过敏性紫癜急性期辅助性课件

l l l l l 过敏性紫癜急性期辅助性T细胞亚 群变化和血浆转化生长因子-1水 平研究 研究生：董胜英（儿科学） 导 师：张秋业 （副教授） 前 言 过敏性紫癜（HSP）是儿童时期最常见的毛细血管 变态反应性疾病，以广泛的小血管炎为病理基础。其确 切的病因及发病机制虽至今尚未完全明确，但众多的证 据显示HSP是一种由免疫复合物介导的系统性血管炎。 研究证实HSP患儿的免疫异常涉及多个方面，包括体液 免疫异常、T细胞亚群和功能紊乱及细胞因子的异常等 ，主要表现为体液免疫功能上调，B淋巴细胞呈多克隆 活化；细胞免疫功能低下，其自身混和淋巴细胞反应（ AMLR）表现在数量、质量和功能的降低；T细胞亚群比 例失调，外周血CD3+ 、CD4+细胞百分率及淋巴细胞转 化功能急性期明显降低，抑制性T淋巴细胞数量和功能 降低；Th1/ Th2失衡，Th1功能降低，Th2优势活化；血 清前炎症因子水平明显升高等；Th3细胞为新近认识的 一组Th细胞亚群，主要分泌转化生长因子(TGF-)， 对各个时期的T、B淋巴细胞及其它免疫细胞具有 广泛、强大的抑制作用，能下调免疫应答。已有 学者报道HSP患儿Th2类细胞因子中的IL-4、 IL-5 及IL-6明显增高，Th2的特异膜蛋白分子CD30表达 也显著高于正常水平，Th1类细胞因子IL-2及IFN- 分泌减少，Th1/ Th2失衡。但有关HSP患儿Th3 亚 群功能研究资料较少。本研究旨在通过对HSP患儿 PBMC体外诱导, 检测上清液中IL-4、IFN-、TGF- 1水平和IFN-/IL-4比值及血浆中TGF-1水平，以 观察HSP患儿辅助性T细胞亚群的功能，探讨过敏 性紫癜的发病机制。 材 料 与 方 法 主要器材 l.SW-CJ-1F型净化工作台(苏州净化设备厂) lBNP-310型CO2培养箱(日本太阳文昌株式会社) lLK5-2A型低速离心机(北京医用离心机厂) lGL-16B型高速离心机（北京医用离心机厂） l显微镜 l加样器 l 1575洗板机(BIO-RAD公司) l 550型酶标仪(BIO-RAD公司) l Forma Scientific 超低温冰箱（最低达-80oc） 主要试剂 l.PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate ， Sigma公司) lCa2+导入剂(Ionomycin， Sigma公司) lRPMI-1640培养基(Hyclone公司) l精制小牛血清(Hyclone公司) l淋巴细胞分离液(上海试剂二厂) lIL-4、IFN-、TGF-1 ELISA试剂盒(深圳 晶美生物工程公司) 研究对象 lHSP组：选择2001年10月至2002年12月我院及儿童 医院住院HSP急性期患儿38例，男20例，女18例； 年龄4-13岁，平均年龄7.12岁。其中进行外周血单个 核细胞（PBMC）培养20例，男11例，女9例；年龄 5-10岁，平均年龄6.08岁。根据皮疹消退前和消退后 两周内有无肾损害的临床依据，将HSP患儿分为无 肾损害组与有肾损害组，诊断标准依据中华儿科学 会肾脏病学组修订的紫癫性肾炎的诊疗建议方案。 38例HSP患儿中28例无肾损害，男13例，女15例； 年龄4-10岁，平均年龄6.57岁；10例有肾损害，男7 例，女3例；年龄6-13岁，平均年龄8.7岁。其中进行 PBMC培养20例患儿中15例无肾损害，男9例，女6 例；年龄5-10岁，平均年龄6.8岁；5例有肾损害，男 3例，女2例；年龄6-10岁，平均年龄7.8岁。 l对照组：16例，男9例，女7例，选自我 院门诊体检的健康同龄儿童，年龄414 岁，平均6.5岁。近期无感染及过敏性疾 病等病史，无免疫制剂应用史。其中进 行PBMC培养15例，男9例，女6例，年龄 414岁，平均6.67岁。 研究方法 l 1.标本采集：入院后次日采血，无菌操作采取 急性期HSP患儿和对照组儿童外周静脉血5ml ，加入无菌肝素抗凝管。 l2.PBMC分离与培养：严格无菌操作，所用器 皿、试剂经高压或抽滤灭菌。 l 将抗凝血于1800rpm离心5分钟， 移取血浆 1ml于-80保存以备测。移取血浆后的剩余抗 凝血中加入等体积含10%灭活小牛血清的 RPMI1640培养液稀释。 l 以2：1比例将稀释血液重叠于淋巴细胞分离 液上，于2000rpm离心20分钟。 l 吸取淋巴细胞层，移入EP管中，用含10%灭活小牛 血清的RPMI1640培养液混匀，于15000rpm离心1.5分 钟，弃去上清，重复洗涤2次。 l 末次离心后，弃去上清，加入含10%灭活小牛血清 的RPMI1640培养液0.1ml，混匀，取一滴计数，按所 计算细胞的浓度，再加入一定量的含10%灭活小牛血 清的RPMI1640培养液配制成1107/ml的细胞悬液。 l 用移液器取100l上述细胞悬液，加入无菌含PMA 和Ca2+导入剂的培养瓶中，PMA浓度为15ng/ml，Ca2+ 导入剂浓度为2ug/ml。培养瓶内含有0.9ml含10%灭活 小牛血清的RPMI1640培养液,混匀后配制成1106/ml的 细胞悬液。 l 将无菌培养瓶放入37、5%CO2的培养箱中培养48 小时。 l 培养48小时后，15000rpm离心30秒，收集上清液 500l于-80保存以备测。 l3.培养上清中IL-4、IFN-、TGF-1及血 清中TGF-1的测定 l严格按说明书操作 统计学处理 l采用SPSS11.0统计软件进行统计学处 理。结果呈正态分布，以均数标准差 （xs）表示，采用组间或自身配对t 检验或t检验，相关分析采用直线相关 分析法。P0.05)；IL-4诱生水平为 (41.47812.342) pg/ml，与无肾损害组（ 38.3908.629）pg/ml比较，差异无显著性意义 (t=0.624, P0.05)； IFN-/IL-4比值为0.6620.165， 与无肾损害组（0.8160.289）比较，差异亦无显著 性意义(t=1.124, P0.05)。 HSP肾损害组与无肾损害组PBMC诱生IFN -、IL-4水平比较(xs，pg/ml) 组别 n IFN- IL-4 IFN-/IL-4 肾损害组 5 25.8641.523 41.47812.342 0.6620.165 无肾损害组 15 29.7186.534 38.3908.629 0.8160.289 t 1.285 0.624 1.124 P 0.05 0.05 0.05 HSP肾损害组与无肾损害组PBMC诱生IFN -、 IL-4水平比较直方图 HSP肾损害组与无肾损害组PBMC诱生IFN -/IL-4比值比较直方图 （二） PBMC诱生TGF-1水平比较 lHSP患儿有肾损害组PBMC诱生TGF-1水 平为(979.788204.498)pg/ml，较无肾损 害组（828.151156.930） pg/ml稍增高 ，但差异无显著性意义(t=1.741, P0.05) 。 HSP肾损害组与无肾损害组PBMC诱生 TGF-1水平比较(xs，pg/ml) 组别 n TGF-1 肾损害组 5 979.788204.498 无肾损害组 15 828.151156.930 t 1.741 P 0.05 （三）血浆TGF-1水平比较 l HSP患儿急性期有肾损害组血浆TGF-1 水平为(344.26492.212) pg/ml，与无肾损 害组（336.542100.465）pg/ml比较， 差异无显著性意义(t=0.212,P0.05)。 HSP肾损害组与无肾损害组血浆TGF-1水 平比较(xs，pg/ml) 组别 n TGF-1 肾损害组 10 344.26492.212 无肾损害组 28 336.542100.465 t 0.212 P 0.05 HSP肾损害组与无肾损害组上清及血浆TGF-1水 平比较直方图 讨 论 一、HSP患儿Th细胞亚群功能变化 辅助性T细胞（Th）即CD4+T细胞，为一多功能细胞群体。目前 根据其分泌的细胞因子不同分为4个亚群，即Th0、Th1、Th2和Th3 。Th0为Th1、Th2细胞的前体；Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-和 TNF-，介导细胞免疫过程；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6 、IL-10和IL-13等，促进B细胞生长、活化和分化，参与体液免疫过 程。Th1与Th2细胞间存在着相互制约与调节作用，Th1/Th2失衡则 引起免疫功能紊乱，协同其他因子导致免疫性疾病的发生。Th3细 胞为新近认识的一组Th细胞亚群，主要分泌TGF-，TGF-对各个 时期的T、B淋巴细胞及其他免疫细胞均有广泛、强大的抑制作用， 能下调免疫应答。研究证实HSP患儿存在免疫功能紊乱。HSP病人 免疫球蛋白产生异常，血清中IgA，IgE升高，以IgA升高明显。已 知IL-4促进IgE和IgG4分泌，IL-5诱导IgA产生，因此IgE、IgA增高 应与IL-4、IL-5等过度生成有关。研究发现，HSP患儿Th2类细胞因 子中的IL-4、IL-5及IL-6明显增高，Th2的特异膜蛋白分子CD30表达 也显著高于正常水平，Th1类细胞因子IL-2及IFN-分泌减少。李秋 等观察了54例HSP患儿，证实HSP血浆中仅IgA、IgE水平高于对照 ，IgG、IgM无差别，且IL-4与IgE及IL-5与IgA间存在正相关关系。 。本研究发现HSP患儿急性期外周血PBMC体外诱生Th2类细胞 因子IL-4分泌增加，Th1类细胞因子IFN-减低，IFN-/IL-4比值 明显降低，Th1/ Th2免疫应答失衡。Yang等对26例HSP患儿 PBMC体外诱导,流式细胞仪检测其TGF-水平，发现其急性期 分泌TGF-的Th3细胞(6.2%)明显高于恢复期(0.4%),而对照组未 发现分泌TGF-的Th3细胞。本研究发现HSP患儿急性期外周血 PBMC体外诱生TGF-1水平明显高于对照组，同时发现HSP患 儿急性期外周血PBMC体外诱生TGF-1水平与IFN-、IL-4水平 呈正相关，与IFN-/IL-4比值呈负相关。表明HSP患儿急性期体 内存在明显Th1/ Th2免疫应答失衡（即Th2优势明显），体内出 现保护性（或调节性）Th3功能增强，以抑制IL-4过度升高，但 TGF-1保护性调节不足，使Th1/ Th2失衡不能纠正。由此导致 体液免疫处于高反应状态，诱发以免疫复合物介导为主的免疫 损伤及产生免疫复合物性血管炎。本研究同时发现急性期有肾 损害的HSP组其IFN-、IL-4、TGF-1诱生水平及IFN-/IL-4比 值与无肾损害组无明显差别，此结果表明HSP患儿急性期Th细 胞亚群变化与病情分型无明显相关性。 二、HSP患儿血浆TGF-1的变化及意义 在肾小球硬化性疾病如系膜增生性肾炎、IgA肾病等的疾病进展 过程中TGF-的作用已引起广泛关注。TGF-对系膜细胞（MC）具有 双相效应，低浓度促进MC增殖，高浓度则抑制MC增殖。TGF-在细 胞外基质（ECM）代谢中也起着重要的调节作用，它不仅促进肾小 球MC增殖，同时通过多个作用环节导致ECM过多聚集。TGF-持续 表达是导致慢性肾纤维化和肾小球硬化的重要原因之一。 迄今，有关HSP患儿急性期血浆TGF-1水平变化的资料报告较少 ，Lin等观察了17例HSP患儿发现血浆内TGF-1水平明现高于对照组 。Yang等观察了26例HSP患儿,发现其急性期血浆TGF-水平较恢复期 及对照组比较无统计学上意义。本研究发现HSP患儿急性期血浆内 TGF-1水平明显升高。同时观察到血浆TGF-1水平与PBMC体外诱生 后TGF-1水平呈显著正相关，说明血浆TGF-1水平升高与淋巴细胞分 泌增多关系密切，为体内保护性（或调节性）Th3功能增强的结果。 HSP患儿急性期有肾损害组血浆TGF-1水平与无肾损害组无明显差别 ，表明HSP患儿急性期TGF-1水平变化与有无肾损害无关。但血浆内 TGF-1高水平与迟发性肾损害及紫癜性肾炎的慢性迁延是否有关有待 于进一步研究。 小 结 HSP患儿急性期PBMC诱生IL-4水平升高，而诱生IFN-水平降低 ，IFN-/ IL-4比值降低，提示Th1/Th2失衡，呈现Th2相对优势状 态；HSP患儿急性期PBMC诱生TGF-1水平升高，且PBMC诱生 TGF-1水平与IFN-、IL-4水平呈正相关，与IFN-/IL-4比值呈负 相关，表明HSP患儿急性期体内出现保护性（或调节性）Th3功 能增强，但TGF-1保护性调节不足，使Th1/ Th2失衡不能纠正。 由此导致体液免疫处于高反应状态，诱发以免疫复合物介导为 主的免疫损伤及产生免疫复合物性血管炎。HSP患儿急性期血浆 TGF-1水平明显增高，且与PBMC体外诱生后TGF-1水平