《蛋白质的研究方法》PPT课件.ppt

1,高 级 生 物 化 学,暨南大学医学院生物化学系 宇 丽 2011、11,2,蛋白质的研究方法 第一节 蛋白质对象的选择和样品的获取,3,一、研究对象的选择 无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子； 在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链结构，但在分子大小、极性以 及电荷上会有所差异。,4,选择研究蛋白质的原则： 在组织中含量比较高 相对比较稳定的蛋白质（如血液中的Hb；肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等） 从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体 内都还有大量的蛋白质（50左右）从来没有被研究 过。,5,获取蛋白质样品的方法： 直接从生物组织中提纯蛋白质为主 根据基因组测序获得的信息 （1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。 （先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获得有关的抗体， 然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象 蛋白） （2）去获得有关基因的cDNA全序列，然后通过重组DNA 技术去表达重组蛋白。 有偏差，甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的RNA 加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。,6,直接从生物组织中提纯蛋白质 应用各种分辨效果好的化学及物理化学方法 蛋白质的分离纯化包括以下过程： 破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质 抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶； 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。,7,制备过程中注意事项： 要求自始至终保持在天然状态 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。 2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。,8,二、细胞的破碎 少数蛋白质-存在于细胞外面的（如血液和体液中等）， 大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。 一般固形生物材料首先都必须加以破碎， 以释放出细胞内的蛋白质组分。 生物材料 必须新鲜 1. 材料 -80 2. 或者制成干粉（丙酮） 3. 低温存放,破碎的方法： 机械破碎法：利用机械力的搅切作用，使细胞研碎 高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、 玻璃珠高速匀浆器以及静压器（高压破碎）。 2.渗透破碎法：利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。 红血球放于水中，便发生自溶。 3.交替冻融法：生物组织经冻结后，细胞内液结冰 膨胀，而使细胞胀破。 4.超声波法： 利用超声波震荡，使细胞膜上所受张 力不均而解体。 5.酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等 对细胞膜或细胞壁的分解作用，使它 们解体,10,*抽提作用： 生物材料在破碎的过程中，通常被浸在 适当的缓冲液中，使细胞中的蛋白质等内容 物释放到这种溶液中去。,膜蛋白的处理：复杂,细胞膜的结构,12,按其所在位置大体可分为： 两种类型 外周蛋白（通过次级键和外膜脂质的极性头 螯合在一起） 固有蛋白（嵌合在膜双层中，它通过疏水作用 与膜内部脂质层的疏水性尾部相结合 具有螺旋结构） 外周蛋白-选择适当离子强度及PH的含有EDTA的 缓冲液抽提（高盐溶液） 固有蛋白-？,13,*增溶作用： 抽提固有蛋白质时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的天然状态，这一过程通常称为增溶作用。,14,常用的增溶试剂有： 有机溶剂-易使蛋白质变性 离液性离子-CN-、CIO4-及I-等虽能削弱疏水 作用，也易使蛋白质变性。 磷酸酯酶-水解去磷酯，只适用于那些仅仅部 分插入双层的膜蛋白. 去污剂-同时包含有疏水和亲水部分. 按其结构特征:阴（阳）离子去污剂 两性离子去污剂 非离子型去污剂等。,去污剂： 一类具有 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性（amphipathic）脂类分子 作用： 既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有疏水性表面的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。,16,临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC)： 每一种去污剂都具有一特征性的CMC。 CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。 当去污剂低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。,17,有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电基团）如： 脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）和 十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）等； 有的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团，如： Triton X-100，辛基葡萄糖苷( octylglucoside）等。,18,离子化去污剂（SDS）： 作用： 其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构， 其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。 作用的结果是：使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性 蛋白）都发生完全变性，并溶解在水溶 液中，同时失去生物活性。 在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可以复性并恢复生物活性。,19,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）： 就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白 完全变性的特性。 这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。,20,非离子去污剂： 相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。 当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。 当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的形式存在。 一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性,22,23,稳定剂： 防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、 Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素破坏而 丧失生物学活性等。 处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂； 在低温下操作； 加入稳定剂(如甘油等）,24,细胞碎片的去除离心( centrifugation) 原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。 沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成； 上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞 抽提液中即上清中,25,三、目标蛋白质的分离、纯化 -蛋白质的分级沉淀和层析分离 将不同蛋白质分开的性质主要包括： 分子量的大小 带电情况 水溶性 与某种物质的特异高亲和力等,26,（一）蛋白质的分级沉淀 常用的方法有盐析法和有机溶剂法。 蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。 蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。,27,#,28,等电点（PI）： 1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子 PI能降低蛋白质在水中的溶解度，使Pr,29,盐析法 概念：蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度 有不同程度的降低，采用添加中性盐的方法 使各种蛋白质依次分别沉淀出来的方法。 优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低,30,1盐析基本原理 在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种 影响： (1)盐离子与Pr分子中的 极性基团 离子基团 作用 降低Pr分子的活度系数，趋使其溶解度 。 (2)盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活 度降低，导致Pr水合程度的减少，从而趋使Pr溶 解度 。,31,*盐溶（salting in)-当溶液中的盐离子强度比较低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而增加，这种现象叫做. *盐析（salting out )-但当溶液中的盐离子强度比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而降低，这种现象叫做 . 一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特异溶解度。,32,影响盐析作用的因素 （1）盐的种类 （2）PH和温度# （3）蛋白质浓度%,33,（1）盐的种类 对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力 也愈强: PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br -I-CNS- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 负离子价数较高的中性盐（如硫酸盐、磷酸盐等） 的Ks值常较一价中性盐的Ks值高。 Ks:盐析常数（价数较高时，Ks 值也较大）。代表盐析的效率， 是与Pr及盐种类有关 的特性常数。,34,硫酸铵（常用盐析剂） 优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。 缺点：缓冲能力较差 PH难控制#,35,（2）PH和温度 S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响: PH=PI时，S。的数值极小 S。随温度增加而减低。 盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。#,36,（3）蛋白质浓度 Pr较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。 Pr较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。 解决办法：对于高浓度的蛋白质 可以应用稀释作用来调节盐析浓 度界限，有利于混合物的分离。,37,蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。 但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释， 通常在2.53.0之间比较合适。,38,1.基本原理一 （1）在PI附近，Pr主要以偶极离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂有较低的介电常数，可使溶液 介电常数减小，增强了偶极离子间静电引力，从而使分 子集合而沉淀出来。 （2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也 促使Pr变得不稳定而聚集析出. Q1 Q2 库仑定律： F = 2 F：2个带电质点之间的相互作用力 ：2个带电质点之间的距离 ：介电常数,有机溶剂法 分辨力比盐析方法高，提纯效果好,39,溶剂 介电常数 乙醚 4.33 丙酮 21.4 乙醇 21 甲醇 33 水 -80 甘氨酸溶液 137 （2.5M） 在低的环境中，Pr上基团间的作用力会受 到影响, 超过限度时，使蛋白质变性。,40,解决办法： 1.有机溶剂沉淀一般都须控制在低温条件下进行。 2.添加甘AA，调节溶液中的介电常数不致过低， 创造合适的分离条件。 另：蛋白质本身是多价离子，对溶液介电常数 有相当贡献。 (当蛋白质浓度太低时，如添加有机溶剂过度 会产生变性现象，这时加入甘AA等物质，可 以避免蛋白质变性)。,41,2. 影响有机溶剂沉淀Pr的因素 （1） PH值 PH=PI时 蛋白质的溶解度最低。按PI来调节PH值， 有利于分离。 （2）蛋白质浓度 Pr越高，加入一定量有机溶剂后，Pr析出越多。 此时溶液的也相应提高，可以减少Pr的变性。 Pr越高,Pr分子间作用引起的共沉淀现象也显著 增强，这样分离效果差，不利于分级沉淀。 只有选择恰当的Pr才有可能获得良好的分高效果。,42,（3）离子强度 中性盐的加入能促使Pr在有机溶剂中溶解， 并且能防止Pr的变性。但含盐过多，却会使Pr 过度析出，不利于分级沉淀。 一般0.05M的稀盐溶液。 （4）多价阳离子 Pr与多价的阳离子如（ Zn2+、 Cu2+等）能结 合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使Pr 溶解度变小。,43,(二）蛋白质的层析分离法 （色谱法） 最基本的特征： 固定相 流动相,44,原理 各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时， 这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。,45,层析分离能力的实质物质的分配问题 *分配系数： 当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固 定相和移动相两相内的浓度之比是一个常数，这称为分 配系数。 C1 K = C2 *质量分配系数： 若不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示，则称为质 量分配系数即： Vs D= K Vm Vs : 固定相的体积 Vm : 流动相的体积,46,层析种类： 气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 按层析机理来分 离子交换层析 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析 层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA,47,离子交换层析法 *原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相） 填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。,48,固定相： 1.纤维素- DEAE纤维素、 CM纤维素 2.葡聚糖,49,纤维素 : 骨架为柔性长链 1.加入量-加入层析柱的蛋白质量通常纤维素量 的十分之一。 2.提高分辨率，样品体积应尽可能地少。 3.在洗脱时，可以通过改变洗脱缓冲液的PH， 而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也 可以通过提高洗脱缓冲液中离子强度，减弱 蛋白质分子与载体亲和力的办法，将蛋白质 组分逐一洗脱下来。,50,葡聚糖的离子交换树脂:骨架为三维网状结构 优点： 1. 同时具有分子筛的作用 2. 因其高度的网状结构，所带有的交换基团也比纤维 素多得多。交换容量为离子交换纤维素的35倍。 缺点： 它的床体积常受PH或盐浓度影响而变化，对分离 效果有一定程度的干扰。,51,凝胶排阻层析 又称分子筛或凝胶过滤（gel filtration） 原理： 载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。 当分子大小不同的混合物通过这种凝胶 柱时，直径大于孔径的分子将不能进入 凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出 （全排出）。较小的分子进入能容纳它 的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就 比较长。这样，较大的分子被先洗脱下 来，而较小的分子后被洗脱下来，从而 达到相互分离的目的.,52,53,54,用作凝胶的载体物质有三类： 交联葡聚糖凝胶 商品名为 Sephadex G 聚丙烯酰胺凝胶 商品名为Bio-gel P (丙烯酰胺 + N，N-次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P值表示不同的交联度) 琼脂糖凝胶 商品名为 Sepharose或 Bio-gel A （从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级成分 是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间重复结 合而成的链状化合物）,55,琼脂糖凝胶优点： 1.其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶好得多。 2.对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多 3.适用分子量的范围宽，最大可以到108。,56,凝胶排阻层析的应用： 1.作为分析工具 (分子量差别大的物质) 2.作为脱盐工具(Sephadex G-25) 3.高分子溶液的浓缩 (不稳定的高分子) 4.去除热原物质(DEAE-A-25) 5.物质的分离提纯 6.用于测定高分子物质的分子量,57,吸附层析法 原理：柱层析中，含有Pr分子的混合物随流动相通 过由吸附剂组成的固定相时，Pr分子通过各 种次级作用能够吸附在吸附剂上,由于不同分 子的吸附能力不同，可以通过洗脱使它们逐 一解脱出来，而使混合物得以分离。 优点： 1.物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也比较容易。 2.操作简便，吸附剂容易获得，价格较低廉,58,固定相： 吸附剂磷酸钙凝胶 磷酸钙胶Ca3（PO4）2 磷酸氢钙胶CaHPO42H2O 羟基磷酸钙胶Ca5（PO4）3OH 羟基磷灰石 磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理: 主要是由于 . Ca2+与Pr负电荷性基团 结合。 . 磷酸基团与Pr正电荷基团,59,流动相： 洗脱剂-柠檬酸盐 作用：柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互作用， 它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附能力。 NaCl，KCI甚至浓度高达3M时，也不影响Pr负电荷的吸附，相反这些盐可以大大降低Pr正电荷的吸附。因此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白质。,60,亲和层析法 1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。 如，酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除. 酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间。 这些被作用的对象物质称之为配基（ligand) 。,61,固定相-配基固定在固相载体上,62,63,2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速 3.载体的选择： (1)必须具有高度亲水性，使Pr分子容易与它接近. (2)非专一性吸附要十分小。 (3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。 常用载体：纤维素、 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、 聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。,64,高效液相层析法（HPLC） 液相层析:凡是以液体作为流动相的层析法。 高效液相层析法: 高压输液的情况下,数分钟甚至1min就可 以完成一次理想的分离,这种方法为HPLC. 条件: 1.柱长 50-100cm, 柱径2-3mm; 2.固定相载体颗粒的直径通常10-15um; 3.高压输液泵加压，一般压力在20-200Kg/cm2 4.保持1ml/min的流速,65,固定相:聚苯乙烯凝胶 多孔性二氧化硅微球 多孔玻璃珠等 流动相: (1）与固定相不互溶或溶解很少; （2）避免与固定相发生不可逆反应； （3） 对样品要有适当的溶解度； （4）与采用的检测器相适应。,66,67,68,HPLC分析图谱,70,分类： (1)液一液分配层析：利用溶质在流动相中分配系 数的差别而达到分离目的， 是应用最多的方法之一。 (2)液一固吸附层析:利用溶质在固体吸附剂上吸 附能力的差别而达到分离目的。 (3)离子交换层析：通过溶质和固体（树脂）的离子 交换作用，利用不同溶质离子交 换能力的差别而达到分离目的。 (4)凝胶渗透层析：按溶质分子量大小而分离，也即 分子筛层析。,71,第二节 蛋白质的检测和鉴定,72,一般可通过以下几个方面进行： 光谱学特性 电泳行为 特异抗体反应 特异生物学活性 N一末端氨基酸序列测定 质谱检测 排阻层析,73,一、光谱学特性 蛋白质光谱特性的总原则是： 当一定波长的光（即电磁波）与Pr分子接触时，所吸收的或反射的辐射能量与Pr分子结构特征和浓度是密切相关的。 圆二色谱、磁共振技术、X一射线晶体衍射法、红外光谱、拉曼光谱技术等光谱学技术等。,74,不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反映的是蛋白质分子的不同特征: 190 -200nm波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链上的酞胺键中电子的被激发； 230 - 300nm波长范围的光吸收谱（最大吸收值在280nm波长处）反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸侧链上电子的被激发。 所以一般情况下，溶液在280nm波长处（属紫外 光范围）的光吸收能力被当做是存在蛋白质的证据。,75,二、电泳检测 蛋白质分子为两性电解质，在不同PH的溶液中带有不同的电荷，从而在直流电场中能够泳动，这就是电泳现象。 按介质状态来分:自由电泳 区带电泳 按操作原理可分为: 一般电泳 等电电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳等,76,自由电泳-以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离 缺点:自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限 区带电泳-在固体支持物上所进行的电泳 固体支持物有:滤纸、醋酸纤维薄膜、 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 优点:分辨率很高。,77,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) SDS (十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q u = （迁移率）6r u 与 Q、 r有关 若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGE中进 行电泳，由于分子筛效应， u 仅取决于分子的大小。 因此 SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其 分开。 这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿 的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。,78,79,这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的 分子量范围： 5胶浓度时，适用于分子量6200万的区间； 10胶浓度时，适用于分子量1.67万的区间； 15胶浓度时，适用于分子量1.24.5万的区间。,80,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,等电聚焦电泳 （isoelectric focusing, IEF） Pr分子有一定的PI， 当它处在一个由阳极 阴极梯度逐渐增加的 介质中，并通过以直流 电时，它便“聚焦”在与 其PI相同的pH位置上。 PI不同的蛋白质泳动后 形成位置不同的区带而 得到分离。,82,优点： 1.有很高的分辨率； 2.可以区分等电点只有 0.01 pH单位差异的蛋白质； 3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量； 4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。,83,能形成 PH 梯度的物质必须具有以下特性： （1）有足够的缓冲能力，样品存在时也能保持稳定 的PH梯度； （2）有足够的电导能力，以使一定的电流能够透过； （3）是小分子的物质，电泳后易于除去； （4）化学组成与被分离的蛋白质物质不同，不干扰 测定； （5）不会使蛋白质变性或与其发生副反应,84,双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis） 第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳-PI 第二向采用SDS一凝胶电泳-分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不 同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率,85,双向PAGE,86,双向电泳技术缺点，具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到： 等电点（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4 的那些蛋白质； 分子质量很大的蛋白质，比如大于l00kDa的蛋白 质就比实际的少了，而大于150kDa的蛋白质就几 乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些 大蛋白质都能清楚地被观察到； 疏水性蛋白质。,免疫电泳 将电泳分离和专一性免疫沉淀相结合的分析方法： 蛋白质样品先在琼脂或琼脂糖凝胶中电泳，然后在 与泳动路线相距几毫米的槽中放入针对该样品的免疫血 清。由于双向扩散的结果，形成抗原一抗体复合物的免 疫沉淀弧线,由于免疫反应有 很高的专一性， 可用于鉴定Pr的 纯度，分析样品 中蛋白质的组分。,PH 8.6,88,电泳方向,89,三、测定纯化蛋白质的分子大小 测定蛋白处于非变性条件下的大小一般可通过： 排阻层析 沉降平衡超速离心 （sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 动态光散射（dynamic light scattering) 孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 （pore gradient polyacrylamide gel electrophoresis）,90,沉降平衡超速离心 （sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 用该技术测定蛋白质分子质量的时候，测定的是几个绝对动力学参数 层析或电泳技术：需要用标准蛋白样品进行校正。 该技术可普遍地用于测定从小到蔗糖、大到病毒的 不同样品的大小。,用沉降平衡超速离心测定蛋白质分子质量的总的原理是： 当Pr样品在相对较低的离心速度（但还是处于超速范围）下离心时，在一个从离心管顶部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，Pr分子很快形成一个从离心管顶部往下逐渐增加的连续r浓度梯度； 与此同时，将有一个方向与离心力相反的扩散力作用于Pr上； 当沉降离心进行一定时间之后，作用于Pr上的离心力和扩散力（前者与蛋白在离心管中所在位置离轴心的距离成正比例，后者与Pr浓度成正比）正好相互消除，这样使得蛋白样品的表面处于一个平衡状态而不再移动； 在这种平衡条件下，不同部位Pr浓度与所在部位离轴心的距离之间的关系与蛋白质分子质量成某种数学关系。,92,93,动态弹性光散射 是通过测定蛋白颗粒的直径、然后与标准蛋白样品比较而推算蛋白分子质量的方法。 这种测定技术也可通过观察样品是单分散性的（monodispersed）还是多分散性的（polydisper- sed）而反映所测蛋白样品是否均一。,94,孔径梯度电泳 通过制备具有一定范围的从大到小孔径梯度的聚丙烯酸胺凝胶，然后让蛋白在非变性条件下在这种凝胶上电泳而进行的。 经过低电流条件下的较长时间的电泳，蛋白质分子将在凝胶中与其直径相等的孔径处停下（因为再往下凝胶中的孔径比蛋白直径小）。通过与同时在胶中电泳的标准样品比较我们就可以知道蛋白在这种非变性条件下的分子质量。 优点：.所获得的是天然状态下的蛋白分子大小。 2. 如果蛋白分子能够在这种低电流电场中长 时间保持稳定的话，这种方法比较经济。,95,质谱 质谱是一种在化学中被广泛采用的、测定原子或分子质量方法中最直接、最准确的方法。,96,用质谱测定蛋白质分子质量的总的原理： 首先纯化好的蛋白样品要被转变成挥发和带电（即解离）状态， 电离后的蛋白质分子（带有多个电荷）然后进入一个真空加速电场中， 之后，不同质荷比（m/z）的蛋白分子表现出的行为或者在外加磁场中的偏转、或者抵达固定探测器的所谓“飞行时间（time of flight, TOF) “不一样。 利用所测得的质荷比以及蛋白所带的电荷值，计算机软件很快就会正确地给出所测蛋白分子的质量。,97,用质谱测定蛋白质的分子质量，精确一般可达0.01%，是目前进行蛋白质分子量测定最准确的方法（其准确度超过SDS-PAGE、弹性光散射和孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳，甚至分析超速离心等）。 质谱技术现在也可直接用于： 氨基酸序列的测定 蛋白质的翻译后修饰的鉴定 蛋白质组学研究工作。,98,四、测定蛋白质的氨基酸序列 蛋白质被纯化出来，需要进一步获取其基因序列， 最好测定其部分的或全部的氨基酸序列。 自动氨基酸测序仪,99,五、用抗体探测特异蛋白质分子 抗体是当外源入侵物（包括蛋白质）与脊椎动物体内的免疫系统接触后产生的、能与入侵物特异结合的防御性蛋白质分子。 这种高度特异、高度灵敏的抗体一抗原结合反应现在被广泛地应用于检测微量蛋白的存在情况。,100,目前应用抗体研究蛋白质的方法主要包括下面几种： .蛋白质印迹 2. 免疫共沉淀,101,(一）蛋白质印迹（Western blotting） 是一种使用广泛的检测蛋白质的方法。 这种方法与研究核酸时用的印迹法原理非常类似 蛋白质印迹法是利用抗原一抗体之间的特异结合反应 而检测的； 核酸类的印迹法是利用核酸分子之间通过特异碱基配 对法则而形成杂交分子这一原理而检 测的,102,蛋白质印迹 检测时，蛋白质混合物（一般是细胞抽提物）通过电泳被分开，蛋白质被（一般通过电场的作用）转移到一种特别的膜（如硝化纤维膜等）上，然后让特异的抗体与固定在膜上的特异抗原蛋白结合 抗原一抗体之间结合的高度特异性使得用某种蛋 白质分子制备的特异抗体分子只与膜上的这种蛋白质分子结合，而不与膜上存在的成千上万种其他蛋白质发生相互作用。,103,结合了特异抗体的蛋白质条带可以通过能与结合在抗原蛋白上的所谓“第一”抗体结合的、被一种特异的酶化学发光基团荧光基团放射性同位素标记的“第二”抗体进行显示。 这样我们可以知道与特异抗体对应的抗原蛋白在检测的蛋白混合物中是否存在？相对量是多少？如果蛋白混合物是通过SDS-PAGE分开的话，被检测蛋白的分子量也一目了然。,104,（二）免疫共沉淀（coimmunoprecipitation） 是一种在体外探测两个蛋白分子之间是否存在特异 相互作用的方法。 免疫共沉淀的原理：如果两个蛋白在体外系统中能够发生特异相互作用的话，那么当用两个蛋白中的一个所对应的抗体进行免疫沉淀的时候，另一个蛋白也将同时被沉淀下来。,105,第三节 蛋白质的结构分析,106,蛋白质结构包括： 共价结构和非共价结构 静态结构和动态结构。 一级结构 空间结构,107,一、氨基酸序列测定一级结构的测定 蛋白质的一级结构决定其高级结构，测定一个蛋白质的一级结构是我们认识一个蛋白质结构和功能的前提之一。 将一个新蛋白质分子的序列与所有已知蛋白质的序列进行比较而试图发现相似蛋白质（这种相似性可以是在整体水平，也可以是局部水平）；从序列中寻找已知与特定结构特征或生物活性相关的序列基元（如跨膜序列、DNA结合基元、细胞定位信号、潜在的各种共价修饰位点等等）。,108,Edman降解法 质谱技术基于串联质谱技术的测序方法 是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性 这一特点而设计的 通过测定蛋白质的氨基酸所对应的DNA编码序列上 读出（从cDNA序列直接读出，或从对应的基因组DNA序列 中的外显子序列）,质谱技术测定序列： .先测定某一肽段（如：A-B- C-D-E-F-G- ）以及从C一末端或N一末端去除一个残基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子质量，二者之差值即为末端残基（A）的分子质量。 2. 然后与20种标准氨