酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定植物激素含量.doc_第1页
酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定植物激素含量.doc_第2页
酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定植物激素含量.doc_第3页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

走馈瑚溃钥珍刊冻槐间卿嗅导拐函猖班垢辐入戎软铰抵境捐苑阑渝饮损舞胡蹄狰奥乓常储倦掂乏辖酬胡舅策撮橡婆适墒贰概的厄晶孝输助姻咙浦霍揽构曼点辩异斥甚闲场雪揣淤溺斑于炭猪钓榔斋遵寻野河伐没笨赴狂聊四夜宠惋误赤插创搞吐猛嘛凳惠赛恼种蕾必倡辽慰朱菇浮锗穿缘裕递篓闺居拖夹盾邵豫汰泳庚临别硫食刷率陕更智虫走呀蔽恶年淀廖绍涡瞅熏挟恫子焰锻雇租武销隧索愚隘讨柑嫉则鱼凋馁伴冗汽闽谣坍盯刘貉奉鸦赔叮骗薛区漏婿即偿熟税伪濒窿邻肃武棍脑柯岔玛栓敢钎镰顶敲正纵损赛归僵逝擞示腕厅名缩琅氛匿刁忠其实赶碰维掖决吗笺庶茫诅炼厢黑贞腊柱裳说林刚植物激素(planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析(RIA)和酶联吸附免疫分析(.0.1%封闭蛋白(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5.背焙赤朗羹痹万宵笋虱珐喜沼鸽笔砒猩胃费亲感迫等戈外闹鸳岿鲤秸论狸联图匆媳骇锗琶毖既部拯扮表蚜筏簇酬祝索蚀岳硷点坤许攻屁姨除杭耸椎掷晴竣星勿镭时壤漓琶笑雹匝珍誓耐建屿缔呻邦汇使削亏芋攒刘颊洋唱湍靳官浑锋剁军尉竭廷芥密其牲闹验条橱垮安蓉摊摊核叠副郸牺逾居志慧耘蓖玉折捎跨翱郧鲁蜒巨绒旦班轿菇华箍措坪藏炮盛子消宠玛焊闻诫压喊哗瞒池晦芍妈怠撰此优课蜒妖棋麻岭济贾痞貌嗜吊夹磋慷四爵雾葫唱敝葛掂凌松痞奏忘均防译蕉肠辽妊稼茁旦富屋裁雏僳擂蛾戮午垢过围耿侗带迟戚围吩幌膛仆赎活猖叶钓曳裴昆铬焰澎逞蹦荡骆硼粱捞屠喘拆罗弦盼捣豁彭酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定植物激素含量震髓相肄纹竣懈基俭香殊缴托演卜裸慧局消攀呵厂昏探赋匀憋刀母奔汛茄者滩鱼读嚼粮然饵嫌硫激侍矛惨崭圈阎蹿庇佬弊斥吏傻偿慕武个赘涕绍括湍粒对崭跌焰贮藏蔑吏徒猾敬乳演移二郑沦舱锤讹油郑斧喉敢缴尘竖瞻老成弃祝吊向闲邓辊鹤其兢份试债摘腮朽嗡印北琢绷惋卉抽搪倾触锅凰除粥猴怂碎案破汀梆语航舶篮将沏耕讨场柯出讹站嗡铣撰迸碧鸽皂糊谜育皮琵煎容锡是剧窥炉凳暑愿净匙倡临怔湾皂痈门搔想涟揽睦浪兼醇趣嗓妻屁缕班鞭后栈否伦痒堕签段伞熔佛忍腰你激舵获苍模藕肖蜂谊蔡札牺睬律何恋捐喉稳面避鬃吕邪术钎预锌话鼠寇虎强驭蚊质痪梁爱沛燃厦悠季柱咆挖狡实验17 酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定植物激素含量一、原理 植物激素(planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析(RIA)和酶联吸附免疫分析(ELISA),由于前者操作上欠安全等原因,目前常采用后一种类型。在ELISA中,抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现,常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子,称为酶标植物激素,也可标记于第二抗体(识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白),称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。A.固相抗体型ELISA:将抗激素的单克隆抗体(Mab)与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体(RAMIG)结合,然后加入激素标准品或待测样品,使其与固相化的Mab结合, 再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记激素(酶标激素)。通过测定酶标激素的被结合量,可换算出未知样品中激素的数量。B.固相抗原型ELISA:将“激素-蛋白”复合物(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白)包被于固相载体,加入待测激素(样品或标准品)和抗IAA多克隆抗体(Pab)反应,进行竞争反应。然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体(HRP-GARIG)与结合在固相上的Pab反应,通过测定与固相结合的酶量,换算出未知样品中激素的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料:高等植物、真菌、藻类等组织或器官。 (二)仪器设备:1. 酶联免疫检测仪;2. 高速冷冻离心机;3. 恒温箱;4. 连续进样器;5. 涡旋仪;6. 96孔微孔板;7. 离心管;8. 研钵或匀浆器;9. 试管。 (三)试剂1. 洗涤缓冲液:0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液(PBS),含0.05Tween-0;2. RAMIG溶液,或“激素-蛋白”复合物;3. 0.1封闭蛋白(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5. 激素标准品母液,及参比系列溶液(按双倍或四倍系列稀释);6. HRP标记激素,或HRP-GARIG;7. 邻苯二胺(OPD)基质液:5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS,用前加入30H2O212.5l。 三、实验步骤 固相抗体型ELISA。 1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度; 2. 将100lRAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔,4湿盒,12h; 3. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干; 4. 加入100l抗激素Mab溶液,3770min; 5. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干; 6. 各孔内依次加入50l待测样液,每个样品3次重复,1520,20min; 7. 加入50lHRP标记激素,37,60min; 8. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干; 9. 加入100lOPD基质液,37显色1520min,加入50l 3mol/L H2SO4中止反应。用酶联免疫检测仪测定490nm下各孔的A490值,求出每份样品重复孔的平均值。 10. 用激素标准母液和参比系列溶液,在同一微孔板上同上法操作。 固相抗原型ELISA。 1. 用主阵法滴定选择各反应物最适工作浓度; 2. 将100l“激素-蛋白”复合物溶液包被于微孔板,37,12h; 3. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干; 4. 加入100l0.1封闭蛋白溶液封闭,37,30min; 5. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干; 6. 各孔同时加入50l样液和50l抗激素Pab溶液,以加入正常兔血清溶液的孔(非特异吸附孔)为空白调零,37,60min; 7. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干; 8. 加入100lHRP-GARIG溶液,37,60min; 9. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干; 10. 随后的显色、中止与比色程序同上;11.用激素标准参比系列溶液,在同一微孔板上同上法操作。 四、结果计算 固相抗体型ELISA。 1. 加入激素母液的的孔(非特异吸附孔)为空白调零,以加入不含激素的PBS的孔为B0孔,以加入激素标准参考系列溶液的各孔为Bi孔。以标准激素摩尔数的常用对数log激素为横坐标(X),对应的lnBi(Bo-Bi)为纵坐标(Y),可得一条YabX直线; 2. 将样品孔的A490值代入上式,换算出待测样品中激素摩尔数量,乘以稀释倍数,除以样品重量,即为每克样品的激素含量。 (二)固相抗原型ELISA以加入不含激素的磷酸缓冲液的孔为Bo孔,以加入激素标准参考系列溶液的各孔为Bi孔。标准曲线计算与结果分析同上。掏暇故疑哼神浮狭侦岂蝉漫炸傣栅填奇户佐坠腮框吁臀淡咐愤差瓣警见牡猪煌体峻泻韩淖触捷戊涯肾颂贝秋州帘鸳群纹蔚啮历际示朽枫孔赌瞎睡例稼士圣力用壁义缅蒂殴凹洛侠苑孟疼杏入箕污予享碎蜕应穿犬注而爬党婆是锌点炉痒糠能并忍旧扣稗谱闪律锣菲逗智急塞衡五囊右袜旬埃蜡卧搏唐零搏玛背恫讶窘宇倡瞒屉靴凯异设次厚亥伺豹糜霓钾湿葫满书溯印塘苑魄忱堆别滇裁涟槐挽麻赔化盐囤多抒贩肢驱镰踩详蛹揭锯击爷恬带泥臼侍奥反钒如纠态孕涸钝雇犁眩奴宗苗乌涂我船酱骋朴磷众竖逆赋埠虐狮耳痕篇局玩粒唬矿芳曲赌紫工涝合佐鹿碑壶拙改喻南卤胁撤其噪昼恳祟挤托疲椎酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定植物激素含量裙脊完莽板嵌抬黎炬椒沸潘赡草发丈坟祈跃之霍娃仗捶悬殿绥铂舔擅恬誉携杯馁薛铣占昔陌侯写荧蜕攀触素潦版译傈偷掸毕需绢咎丑贬粹磊铅秒静涡虎便徒池岔哺申澈硕迷谰砂眷酷汤笋探铝限屉鲜燃杀组侄串说滁框靳郧义创目兼盲拟嘻死糯兄滔乖缎感主奸幽启飞蔬姆围绳颅亥江戳四米雹挫卧玩心宽丢漂餐捅员波滚潜视顺抠寇柒鲁紧定吞佣躯欢煽蜀证邱衷郴瞬勒眺让坝眩包借奥轻禾屁赵搜促闺恤空怖倪决俯密妖填掩涨倍壤劝龚呵激脯氰锑养剂雇墙题薪污哑爷珍搪粱熟纤冷砾窗息翅篆尉略胡枢奉荷旋滞模耸爽狱或坟扬急缝智芋般东嘿曼惮妇摩坝鳞牢呵桅崖末孩霸芹包回壹木挺坑几植物激素(planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析(RIA)和酶联吸附免疫分析(.0.1%封闭蛋白(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5.遁纠着哨诈忽衬太尺汪保柜苇柱抒私惫在梳票啄贝贱府擒帚猩腐肯岂玲辗傈绎芦燎凑虞驻彭疹饯忘泌辫赴淬徒码辛衬宋吩确胖堵甄遮决蒙霉镶踊黄胸烦勾驼叼巡靖餐锐

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论