微生物的遗传变异和育种ppt课件

第八章 微生物的遗传变 异和育种 何谓遗传学？ 遗传学是关于遗传物质的生理生化性质、世代传递 方式，以及所携带的信息在个体发育中的表达的 一门科学。 早期的遗传学研究亲代与子代之间遗传性状的传递 ，提出了遗传的染色体理论，对基因进行了作图 ，并发现了基因重组现象，故名传递遗传学。 近代的遗传学则进一步从分子水平上研究基因的构 成、复制、表达、突变和修复等，被称为分子遗 传学。 微生物遗传学 涉及部分真核生物，所有的原核生物，以及病毒 的遗传； 介绍微生物的遗传物质的结构特点、遗传信息的 表达与调控、遗传变异的基本规律； 介绍通过基因操作改变微生物的遗传信息从而有 效地控制或利用微生物的基本策略。 qq 遗传遗传(heredity)(heredity) 微生物的生物学性状保持相对稳定，子代与亲代之间生物学 性状具有相似性，且代代相传； 不同种属的物种得以保存。 qq 变异变异(variation)(variation) 在一定条件下，子代与亲代之间的生物学性状出现的差异； 进化产生新的变种赋予该物种适应复杂环境的能力。 qq 选择选择(selection)(selection) 微生物与环境的关系； “优生劣汰”适应环境才能存在、保存。 +- 外界环境 群体个别细胞 变异幅度 +- 可逆性 -+ 遗传 -+ 基因改变 非遗传性变异 表型变异 phenotypic variation 遗传性变异 基因型变异 Genotypic variation 第一节 遗传变异的物质基础 一、遗传物质的鉴定 二、脱氧核糖核酸 三、基因组DNA和染色体 四、染色体以外的遗传因子 结论 细胞生物的遗传物质是双链DNA 病毒的遗传物质可以是单链的或双链 的DNA或RNA， 即：ssDNA， dsDNA，ssRNA或dsRNA。 二、脱氧核糖核酸 1核酸的化学组成和结构 2DNA的复制方式 3DNA的理化性质 1核酸的化学组成和结构 Watson 和Crick在1953年描述了DNA的结构模型： DNA分子是由两条相互平行、方向相反的多核 苷酸单链以右手螺旋方向相互缠绕而形成的双螺旋。 脱氧核糖和磷酸构成的主链位于外围，通过氢键 相互交联的碱基处于双螺旋的内部。 腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对； 两条单链互补；一条链的碱基序列限定了另一条链的 序列。 Watson Rosalind Franklin 的贡献 Watson and Crick proposed DNA structure in 1953 by building models based on chemical and physical data that had been gathered in other labs, primarily x-ray diffraction data collected by Rosalind Franklin et al. Frederick Sanger 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 1717 中心法则 2DNA的复制方式 细菌DNA的q-形复制 10100 mm 复制叉 复制叉复制原点 模板 新生链 DNA的理化性质 DNA的稳定性 在溶液中，DNA具有一定的粘性，易受剪切力的破坏 ；易被核酸酶降解； 在强酸中，DNA能被水解成碱基、糖和磷酸； 在特定的稀酸中(如pH 34)，不同碱基与核糖之间的 糖苷键会发生特异性的断裂，根据这种特异性可测定DNA 的碱基序列； 在稀碱如0.2当量NaOH中，双链DNA很快变性产生单 链DNA，继而单链DNA被进一步破坏。 3DNA的理化性质（2） DNA的光学性质 DNA中的碱基属于芳香簇化合物，能够 吸收紫外光(UV)。DNA吸收峰的光波波长为 260纳米；当浓度为 1 mg/ml时， dsDNA ： A260=20 ssDNA、RNA ： A26025 人们根据A260测定DNA的浓度， 根据 A260 / A280和估算DNA的纯度。 DNA的热变性 双链DNA在一定的高温下解链(变性)产生 单链DNA。双链DNA完全解链后，紫外吸收值 A260可以提高 40，当吸收值的提高达到中点 时的温度称为解链温度（Tm）。 1.4 1.2 1.0 70 80 90 100C Tm 3DNA的理化性质（4） 复性、退火或杂交 当温度缓慢降低时，序列互补的单链 DNA能够渐渐地重新配对，即复性。 不同来源的DNA之间碱基序列互补的 区段进行的碱基配对称为退火或杂交，这 被广泛应用于DNA的扩增、定点诱变、基 因鉴别。 分子特征与微生物分类鉴定 DNA中的GC含量通常通过Tm值来测定。 同一个属的细菌， GC含量的变化一般小于10 。 DNADNA杂交技术用于研究亲缘关系近的 微生物。 如果两菌株在最适条件下杂交，DNA相关性 70%，且Tm值差别 2 h 使PCR实现自动化。上图为PCR仪，下图为示PCR循环。 T (C) 90 70 50 Time (min) 循环 1 循环2 循环3 循环 载体 vector lDNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表 达 l克隆载体、表达载体 原核载体：质粒(pBR322,pUC） 噬菌体（，M13）等 真核载体：动物病毒载体pLXSN等 常用的克隆载体 l质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的 小型环状双链DNA分子 理想的质粒 l拷贝数多; l两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素 基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶 基因(lac Z) 筛选标志 l多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS) 表达载体(expressing vector) l特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序 列 l大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位 点克隆位点转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、 T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)： 起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列 1. 基因工程总体策略 2. 目标基因的克隆与鉴定 3. 宿主和载体 4. 重组蛋白的生产 基因工程总体策略 重组蛋白的生产品种、菌株改良遗传基因分析 重组DNA技术的基本过程 l目的基因的制备 l载体的选择和制备 lDNA分子的体外连接 l将外源DNA导入宿主细胞 l目的基因的筛选和鉴定 目的基因(target DNA)的制备 l目的基因（外源基因） l制备基因组DNA - 基因文库(genomic library)存在于转化细菌中、克 隆载体携带的所有基因组DNA的集合 l制备cDNA - cDNA文库(cDNA library) l制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合 成 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 110110 基因工程的操作过程 切接转 增 检 l载体的选择和制备：噬菌体、粘性质 粒、 pUC系列、M13噬菌体 lDNA分子的体外连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 连接效率高 l相同酶切末端 平端连接 连接效率低 人工接头(linker)法 同聚物接尾法 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 112112 同种内切酶生产的粘性末端的连接 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA AATTC G 5 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG lBamHI 5 5 GGATCC CCTAGG 5 GATCC G 5 CTGCAG GACGTC lSap I C GACGT 重组率 重组率的定义 l 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总 数 l 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% l 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组 率可以 l 大大简化DNA重组的后续操作。 提高重组率的方法 l提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 l载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 将外源DNA导入宿主细胞 l基因工程菌 HB101,JM109 l转化(transformation) 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取 和容忍外来DNA的生理状态 l感染(infaction) 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗 传信息转移过程 l转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导 入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 l Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌 （如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+ 与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲 发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状 态叫做感受态 转化率 转化率的定义 l 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义 为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体 细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下， 每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此 转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转 化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在 筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长） 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 120120 l转化子的筛选和鉴定 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此 必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子 、目的重组子 转化子目的重组子 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 121121 抗药性筛选法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r 抗药性筛选法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗药性筛选法可区分转化子 与非转化子、重组子 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 123123 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已 知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非 重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于 数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高 。 bp 1534 994 695 515 377 237 A B C M 重组蛋白生产的优势: a. 可以对基因加以改造; b. 基因拷贝数大量提高; c. 用强启动子进行快速转录; d. 基因翻译得到优化; e. 可进行主动调节; f. 宿主细胞易于培养. 重组蛋白的生产 克隆基因的表达 l载体有转录、翻译的元件； 密码子通用 l原核表达体系 原核表达载体的标准 l合适的筛选标志 l强启动子 l翻译控制序列 l多克隆位点 l融合蛋白（fusion protein,包涵体） 表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA 编码，C末断由克隆的真核DNA编目。 l大肠杆菌表达体系的不足 缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基