全反式维甲酸诱导人胆管癌细胞凋亡的作用.doc

精品论文，值得推荐全反式维甲酸诱导人胆管癌细胞凋亡的作用 【关键词】 维甲酸 关键词: 维甲酸;胆管癌;细胞分化;脱噬作用 摘 要:目的 研究全反式维甲酸（ATRA）对胆管癌细胞的生长的影响. 方法 应用台盼蓝染色、MTT法、光镜、透射电镜及流式细胞仪等检测ATRA对体外培养的人胆管癌细胞株QBC939细胞的诱导凋亡作用. 结果 不同浓度的ATRA对QBC939细胞的增殖均有抑制作用，且量效关系明显.但大剂量则主要导致细胞坏死，以10mol L-1 ATRA的作用效果最好.QBC939细胞经10mol L-1 ATRA处理7d的增殖抑制率可达到60%.光镜及透射电镜下可见细胞恶性表型向正常发生逆转，并可观察到凋亡小体.流式细胞仪分析显示，ATRA处理组细胞周期延迟10%，G1 期比例明显升高50.5%，S/G2 期比例分别下降39.8%和11.4%. 结论 A-TRA可抑制胆管癌细胞的增殖，并诱导癌细胞凋亡. Keywords:tretinoin;cholangiocarcinoma;cell differentia-tion;apoptosis Abstract:AIM To study the effects of all-trans retinoic acid on human cholangiocarcinoma cells.METHODS Benzo blue，MTT，scanning and transmission electronic microscop-ic technique and flow cytometric analysis were used to study the all-trans retinoic acid-induced apoptosis in human cholan-giocarcinoma cell line QBC939.RESULTS Different concen-tration of all-trans retinoic acid could inhibit the proliferation of human QBC939cell，which had obvious dose and time ef-fect，but treatment with high dose would induce cell necrosisprincipally，and the appropriate concentration of all-trans retinoic acid was10mol L-1 .After treated with all-trans retinoic acid at10mol L-1 for7d，the proliferation in-hibitory rate of QBC939cells was about60%.Apoptosis was observed through scanning and transmission electronic micro-scope.Flow cytometric analysis demonstrated that the cell cycle of QBC939cells was prolonged by10%after using10-5 mol L-1 all-trans retinoic acid.The G0 /G1 proportion of the cell cycle was significantly increased by50.5%，and the S and G2 here reduced by39.8%and11.4%respectively.CONCLUSION All-trans retinoic acid could suppress the growth and also induce the apoptosis of cholangiocarcinoma cells. 0 引言 全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）对某些肿瘤细胞具有增殖抑制作用1 ，可使肿瘤细胞终末分化，并能诱导肿瘤细胞凋亡2，3 .我们以胆管癌细胞QBC939细胞为研究对象，探讨ATRA对胆管癌细胞生长的影响及其抗癌机制. 1 材料和方法 1.1 材料 ATRA购自Sigma公司，台盼蓝、四唑盐（MTT）胰酶购自宝泰克公司，PRMI1640购自Ha-clone公司，小牛血清购自杭州四季清公司.人胆管癌细胞株QBC939细胞，由第三军医大学肝胆外科建立，本室保存. 1.2 方法 人胆管癌细胞株QBC939在含150mL L-1 灭活小牛血清的RPMI1640培养基中，于50mL L-1 CO2 ，37条件下传代培养.取细胞制成单细胞悬液，计数后备用.将细胞以3103 孔-1 接种于96孔板，培养24h后加入含100，10，1，0.1mol L-1 A-TRA的培养液，设空白对照组.每日台盼蓝染色，细胞计数板内计数，绘制细胞生长曲线. 1.2.1 MTT法 QBC939细胞接种于96孔板，每孔细胞均做10个复孔.10mol L-1 ATRA处理后，根据所需要于2，4，7d中止实验，终止培养前4h加入MTT20L，待细胞染色后以二甲基亚砜（DMSO）150L溶解，于酶联免疫检测仪测定A490nm 波长的吸光度（A值），计算细胞增殖抑制率. 1.2.2 细胞形态 实验组及对照组QBC939细胞培养3d后，胰酶消化，PBS洗涤、离心，30g L-1 戊二醛固定，光镜及透射电镜下观察. 1.2.3 流式细胞仪分析 QBC939细胞用10-5 mol L-1 ATRA处理后，经胰酶消化，700mL L-1 乙醇固定，-4保存备测.测定时加50mg L-1 PI染色，流式细胞仪分析细胞周期. 2 结果 不同浓度的ATRA均对QBC939细胞增殖有抑制作用，且随浓度增大，抑制作用越明显（Fig1）.与对照组比较，1，2组P0.05;3，4组P0.01.但浓度为100mol L-1 导致坏死细胞明显增加，以10-5 mol L-1 抑制作用最理想. 图1 略 2.1 MTT法 10-5 mol L-1 ATRA处理QBC939细胞，于不同时间终止实验，MTT比色法检测其增生抑制率，2，4，7d分别为10%，35%，60%，呈现明显的时间依赖性（Tab1）. 表1 MTT比色法检测QBC939细胞增生结果略 2.2 细胞形态学 QBC939细胞经10mol L-1 A-TRA作用24h后，光镜下见细胞生长缓慢，细胞间隙变宽，消化时间缩短，形状由长梭形变为圆形或椭圆形;透射电镜下见细胞核内染色质固缩，成块状或半月状;细胞质浓缩，分泌空泡增加，核蛋白减少，细胞器结构基本完好，溶酶体、内质网较对照组减少;部分细胞裂成碎片，形成细胞质膜包被的许多大小不等的凋亡小体（Fig2）. 图2 略 2.3 流式细胞仪分析 10mol L-1 ATRA作用不同时间，处理组细胞周期延迟，G0 /G1 期比例明显增高，S，G2 +M期下降，导致DNA合成障碍，抑制细胞增殖，触发凋亡（Tab2）. 表2 细胞周期流式细胞仪分析结果略 3 讨论 许多抗肿瘤药物均能诱导肿瘤细胞凋亡4，5 .维甲类化合物能抑制多种肿瘤，诱导肿瘤细胞凋亡.已被用于肿瘤的防治的多方面研究.全反式维甲酸是第一代维甲类化合物.本结果显示，用不同浓度的ATRA处理胆管癌细胞，可以发现在一定剂量范围内，QBC939细胞的增殖呈现浓度和时间依赖性，10mol L-1 ATRA作用效果最显著.我们发现，QBC939细胞经10mol L-1 ATRA作用7d，其增殖抑制率可达60%.ATRA可使细胞的某些表型发生转化，诱导细胞凋亡.我们发现，光镜下细胞形状变化，胞核浓缩深染，细胞间隙变宽，生长缓慢.电镜下可观察到凋亡小体.流式细胞仪显示，ATRA主要作用在G1 期和S期，G1 期制造产生rRNA，mRNA，tRNA及核蛋白体，S期是细胞DNA合成期，G1 期和S期比例减少，导致QBC939细胞周期延迟或阻滞，DNA合成发生障碍，从而抑制胆管癌细胞生长触发凋亡机制. 参考文献: 1Zhou HG，Gu GW.Retinods preventing liver cancer J.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi（World Chin J Digestol），1999;7（1）:82-83. 2Yang SX，Wen Y，Zhang XJ，Wang LL，Zhang XB.Growth in-hibiton and apoptosis of human bladder cancer cell line T24in-duced by all-trans retinoic acid J.Zhongliu Fangzhi Yanjiu（Cancer Res prev treat），2000;27（5）:335-337. 3Shao CH，Zhu F，Yan W，Zhao ZL，Cai YB，Wang CJ，Shao GX.Cloning of apoptosis-related genes from prostate cancer cell line DU-145induced by all trans retinoic acid J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:757-761. 4Lu JG，Lin CH，Huang ZQ，Wu JS，Fu M，Zhang XY，Liang X，Yao X，Wu RW.Inhibitory effects of recombinant aden-oviruses p53transduction on human cholangiocarcinoma cell line J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:764-766. 5Lu JG，Lin CH，H