生物化学课件_1

蛋白质 蛋白质的分类和性质 蛋白质的分离和纯化 蛋白质的结构 蛋白质的分离和纯化 蛋白质的分离 蛋白质的纯化 重点掌握 蛋白质分离纯化的基本方法 蛋白质的分离 （一）细胞破碎： 研磨、超声、冻融、酶解等方法 。 （二）抽提 根据蛋白质的溶解性用适当溶剂来抽提，总的原则是 要制备的蛋白质溶在什么溶剂中就用什么溶剂来抽提。 （三）分离 离心-除去固体杂质 盐析/等电点沉淀/有机溶剂沉淀-得到蛋白粗制品 蛋白质的纯化 1.1.根据根据分子量分子量大小不同大小不同 透析透析 离心沉降离心沉降 凝胶色谱凝胶色谱 2.2.利用利用溶解度溶解度不同不同 等电点沉淀等电点沉淀 盐析盐析 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 3.3.根据根据电性质电性质不同分不同分 离离 离子交换色谱法离子交换色谱法 电泳法电泳法 4. 4. 根据根据吸附性质吸附性质不同不同 吸附色谱法吸附色谱法 亲和色谱法亲和色谱法 根据分子量大小不同- 1. 透析（dialysis) 原理： 蛋白质大分子不能通过半透膜，其他 小分子（无机盐、氨基酸、单糖、小肽等） 可以通过半透膜。 将要纯化的蛋白质溶液盛入半透膜袋 内放在水中，让无机盐等小分子物质扩散到 水中去而除去。 书中图3.8 根据分子量大小不同- 2. 离心沉降 （最常用的蛋白质分离方法） 原理原理： 当物体围绕一中心做圆周运动时，运动 物体受到离心力的作用。旋转速度越高 ，运动物体受到的离心力越大。在相同 的转速下，容器中不同大小的高分子溶 质会以不同速率沉降。经过一定时间的 离心操作，就可实现不同物质的分离。 2. 离心沉降 （高速 60,000rpm) 控制不同的离心速度，可以分离蛋白质 蛋白质颗粒沉降速率取决于 离心机转速 蛋白质颗粒大小、分子形状 溶液密度、性质等 凝胶色谱（也称体积排阻色谱、分子筛色谱） 凝胶颗粒特性：多孔网状结构 分离机制： 比凝胶网孔大的分子不能进入网孔，先流出 比凝胶网孔小的分子能进入网孔，后流出 常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex）常用 琼脂糖凝胶(商品名因生产厂家而不同) 聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP) 根据分子量大小不同- 思考题思考题 以下蛋白质混合物用Sephadex G-200凝 胶色谱分离，将以何顺序被分别洗脱下来 ：肌红蛋白（相对分子质量=16 000）， 过氧化氢酶（相对分子质量=500 000）， 细胞色素C（相对分子质量=12 000）， 胰凝乳蛋白酶原（相对分子质量=26 000 ），血清白蛋白（相对分子质量=65 000 ）。 注: Sephadex G-200颗粒孔径排出相对分 子质量高限为200 000） 答案 过氧化氢酶（相对分子质量=500 000） 血清白蛋白（相对分子质量=65 000） 胰凝乳蛋白酶原（相对分子质量=26 000） 肌红蛋白（相对分子质量=16 000） 细胞色素C（相对分子质量=12 000） 等电点沉淀 利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特 性，可以调溶液的pH，尽量接近它的等电点， 而使蛋白质沉淀。 利用溶解度不同的分离方法- 盐析法 原理：在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐 ，表面电荷被破坏，使蛋白质沉淀下来。 常用的中性盐为(NH4)2SO4。 不同蛋白质所带电荷不同，水化程度不同， 盐析时所用盐浓度不同，可以将不同的蛋白质分 离。 利用溶解度不同的分离方法- 有机溶剂沉淀法 蛋白质溶液中加入与水互溶的有机溶剂（ 乙醇、甲醇、丙酮）等，溶剂破坏蛋白质 的水化层，使蛋白质溶解度降低。 有机溶剂浓度过高，蛋白质会变性， 需要注意，在低温下进行。 利用溶解度不同的分离方法- 根据电性质不同分离- 离子交换色谱 离子交换树脂 阳离子交换树脂 阴离子交换树脂 (活性基团是 酸性的) CM(羧甲基)-常用 DEAE二乙基氨乙基 磺酸基-SO3H(强酸型) 羧基-COOH（弱酸型） (活性基团是 碱性的) 季胺基- N+(CH3)3OH- 离子交换色谱 pHpI 负电荷 差异越大，带电荷越多，与树脂结合能力 越强。 洗脱：以带正电荷的蛋白质为例，用 NaCl梯度洗脱，通过Na+离子的交换作用 ，可以将带有不同正电荷的蛋白质分离。 思考题 含有乳清蛋白(pI=4.6),乳球蛋白 (pI=5.2),胰凝乳蛋白酶原(pI=9.5)的溶液 用二乙胺基乙基纤维素(DEAE-纤维素 )pH为5.4时的层析柱分离.然后用pH为 5.4的缓冲液洗脱,缓冲液中盐浓度逐步增 加,预测三种待分离蛋白质组分的洗脱顺 序 答案 在pH为5.4时,DEAE-纤维素带正电荷,胰胰凝乳 蛋白酶原(pI=9.5)带正电荷,不与DEAE-纤维素 结合,先流出. 乳球蛋白(pI=5.2)带少量负电荷,与DEAE-纤 维素结合力弱,随着缓冲液中盐浓度增加,被置 换下来 乳清蛋白(pI=4.6)带大量负电荷,与DEAE-纤维 素结合紧密,只有当缓冲液中盐浓度很高时才可 被洗脱下来.或者降低缓冲液pH值,使乳清蛋白 所带负电荷减少,才可被洗脱下来. 思考题（p82.7) 将门冬氨酸(Asp,pI=2.98),甘氨酸 (Gly, pI=5.97)，苏氨酸 (Thr,pI=6.53),亮氨酸(Leu,pI=5.98)， 赖氨酸(Lys, pI=9.74)溶于pH3.0柠檬 酸缓冲液中，加到用同样缓冲液平衡 的Dowex-50阳离子交换树脂柱上。 然后用缓冲液洗柱，并分部收集。这 五种氨基酸将以什么顺序从柱上洗脱 下来？ 思考题 答：门冬氨酸(Asp,pI=2.98),苏氨酸(Thr,pI=6.53), 甘氨酸(Gly, pI=5.97),亮氨酸(Leu,pI=5.98),赖氨酸 (Lys, pI=9.74) 考虑1.带电荷情况；2.测链基团的极性 苏氨酸中带有-OH 亮氨酸比甘氨酸非极性强 增加缓冲液pH值或离子强度后，Lys才能洗脱下来 外电场作用下，带电粒子向着与其电性 相反的电极移动，这种现象叫作电泳。 电泳分离蛋白质原理： 不同蛋白质相对分子质量不同，所带电荷不 同，蛋白质在电场中移动速率不同。 V-蛋白质在电场中移动速率 E-电场强度 q-蛋白质所带净电荷 f-介质的摩擦系数，取决于蛋白质颗 粒大小 根据电性质不同分离-电泳 思考题 在电场中，下列蛋白质将向那个方向移 动（阳极、阴极或固定不动）？ (a)卵清蛋白 (pI=4.6)，溶液pH5.0 (b)pH为5.0及7.0时的-乳球蛋白 (pI=5.2) 思考题答： (a)卵清蛋白，pH5.0pI, 蛋白质带负电 荷，向阳极移动 (b) -乳球蛋白 pH5.0pI, 蛋白质带负电荷，向阳极移 动 思考 血红蛋白A的等电点pI=6.9,变异血红 蛋白M中链6位的Glu(谷)残基取代了 正常血红蛋白A该位置上的Val(缬)残 基。这种取代使血红蛋白M在pH=7.5 时的电泳行为发生怎样的改变？ 镰形细胞贫血的遗传病 答： pH=7.5时血红蛋白A带负电， Glu残基取代后使负电荷增加，向阳 极泳动速度加快 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（ SDS-PAGE） SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子型表面活 性剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋 白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质 分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得 无足轻重了，Eq值接近常数，所以在电场上移动 的速度完全取决于蛋白质分子的大小。 吸附色谱法 吸附法是利用各种吸附剂和蛋白质结合能 力（吸附能力）的不同来分离蛋白质。 固定相（吸附剂）：结晶磷酸钙 流动相（洗脱液）：不同浓度、不同pH的磷酸缓 冲液 根据吸附性质不同- 亲和色谱 高效分离纯化蛋白质的方法。 原理原理：不同蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具 有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊 识别和结合作用的配基，应用化学方法将该配基与载体共 价连接。将这种连接有配基的载体装入色谱柱中，当含有 待纯化的蛋白质溶液通过色谱柱时，该蛋白质与配基发生 特异性结合而被吸附在色谱柱上，其他蛋白质流出柱外。 被特异结合的蛋白质用适当配体洗脱液洗脱。 根据吸附性质不同- 亲和色谱 常用配基： 抗体、抗原、激素、受体蛋白 色谱柱载体： 琼脂糖凝胶 蛋白质结构 一级结构、二级结构、三级结构和四级结构 多肽链氨基酸顺序分析 蛋白质的结构 蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊 方式组合而成。当多肽的分子量大到足够 具有一定的空间结构时就称为蛋白质。 蛋白质与多肽的主要差别： 分子量，空间结构 蛋白质结构 一级结构 三维结构 蛋白质的一级结构（primary structure） 1定义： 蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目、 多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数 目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质 生物功能的基础。 蛋白质氨基酸顺序的改变，不仅影响蛋白质的高 级结构，而且将直接影响其生理功能。 蛋白质一级结构氨基酸顺序 镰形细胞贫血的遗传 性疾病，特征是病者的血 红蛋白发生变异。 变异的血红蛋白与正 常的血红蛋白差异是在一 条多肽链上第6位的Glu被 Val替代。由于Glu与Val 在形成氢键上的差异很大 ，变异蛋白质的空间结构 变化显著，水溶性降低， 血液粘度增大，导致贫血 症状。 蛋白质氨基酸顺序的改变会引起异常功能或病变。 2蛋白质一级结构的测定 胰岛素的一级结构 1952年英国生化学家Sanger首次测定 结构特点： 1. 由51个氨基酸残基组成 2. 分两条链： A链：21个氨基酸残基 , B链：30个氨基酸残基 3. 含三个二硫链： 一个A链内的二硫键,两个链间二硫键 蛋白质一级结构的测定步骤 1.肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的量与蛋白 质相对分子质量之间的关系,确定多肽链的数目. 2.多肽链的拆分:加入盐酸胍,解离非共价力,过氧酸 氧化或巯基还原法拆分二硫键. 4.测定多肽链氨基酸顺序 3.测定多肽链氨基酸组成:酸水解,测定计算各 种氨基酸分子比. 多肽链氨基酸顺序分析多肽链氨基酸顺序分析 1.多肽链的选择性降解 酶解法: 胰蛋白酶 化学法: CNBr水解 2.多肽链末端氨基酸的测定 二硝基氟苯(DNFB)法: N端 丹磺酰氯法:N端 阱解法:C端 3.Edman氨基酸顺序法: N端 酶解法 带正电荷的氨基酸 R1-Lys-Ala-R2 R1-Lys-COO- + NH3+-Ala-R2 胰蛋白酶 Rm Rn Rn 预测端基氨基酸类型 思考题 用胰蛋白酶处理下列小肽，会断裂成什么 样的肽片断？ Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Arg-Ser-Gly 答案 Ala-Ser-Thr-Lys Gly-Arg Ser-Gly 思考题 今有一个九肽，分别用（1）胰蛋白 酶（2）胰凝乳蛋白酶（3）羧肽酶（4） 溴化氰处理，试用箭头及号码表示出它们 对肽键作用的位置。 Leu-Met-Arg-Pro-Ala-Lys-Tyr-Ser-Arg 化学方法 溴化氰（CNBr）水解法: 选择性地切割由甲硫氨酸(Met)形成的肽键 高丝氨酸内酯 思考题 一个肽用CNBr切成两个小肽段，又 用胰蛋白酶切成另外两个小肽段。 CNBr1, Gly-Thr-Lys-Ala-Glu CNBr2, Ser-Met 胰蛋白酶1, Ser-Met-Gly-Thr-Lys 胰蛋白酶2, Ala-Glu 推断该多肽的氨基酸顺序. 答案 Ser-Met-Gly-Thr-Lys-Ala-Glu 末端氨基酸分析： 包括N端分析，C端分析 N端分析方法 二硝基氟苯（DNFB)法 DNP-氨基酸（黄色） 酸性水解 丹磺酰氯法N端分析方法 丹磺酰氯 丹磺酰氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度高 肼解法C端分析方法 阱化物能与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C -端氨基酸分离. Edman氨基酸顺序分析法N端分析方法 异硫氰酸苯酯 特点：不断重复循环，将肽 链N-端氨基酸残基逐一进行 标记和解离。 PTH- 苯乙内酰硫脲 蛋白质的空间结构（三维结构） 天然活性蛋白质都有稳定的三维结构。一 旦这种三维结构遭到破坏，即使一级结构 不变，蛋白质的生物功能也会完全丧失。 具有独特的三维结构是蛋白质区别于普通 有机分子最显著的特征。 1.蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构是指肽链的主 链在空间的排列。只涉及肽链主链的 构象及链内或链间形成的氢键。 多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳 原子相隔。而C-C键和C-N键是单键，可以自由旋转， 因此，在保持肽键平面结构不变的条件下，能够形成不同 的空间排列。 维持主链空间排列的另一个重 要因素是氢键。 主链中的-C=O和-N-H-能够相 互形成链内或链间的氢键。 蛋白质二级结构主要有： （1）-螺旋 （2）-折叠 （3）-转角 (1) -螺旋 1950年美国Pauling等人发现 -螺旋是蛋白质中 最常见的二级结构。 主链按右手方向盘 绕成螺旋形，相邻螺圈 之间形成链内氢键。 (2) -折叠 -折叠主链骨架以一定 的折叠形式形成一个折叠的 片层。 在两条相邻的肽链之间 形成氢链。几乎所有的肽键 都参与了链间氢键交联。因 此，结构牢固。 (3) -转角 由第一个氨基酸残基的C=O与第四个 氨基酸残基的NH之间形成氢键。 不稳定的环状 结构，主要存 在于球状蛋白 分子中。 2. 蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上， 多肽链再进一步折叠盘绕成更复杂的空间结构。 三级结构主要靠非共价键来维持。包括氢键 、疏水键、离子键、范德华力等。 1963年Kendrew等通过肌红蛋白的x-射 线衍射分析，测得了为它的三级结构。 蛋白质的四级结构 具有三级结构的多肽按一定的空间排列方式 ，通过非共价键缔合在一起形成蛋白质大分 子。 蛋白质一级结构和高级结构 之间的关系 蛋白质的高级结构是在一级结构的基础上形成 的，因此，一级结构的改变必然影响到它的高 级结构。 -螺旋的形成及其稳定性取决于它的氨基酸组 成和排列顺序。氨基酸残