血流感染标本和呼吸道标本操作规范及临床意义课件

血流感染标本和呼吸道标本操作规范及血流感染标本和呼吸道标本操作规范及 临床意义临床意义 标本类型标本类型 血培养 呼吸道标本 (痰标本、咽部标本） 尿培养 脑脊液培养 生殖道标本培养 抽吸物和组织标本的培养（需氧、厌氧培养） 伤口拭子 粪便培养 血培养概念血培养概念 采集患者的血液或无菌体液标本,送至微生物实验室 培养检测. 检测原本无菌的血液及体液中是否有细菌存在. 如有细菌,则极有可能为致病的细菌. 进一步进行鉴定/药敏试验. 完整的血培养过程完整的血培养过程 医师开出医嘱 护理人员收集送检样本 实验室检测、分离并鉴定导致血流感染的微生物 三级报告：为临床医生提供抗菌药物敏感性试验结果 目前血培养的问题目前血培养的问题 采血时机不合适 采血套数不够 采血量不足 只做需氧培养，不同时做厌氧培养 采血前或采血时正在使用抗生素治疗 血流感染与血培养 的规范实践 关于血培养指征关于血培养指征 “只有在只有在发热时发热时发热时发热时 ，才需要，才需要进进进进行血培养。行血培养。” 想采就采 血培养的指征血培养的指征 当当怀疑血流感染或脓毒症时，应常规行血培养。 怀疑患者有血流感染的症状有： 不明原因的发烧(38)或体温过低(36) 白细胞增多（ 10,000/ul），粒细胞减少（ 1,000/ul） 休克，寒颤，僵直 严重的局部感染(脑膜炎，心内膜炎，肺炎，肾盂肾炎， 腹部术后感染，) 心率异常加快 低血压或高血压 呼吸频率加快 关于采血时机关于采血时机 “何何时时时时采血采血进进进进行血培养，无特殊行血培养，无特殊时间时间时间时间 要求。要求。” 关于采血套数及部位关于采血套数及部位 “为为为为减减轻轻轻轻患者痛苦，只从一个患者痛苦，只从一个 穿刺部位采一份血液穿刺部位采一份血液标标标标本即可。本即可。” 血培养采血时机 细菌浓度 体温 03060 时间 (分钟) 基本概念基本概念 成人“一套” 血培养应该包括需氧瓶和厌氧瓶各一个，也 叫“一份” 注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套应从另一个 穿刺点获得。 儿童一般只做需氧培养，但仍需从多个部位采集多次。特 殊患者才考虑厌氧培养。 采血套数采血套数 Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548 表皮葡萄球菌的临床意义表皮葡萄球菌的临床意义 采集1套无法判断是 病原菌还是污染 菌。 23套血培养，有助于污染的判断。 关于血培养套数与采血部位关于血培养套数与采血部位 每位患者每次采血最少2套，3套更好 初发患者，绝不能只采1套标本 多个穿刺部位采血。因多部位同时发生污染的几率较小，便于 对结果进判断 关于采血间隔关于采血间隔 “两套血培养采集两套血培养采集间间间间隔无特殊要求。隔无特殊要求。” 关于标本采集间隔时间 对于非持续性菌血症，同时或短时间内采集2-3套血培养，因为体 内巨噬细胞吞噬系统会在1530min内清除掉进入人体内的细菌 。 可疑急性心内膜炎患者要立即取血作血培养，30分钟内完成3套血 培养的采集，采集后立即进行抗菌药的经验治疗。如果24小时内 报告阴性，则继续采集2套血培养。 可疑的亚急性心内膜炎患者每间隔30分钟至1h采集1套，连续采 集3套标本。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。 关于采血量关于采血量 “每瓶采集多少血液无特殊要求。每瓶采集多少血液无特殊要求。” 采血量采血量(ml)(ml)与检出率的关系与检出率的关系 血培养物每增加一毫升，真性菌血症 成年人微生物的检出率增加3 但并非越多越好，超过一定数量的采血量会稀释培 养瓶内的肉汤，使肉汤无法有效中和血中的抑制物质（ 补体、抗体、抗生素）。所以血液与肉汤的最佳比例为1 ：41：10 关于采集血液量 采血量是影响灵敏度最关键因素 成人一份标本2个培养瓶（需氧厌氧），每瓶 810ml，共20ml；要求至少采两份标本，即 40ml。 儿童一般只需采集需氧瓶，在保证采集血量1 总血量下，一般为1-3ml 采血量不足时应优先保证需氧瓶，因临床90 以上的感染为需氧菌或兼性需氧菌感染 关于关于各种血液标本的采集顺序 先采生化、凝血先采生化、凝血标标标标本，再采血培养本，再采血培养标标标标本。本。” 采各种血液标本的先后顺序采各种血液标本的先后顺序 血培养对无菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它标 本要高。 所以要最先采集血培养标本。 污染率的指标是 10个/低倍视野 可以在玻片上看到许多鳞状上皮细胞，说明在采 集时受到了上呼吸道分泌物的污染或口水的污染 。 很多的中性粒细胞很少有或没有中性粒细胞 免疫抑制的病人也会出现 中性粒细胞减少 中性粒细胞和上皮细胞都很少的标本需要培养 很多中性粒细胞混合有形态多 样的细菌（革兰氏阴性杆菌， 纺锤形，革兰氏阳性球菌） 吸入性肺炎标本革兰氏染色的典型形式，培养只 会培养出正常菌群，所以革兰氏染色是用于诊断 的方法。 许多或中等量的中性粒细胞， 以一种形态的细菌为主 酵母菌样，酵母菌是一种 很少引起肺炎的细菌，常 由口腔污染 成双革兰氏阳性球菌，短链=肺炎链球菌 革兰氏阳性菌成群排列=金黄色葡萄球菌 革兰氏阴性球杆菌（小）=流感嗜血杆菌 革兰氏阴性杆菌大且肥厚=肺炎克雷伯菌或其他 肠道菌 革兰氏阴性双球菌=卡他莫拉菌 许多不着色的有折射的杆状细 菌 可能是肺结核，抗酸杆菌不能被革兰氏染色所染 色。 呼吸道标本的涂片评估模式 痰标本的培养 前处理：用无菌盐水将痰洗涤前处理：用无菌盐水将痰洗涤3 3次，除去痰液表面的常居次，除去痰液表面的常居 菌，加入等量的菌，加入等量的1%1%胰酶溶液（胰酶溶液（PH7.6PH7.6），），3530min3530min，使痰，使痰 液均值化后备用。液均值化后备用。 分离培养：处理后的痰液分区划线接种于血琼脂平板、嗜分离培养：处理后的痰液分区划线接种于血琼脂平板、嗜 血巧克力平板和麦康凯（或血巧克力平板和麦康凯（或EMBEMB、中国蓝）琼脂平板，置、中国蓝）琼脂平板，置 5%-10%CO5%-10%CO 2 2 环境中，环境中，3535培养培养18-24h18-24h，根据菌落及形态（，根据菌落及形态（ 革兰染色）特点，作出初步判断。革兰染色）特点，作出初步判断。 常用培养基作用及成分 血平板：血平板：判读细菌在体内的基本生长情况，分离培养苛氧和判读细菌在体内的基本生长情况，分离培养苛氧和 非苛氧菌。非苛氧菌。 基础成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。基础成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。 特殊成分：脱纤维绵羊血，鉴别溶血反应和提供特殊成分：脱纤维绵羊血，鉴别溶血反应和提供X X因子（血因子（血 红素）。红素）。 嗜血巧克力平板：嗜血巧克力平板：分离培养苛氧菌，尤其适用与嗜血杆菌。分离培养苛氧菌，尤其适用与嗜血杆菌。 基础成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。基础成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。 特殊成分：血红蛋白粉和特殊成分：血红蛋白粉和NADNAD分别含分别含X X因子和因子和V V因子，嗜血杆因子，嗜血杆 菌生长所必须；万古霉素，抑制阳性菌生长。菌生长所必须；万古霉素，抑制阳性菌生长。 麦康凯：麦康凯：用于检测大肠菌群和肠道致病菌。用于检测大肠菌群和肠道致病菌。 基础成分：蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。基础成分：蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。 特殊成分：乳糖和中性红，大肠菌群为粉红特殊成分：乳糖和中性红，大肠菌群为粉红/ /红色，肠道致红色，肠道致 病菌为透明；病菌为透明；3 3号胆盐和结晶紫，抑制阳性菌及真菌生长。号胆盐和结晶紫，抑制阳性菌及真菌生长。 平板的初步判读 条件致病菌：条件致病菌：又为机会致病菌，在某种特定的条件下致病又为机会致病菌，在某种特定的条件下致病 的细菌，为人体正常菌群，但其聚集部位发生改变、机体的细菌，为人体正常菌群，但其聚集部位发生改变、机体 抵抗力降低或菌群失调时可致病。抵抗力降低或菌群失调时可致病。痰标本的正常菌群主要痰标本的正常菌群主要 以阳性菌为主。以阳性菌为主。 接板、读板顺序：血平板、嗜血巧克力平板、麦康凯平板接板、读板顺序：血平板、嗜血巧克力平板、麦康凯平板 血平板：血平板：反映细菌在体内的生长情况，用于半定量的判断反映细菌在体内的生长情况，用于半定量的判断 ，观察是否存在溶血、判断优势菌。，观察是否存在溶血、判断优势菌。 嗜血巧克力平板：嗜血巧克力平板：抑制革兰阳性菌，革兰阴性菌及真菌生抑制革兰阳性菌，革兰阴性菌及真菌生 长良好，不能用于半定量的判断，主要用于流感嗜血杆菌长良好，不能用于半定量的判断，主要用于流感嗜血杆菌 鉴定。鉴定。 平板的初步判读 流感嗜血杆菌：革兰阴性短小杆菌，氧化酶、触酶反应不流感嗜血杆菌：革兰阴性短小杆菌，氧化酶、触酶反应不 定，嗜血巧克力平板上形成微小、无色透明似露滴状的菌定，嗜血巧克力平板上形成微小、无色透明似露滴状的菌 落，有特殊气味。血平板可形成落，有特殊气味。血平板可形成“ “卫星现象卫星现象” ”。 鉴别诊断：流感：鉴别诊断：流感：V+XV+X因子；副流感：因子；副流感：V V因子因子 麦康凯平板：麦康凯平板：抑制革兰阳性菌及真菌，革兰阴性菌生长良抑制革兰阳性菌及真菌，革兰阴性菌生长良 好，不能用于半定量的判断，主要用于大肠菌群与肠道致好，不能用于半定量的判断，主要用于大肠菌群与肠道致 病菌、非发酵菌的鉴定。病菌、非发酵菌的鉴定。 大肠菌群包括埃希菌属和肠杆菌科，发酵乳糖产酸，菌落大肠菌群包括埃希菌属和肠杆菌科，发酵乳糖产酸，菌落 颜色粉红或红色。颜色粉红或红色。 肠道致病菌、非发酵菌包括沙门、志贺、假单胞菌属、不肠道致病菌、非发酵菌包括沙门、志贺、假单胞菌属、不 动杆菌属等。不发酵乳糖，菌落颜色透明或半透明。动杆菌属等。不发酵乳糖，菌落颜色透明或半透明。 细菌的初步鉴定 一、判断溶血一、判断溶血 溶血：不完全溶血，主要有草链、肺链（湿润、脐窝状溶血：不完全溶血，主要有草链、肺链（湿润、脐窝状 、OPOP阳性）、粪肠、屎肠等。阳性）、粪肠、屎肠等。 溶血：完全溶血，主要有金葡、溶葡、甲型溶血：完全溶血，主要有金葡、溶葡、甲型/ /乙型链球乙型链球 菌、铜绿、大肠、李斯特菌、芽孢杆菌（污染）等。菌、铜绿、大肠、李斯特菌、芽孢杆菌（污染）等。 溶血：不溶血溶血：不溶血 二、观察菌落形态二、观察菌落形态 革兰阴性杆菌：菌落较大、湿润、扁平、部分有特殊气味革兰阴性杆菌：菌落较大、湿润、扁平、部分有特殊气味 （大肠、铜绿）；革兰染色阴性。（大肠、铜绿）；革兰染色阴性。 革兰阳性球菌：菌落较小、干燥、凸起、部分有特殊气味革兰阳性球菌：菌落较小、干燥、凸起、部分有特殊气味 （葡萄球菌属）；革兰染色阳性。（葡萄球菌属）；革兰染色阳性。 细菌的初步鉴定 三、生化鉴定三、生化鉴定 革兰阳性菌：革兰阳性菌： 触酶阳性：葡萄球菌属、李斯特菌属等。触酶阳性：葡萄球菌属、李斯特菌属等。 触酶阴性：链球菌菌、肠球菌属等。触酶阴性：链球菌菌、肠球菌属等。 凝固酶阳性：金葡、施氏葡、中间葡等凝固酶阳性：金葡、施氏葡、中间葡等 凝固酶阴性：表葡、溶葡、头葡等，致病力弱，需连续检凝固酶阴性：表葡、溶葡、头葡等，致病力弱，需连续检 出才能确定为致病菌。出才能确定为致病菌。 革兰阴性菌：革兰阴性菌： 氧化酶阳性：假单胞菌属、弧菌属、气单胞菌属、产碱杆氧化酶阳性：假单胞菌属、弧菌属、气单胞菌属、产碱杆 菌属、奈瑟菌属等。菌属、奈瑟菌属等。 氧化酶阴性：埃希菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、沙门、氧化酶阴性：埃希菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、沙门、 志贺菌属等。志贺菌属等。 氧化酶不定：洋葱、流感等。氧化酶不定：洋葱、流感等。 值得注意：嗜麦芽氧化酶阴性。值得注意：嗜麦芽氧化酶阴性。 培养结果的判读 有意义： 合格痰标本培养优势菌中度以上生长(+)，结合临床症 状判断（+）； 合格痰标本少量生长，但与涂片镜检结果一致(肺炎链球菌 、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌)； 3d内多次培养到相同细菌； 涂片革兰染色镜检发现典型肺炎链球菌、流感嗜血杆菌之类 的苛养菌，即使培养阴性，也有重要参考意义。 培养结果的判读 无意义： 痰培养有上呼吸道正常菌群(如草绿色链球菌、表皮葡萄球菌、 非致病奈瑟菌、类白喉杆菌、念珠菌等)； 痰培养为多种病原菌少量(+)生长； 不符合上述可确诊或有意义检测结果中的任何一项; 对革兰阴性杆菌培养和涂片均阳性时才有意义，仅培养阳性而 涂片阴性则大多属污染菌或低浓度定植菌。 病例病例分析分析1 1 某患者，呼吸道感染，亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦长期 使用，疗效不理想 痰涂片：大量WBC吞噬G+球菌，偶见G-杆菌，G+球 菌与G-杆菌数量约100比1 培养：生长大量铜绿假单胞菌，药敏显示亚胺培 南,头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、