验实验 条件：液固比条件：液固比20:120:1，pH 5.00pH 5.00，纤维纤维 素素酶酶1.5%1.5% 结论：酶法提取灵芝多糖的结论：酶法提取灵芝多糖的得率得率比传统热水浸提法提高比传统热水浸提法提高19.5%19.5%，操作，操作时间时间比传统比传统 热