精品体外抗菌药物抑菌试验（亦称细菌对药物的敏感试验简称药课件

体外抗菌药物抑菌 试验（亦称细菌对 药物的敏感试验- 简称药敏试验） 病原生物学实验室 2009 3 4 一、概念 v药物敏感试验是在体外检测抗菌药物 对细菌的抑制和杀灭的作用。根据药物 的常规剂量在体内所能达到的浓度对细 菌的影响，将被检菌株对该药的敏感程 度分为三级：敏感、中度敏感中介度 、耐药。 v敏感(S)：表示细菌可被常规剂量的药物在体内达 到的浓度所抑制或杀灭。 v中度敏感(MS)：表示细菌可被该药物大剂量的浓 度所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。 只有少数药物可报告中度敏感，如氨苄青霉素测 肠球菌。 v中介度(1)：是为防止因技术因素失控导致结果误 差而设置的“缓冲域”因其临床意义难以确定，故不 应向临床医师报告。而应重做稀释法根据MIC结果 做出判断。 v 耐药(R)：表示细菌不能被常规剂量的药物所达到 的浓度所抑制。 药物在体外稀释的不同浓度对细菌 生长的影响，可分为二种： v 最小抑菌浓度(MIC)：抗菌药物能抑 制被检菌生长的最小浓度。药物对同一 菌株MIC值越小，其抗菌力就越强， 细 菌对这种药物就越敏感。 v 最小杀菌浓度(MBC)：抗菌药物能完 全杀灭被检菌所需要的最小浓度。 v近年来，广谱和超广谱抗菌药物的应用 及滥用，造成耐药菌株数迅速增加，耐 药范围不断扩大，导致抗菌治疗效果严 重下降，耐药菌引起的内源性感染和医 院交叉感染已成为全球性的突出问题。 如何指导科学合理地抗菌治疗及耐药监 测已成为微生物实验室及临床微生物实 验室的重要任务之一。体外检测抗菌药 物对细菌的敏感试验作为实验室的主要 手段，在临床医学中有着重要的作用。 二、 药敏试验的常用方法 vK-B纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀 释法及 E-test法试验 前面讲过药物对同一菌株，MIC值越 小，其抗菌力就越强， K-B法的抑菌圈 (环) 就越大，细菌对这种药物就越敏感 ，这是K-B 纸片扩散法与稀释法的关系 ，呈负相关。 （一） K-B纸片扩散法 v是由Kirby和Bauer所创建，此方法属定性试验，是 药敏试验中最成熟的方法之一，但操作时影响因素 较多，需注意质控。经世界卫生组织推荐统一实验 条件，规定了统一用水解洛蛋白培养基及平板大小 ，培养基厚度，标准菌株、菌龄及菌浓度，操作手 法，纸片质量及厚度，药敏纸片之间距离，观察量 取结果时间及工具，为各国广泛采用的方法。 v根据本国国情，卫生部临床检验中心还制订了关于 临床微生物实验室室内质控要求。临床具体工作须 参照遵守。 v原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌 的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩 散，其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细 菌受到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈 的直径来判定细菌对药物的敏感程度。此法 简单易行、价格便宜、药物选择灵活，适用 对生长快的细菌进行药敏试验。 1 水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton AgarMHA ） 倾注成4mm厚的1215cm平板，将其 保存于4冰箱可用1周。 2硫酸钡比浊管 1.175%氯化钡（BaCl2 .2H2O）0.5ml加0.36N(1%)流酸溶液 99.5ml,充分混匀，每管4ml其浊度相当于 0.5麦氏（McFarland standard）比浊管第 一管1/2（1.5亿/ml相当于1.5108CFUm1 ）,使用期半年。 材料 3 抗菌素纸片 现有商品（阿米卡星(AMK)、 庆大霉素(GEN)、青霉素(PEN)、苯唑西林 (OXA)、氨苄西林(AMP)、氨苄西林舒巴 坦(AMS)、呢拉西林(PIP)、头抱唑林(FZN) 、头孢呋辛(FRX)、头孢他啶(CAZ)、氨曲 南(ATM)、亚胺配南(1MP)、环丙沙星(CIP) 、万古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)、复方新 诺明(SXT) 4 质控菌 金黄色葡萄球菌（ATCC25923） 、大肠埃希菌（ATCC25922） 5 其它 无菌生理盐水、无菌棉拭、镊子、游 标毫微米卡尺、消毒小试管、1ml 、10ml 吸管。 操作方法 1 将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌先接 种在血平板或营养平板上，37孵育 1624h。 2 再将菌落接种至营养肉汤中，培养4 6小时后用灭菌生理盐水校正菌液浓度 至0.5麦氏标准比浊管(相当于 1.5108CFUm1)。 3 用灭菌棉拭子蘸取相当于1.5108CFU/m1 的金黄色葡萄球菌菌液，在试管内壁旋转挤 去多余菌液后，在MHA 平板表面上，从不 同方向均匀涂布3次，每次旋转平板60度， 最后沿平板内缘涂抹1圈。同样方法涂布大 肠埃希菌。 l平板在室温下干燥35min后。根据试验菌 株选择抗菌谱。如阳性球菌:金黄色葡萄球 菌选择青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA) 环丙 沙星(CIP)、万古霉素(VAN)、克林霉素 (CLI)等。大肠埃希菌选用氨苄西林(AMP)、 头抱唑林(FZN)、庆大霉素(GEN)、环丙沙 星(CIP)、亚胺配南(IMP)等。 l用无菌镊子将含药纸片，紧贴于琼脂表面， 各纸片之间相距应大于24mm，纸片距平板 内缘应大于15mm，置37孵育18h24h观 看结果。 结果 v纸片周围的细菌受抑制，形成明显的抑菌圈 ，用游标卡尺测量抑菌环直径的大小记录之 。 v参考表中的质量控制标准，报告敏感(S)、 耐药(R)。 注意事项 v标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范 围内。如果超出该范围，应视为失控，须及 时查找原因，予以纠正。 v培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量 、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工 具的精度、质控菌株的药敏特性等均能影响 结果的准确性。 （二）肉汤稀释法 及琼脂稀释法 v原理 是用水解酪蛋白肉汤(MH)或水解 酪蛋白琼脂（MHA）培养基作为稀释 剂。按美国委员会临床实验室标准 作分步倍比稀释抗菌药物，定量加入被 检菌株。经培养后观察抗菌药物的最小 抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC) 。 优缺点 v稀释法是直接定量地检测抗菌药物在 体外对病原菌的抑制或杀灭浓度，有利 于临床根据MIC、药物代谢等拟定合理 的治疗方案，是目前厌氧菌的最佳测定 方法，琼脂稀释法还易于发现污染或耐 药突变菌。稀释法是新药开发，体外药 敏试验常用的经典参照标准，但操作相 对比较烦琐。 材料（肉汤稀释法） v标准菌株ATCC25923 、待测菌株（金 黄色葡萄球菌6h菌液） MH肉汤 、头 孢霉素或青霉素注射粉剂、无菌蒸馏水 、0.1mol/L消毒磷酸盐缓冲液、0.5麦 氏标准比浊管(相当于1.5108CFU/m1) 、吸头、无菌中试管、小试管或无菌96 孔聚苯乙烯U型板、微量加样器、湿盒 。 操作方法 v药物原液配制 原液浓度常为测定浓度的10倍以上。根据药 物性能选择溶剂。例如 取青霉素钾注射粉剂80万u/支 + 蒸馏水 4ml20万u /ml，取1ml +9mlMH 肉汤2 万u /ml，取2万u /ml的5.12ml药液+MH肉汤 14.88ml5120 u /ml，分装4ml/支，-20 保存）。 v常用的原液浓度 肉汤稀释法为1280u（g）/ml，琼 脂稀释法为5120u（ g）/ml。具体 的还应根据某药的抑菌特性而定。 最好用灭菌溶剂配制。如需要，原 液配制好后用过滤法除菌，小量分 装备用。大部分抗菌药物原液在- 20以下可保存3个月，但在4下 只能保存1周。 测定浓度稀释（参照下表） 测定浓度稀释文字说明 取试管15支，编好管号。 加MH肉汤1ml于2、4、7、10、13试管内。 加MH肉汤3ml于3、5、8、10、11试管内。 加MH肉汤7ml 于6、9、12、15试管内，然后分别 加入药物原液（5120u/m1）1ml于1、2、3管内， 从3管吹吸后，分别放入4、5、6各管1ml，从6管 吹吸后，分别放入7、8、9管中各1ml，从9管吹吸 后，分别放入10、11、12管内各1ml，从12管内 吹吸后分别放入13、14、15管内各1ml。药物的浓 度依次为5120、2560、1280、640、320、160、 80、40、20、l0、5、2.5、1.25、0.625、 0.31u/ml 测定方法 v试管法MIC： 将按上表稀释的浓度再稀释10倍， 各管中抗菌药物的终浓度依次为 128、64、32、16、8、4、2、1、 0.5、0.25、0.12、0.06、0.03u/ml 。各浓度取1ml加入已标记好的小 试管内，以无药物MH肉汤为空白 对照及生长对照。以另一排为质控 菌对照。 每管加菌液50l（含菌量达到105 CFU m1）测试菌和质控标准菌的准备： 增菌培养同K-B法，46小时幼龄菌用 35m1生理盐水校正浓度至0.5麦氏比 浊标准。再用MH肉汤1:100稀释。加完 后，轻摇，置37孵育1824 h观察 结果。 v 微量法MIC：同试管法，各管中抗菌药物的 终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2 、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03u/ml。 各浓度取200微升加入消毒的微量反应板内 ，以无药物MH肉汤为空白对照及生长对照 。以另一排为质控菌对照。 每孔加菌液10l（含菌量达到105 CFUm1 ）测试菌和质控标准菌的准备：同试管法。 置37孵育1824 h观察结果。 MIC结果判断 v先观察对照管应有细菌生长，然后逐 管与对照比较，不出现肉眼可见生长的 最低药物浓度为该药对测试菌(或标准 菌)的MIC。 每次实验时应选用标准菌 株在同一试验条件下进行测定，以控制 质量。 (三)琼脂稀释法MIC v 药液稀释同上，见表。 取每浓度各2m1加 入已作好标记的90mm消毒平皿内，加入 50的MHA18ml，使药物和培养基充分混 匀，冷却后分区域接种,以无药物MHA为对 照。药物终浓度即512、256、128、64、32 、16、8、4、2、l、0.5、0.25、0.125、 0.0625、0.031u/ml,比原来稀释了10倍。每 平皿可分46区，接种46个菌株。 v 细菌接种：每格可用内径4mm外径 6mm接环或加样器，划线或用加样器 多点接种10l每点2l, 接种时先接种含 药浓度低的平板，然后接种含药浓度高 的平板，最后接种不含抗菌药物的平板 ，以检查整个实验过程中测试菌的存活 状态。 置37孵育1824 h观察结果。 结果 v菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药 对检测菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计 。 v 影响因素: 培养基、接种菌量、蛋白质结合 率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因 素均能影响结果。此外，肉汤稀释法不适于 作磺胺药或三甲氧苄氨嘧啶等抑菌剂的药敏 试验，因为敏感菌株在被抑制前已可繁殖数 代，从而使结果的终点不清；而应用琼脂稀 释法可获满意的结果。 质量控制 v每个平板同时接种标准菌株，测试结 果不能超过或低于标准菌株MIC的预期 值范围，如超过或低于预期值范围一个 稀释度以上时，应检查原因,标准菌株 是否被污染或已变异等，并重复测定。 (四) E-test法实验 v是扩散法和稀释法相结合的一种药敏方法。是以抗 菌药物的梯度浓度试条(与宽5mm长50mm的塑料 试条相粘合)，用数字标出所含该药物的浓度刻度 （g/ml）将试条贴在含有细菌的琼脂表面上。 v原理 抗菌药物在琼脂 内向四周扩散，使敏感细菌 在一定范围内受到抑制生长，形成抑菌圈。抗菌药 物的浓度呈连续梯度递减，使抑菌圈的大小随药物 浓度的递减而变化。根据试条两侧抑菌圈与试条相 交位置的刻度数值，准确、定量地测出抗菌药物对 某菌的最低抑菌浓度(MIC)。 v优点 操作简单、定量检测、结果直观准确 、重复性好，具有扩散法与稀释法相同效果 。 v材料、方法 注意事项等与K-B 大致相同（ 略） v结果 围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈 ，抑菌圈和试条的横向相交处的读数刻度即 是该测定抗菌药物对测试菌的最低抑菌浓度 (MIC)。 判定E试验 MIC的方法 v试条两侧的抑菌圈与试条相交处 l位于试条上所示上下刻度之间时，读取较高 的一侧所示的读数。 l两侧的抑菌圈与试条相交处不一致时，读取 刻度数值较高的一侧所示的读数。 l沿药敏试条边缘生长的细菌线在阅读结果时 可忽略不计。 1 2 3 4 4. -内酰胺酶抑制剂因其固有活性等原因可 能会导致沿药敏试条的下端形成一下延的抑 菌圈，此时的MIC应是椭圆形抑菌圈正常椭 圆线的延伸与药敏试条相交处的刻度读数。 5. 在椭圆形抑菌圈与药敏试条相交处或圈内 有小菌落或大菌落时，应读生长被完全抑制 的部分与药敏试条相交处的读数。 6. 出现双抑菌圈时，应读生长被完全抑制的 部分与药敏试条相交处的读数。 7. 测试抑菌抗菌药物时，或接种菌量过高时 ， 应读80%抑菌部分或生长被明显抑制的 部分与药敏试条相交处的读数。 8. 当椭圆形抑菌圈在与药敏试条相交处呈凹 下延伸时，阅读凹下起始处椭圆形切线的读 数。一般高于完全抑制部位0.51个稀释度 。 注意 v质量控制基本与稀释法相同，应掌握E试验 药敏试条的正确使用和储存方式，如涂菌后 一定要待琼脂表面干燥后方可置入药敏试条 。 7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$rZnSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z- 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