粘质沙雷氏菌脂多糖的提取课件

粘质沙雷氏菌脂多糖的提 取 实验目的 1、了解脂多糖 （LPS）的生理 生化作用及其制 品的应用； 2、掌握从粘质沙 雷氏菌中提出LPS 的主要方法。 实验原理 内毒素（endotoxin，ET）是存在于革兰 氏阴性细菌细胞壁外膜中的一类脂多糖物 质。机体应用小剂量内毒素，能表达出显 著的有益作用，是一种有效的保护性抗原 ，临床上用于各种恶性肿瘤患者用因放疗 、化疗所引起的白细胞减少症，以及由白 细胞减少继发的慢性乙型肝炎，多发的急 慢性感染等。 脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是位于 革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8- 10nm）的类脂多糖类物质。它是革兰氏阴性 细菌所特有的结构，是革兰氏阴性细菌细胞壁 的重要组成部分。它还是一种非常重要而被广 泛研究的免疫增强剂，同时一些脂多糖是致病 性的内毒素。另外在血清分型中脂多糖也有重 要作用。 LPS及其类脂A对机体能发挥广泛的生物学 作用。LPS一方面可视为革兰氏阴性菌的致 病因子，因而在革兰氏阴性菌感染的发病 机理中起着十分重要的作用，另一方面LPS 对机体亦可表现出显著的有益作用，如抗 肿瘤作用，增强机体特异性抵抗力等。所 有的内毒素尽管来源不同，但均具有相似 的生理作用。 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens） 曾称灵杆菌，它属于真细菌纲，真细菌目 ，肠杆菌科，沙雷氏菌属。它是细菌中最 小者，细胞杆状或球状，单个存在或排列 成短链，每链有36个细胞，能运动，有4 条或更多鞭毛，周身鞭毛，无荚膜，无芽 孢。 粘质沙雷氏菌为腐生菌，在自然界 中分布很广，分布于土壤、水和食 品中，也存在于人的呼吸道、肠道 和粪便中。所以该菌可自土壤、水， 人和动物的粪便中分离得到。 该菌属长期以来认为对人体无害，但近来发 现粘质沙雷氏菌是条件致病菌，可引起肺炎、 泌尿道感染、呼吸道感染、败血症以及外科 术后创伤感染，是医源性感染的重要条件致 病菌。约半数菌株能产生红色的灵菌素，多 次传代后产生色素的能力减弱，甚至消失。革兰 氏染色呈阴性。 灵菌素是由粘质沙雷氏菌菌体中提取的脂多糖 ，能激活脑下垂体肾上腺皮质系统，调整 机体内部环境与功能，增强机体对外界环境变 化的适应能力，刺激机体产生体液抗体，使白 细胞总数增加，吞噬功能加强，激活机体防御 系统，抗御病原微生物及病毒的侵袭。同时它 还具有抗菌抑癌，提高免疫力等生理活性功能 。 目前从粘质沙雷氏菌中提取脂多糖的方法 有很多，主要有三氯乙酸-乙醇冷提法、盐 析法、热水提取法和热酚水法。 （1）三氯乙酸-乙醇冷提法。粘质沙雷氏菌深层 发酵获得的菌体，用生理盐水洗后，用0.25 M 三氯乙酸浸提（1：3 v/v）0 搅拌2 d，离心 ，菌体再用三氯乙酸浸提2次。浸提液合并通过 0.5 cm高的硅藻土抽滤，得透明的乳白色液体 ，在36 时加入3.3 %体积醋酸钠饱和的乙醇 溶液，然后加入68倍体积的冷乙醇，使灵菌 素沉淀，沉淀物溶在0.25 M三氯乙酸，按上法 反复沉淀3次，透析、冷冻干燥的灵菌素冻干品 。 （2）盐析法。粘质沙雷氏菌深层发酵获得的菌体 ，用生理盐水洗后，用0.2 M三氯乙酸浸提（1：3 v/v）0 搅拌2天，离心，菌体再用三氯乙酸浸 提2次。浸提液中加入固体硫酸铵使之呈50 %饱 和度，如有沉淀离心弃去，上清液中加硫酸铵至 饱和，室温放置24 h，发生沉淀如不发生沉淀， 需加入2倍体积的丙酮：乙醇：乙醚（2：2：0.25 ），离心分成溶剂层和水层，水层继续使用上层 溶剂混合物处理23次，直至溶液中乳白色消失 为止。收集沉淀，溶于水中，通过强酸和强碱性 离子交换树脂除盐，流出液冷冻干燥，得灵菌素 冻干制品。 （3）热水提取法。菌体用PH 3.5稀醋酸溶 液回流提取，提取液用Sevag法除去蛋白质 ，水层加乙醇，离心收集沉淀，透析，透 析液中加NaCl及乙醇，离心分离沉淀得白 色粉末粗制品。将它溶于水中，加乙醇（ 一倍体积）除去沉淀，再加一倍体积乙醇 ，收集沉淀，透析，冻干得粘质赛氏甘露 聚糖（Serratimann）。上清液中加入 NaCl离心收集沉淀，透析，脱盐，冻干得 粘质赛氏杆菌素（Serratigen）。 （4）热酚水法。 本次试验所采用的方法， 相比其他三种方法，具有 操作相对简便，提取效果 好的优势。 三、仪器和药品 药品 牛肉提取物、蛋白胨、NaCl、 琼脂、蒸馏水、生理盐水、 苯酚、无水乙醇、 NaHCO3、 EDTA。 仪器 广泛pH试纸、塑料布、透析袋、。 三角瓶（50 mL、250 mL）、离心管 、玻璃棒、烧杯、可调式移液器（ 1000-1000 L、1-5 mL）、 可调式移液器枪头。 恒温培养箱、离心机、 天平、摇床、水浴箱、 冻干机、湿热灭菌锅。 四、实验步骤 菌种培养 斜面培养基培养。 将营养肉汁琼脂培养基（g/L）： （蛋白胨10.0，牛肉提取物3.0，NaCl 5.0 ，琼脂15.0，PH 值7.0左右）制作 成斜面培养基，将菌种接种在斜面培 养基上，28 恒温培养2448 h。 发酵培养基培养。 制作营养肉汁培养基（g/L）：（蛋白 胨10.0，牛肉提取物3.0，NaCl 5.0， PH值7.0-7.2）分装于三角瓶中，28 恒温160170 r/min摇床培养24 48 h。 热酚水法提取灵菌素 将深层发酵后获得的菌体以10，000 r/min离心20 min，收集菌体。 将菌体悬浮于蒸馏水中 （每1g细菌加3ml蒸馏水 进行悬浮）， 反复冻融3-5次 效果比较好。 再加热至60 ，在热细胞悬浮液中 加入等体积预热至50 的90 %（w/w ）苯酚溶液， 于6872 水浴中 搅拌保温30 min后， 冷至室温。 冰箱中过夜。 然后7，000 r/min离心45 min，取水相 。 余下部分再加等量水，按上述方法重复 提2次，离心后取水相。 合并水提液，将水相溶液装于透析袋中 ，流水透析24 h去酚。 再