课件：过氧化物酶.ppt

2019/8/14,实验二 过氧化物酶活性的测定,2019/8/14,一、实验目的,1.学习红薯过氧化物酶的制备方法。 2.掌握过氧化物酶的反应原理及测定方法。,2019/8/14,二、实验原理,1、过氧化物酶（简称POD)简介 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。,2019/8/14,2酶活力测定 (1) 酶活力 表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量(g)或体积(ml)。因为酶是一种生物催化剂。酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。 酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应的能力。催化能力强(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身的重量不能说明酶的实际含量多少。同样重量的酶，酶活力可以不同，活力高，价值就大。,2019/8/14,(2) 酶促反应速度 酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即在最适条件下(最适pH、最适T) 酶催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力(实质上就是酶的定量)测定就是测定酶促反应的速度(用v表示) 。 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。单位：浓度/单位时间 常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明显。酶促反应随时间增加，产物增加。,2019/8/14,若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应的速度曲线。,时间,产物的生成量,斜率浓度/时间V,2019/8/14,从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。引起下降的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用等。因此研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的反应速度。具体指酶促反应速度曲线的斜率。即从原点对曲线作切线，求切线斜率( v ) = 浓度 / 时间,2019/8/14,由于产物从无到有，只要方法灵敏，可准确测定。测定产物增加量的方法很多： 化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等。 物理方法：UV吸收、荧光等。 同位素方法等。,2019/8/14,(3) 酶的活力单位 表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位称酶的活力单位(U)。 国际单位(IU)定义：1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔( mol)底物的酶量，或是转化1微摩尔底物中的有关基团的酶量。,2019/8/14,3、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：,2019/8/14,本实验用紫外吸收法测定产物4邻甲氧基苯酚在470nm光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收 - 时间的速度曲线，求出曲线的斜率，即酶促反应初速度，再换算为酶活力。,4,2019/8/14,2019/8/14,2. pH对酶促反应速度的影响,(1) 影响酶促反应速度的因素 * 底物浓度 米氏公式 * 温度 * 酶浓度 * 激活剂、抑制剂 * pH,2019/8/14,(2) pH对酶促反应速度的影响 大多数酶的活力受其环境pH影响。这是因为pH影响底物分子和酶分子中一些基团的解离，这些基团的离子化状态关系到底物与酶的结合、酶的专一性和酶活性中心的构象。通常各种酶只有在一定pH范围内才具有活性，并在一定pH下，酶促反应具有最大反应速度，此pH称最适pH，高于或低于此值反应速度都下降。,2019/8/14,如将反应速度对pH作曲线，典型的呈钟罩形，但不同酶受pH影响是不同，所以会有不同形状，有的只有钟罩形的一半，有的则是一直线，即受pH影响不大。,2019/8/14,木瓜蛋白酶,胃蛋白酶,胆碱脂酶,2019/8/14,不同酶的最适pH也不同，如胃蛋白酶为pH 1.5 - 2.5、胰蛋白酶为pH 8。但应注意最适pH不是特征常数，对于同一种酶，其最适pH因底物的种类、浓度及缓冲液成份不同而有差异，因此酶的最适pH并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。一般最适pH在6 - 8之间。 由于酶活力受pH影响很大，因此在测定酶活力时，pH必须恒定，所以测活反应最好在缓冲液体系中进行。,2019/8/14,本实验测定三亇不同pH下过氧化物酶的时间光吸收关系曲线，比较三亇不同pH ( 6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力的影响。,2019/8/14,三、实验操作,1、过氧化物酶粗品液的制备 称取红薯材料1g，加少许石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸缓冲液（2ml左右) ，于研钵中研磨成匀浆。 再加入3ml磷酸缓冲液浸提20分钟后，以6000r/min离心15分钟。 倾出上清液并过滤，然后转入10ml容量瓶定容，摇匀后，贮于冷处备用。,2019/8/14,2、 酶活力测定 (1)取1只比色杯洗净控干，按以下步骤操作： 用移液管吸取0.1 mol/L反应液(pH 6.0) 2.9mL 加入比色杯中。 放入紫外分光光度计比色杯架内，按auto zero，出现插入空白，按ok，仪器自动调零。调零完成后按start，出现插入样品。 (2)取出比色杯，1人加酶液(L)，先加20 L ，另1人同时按ok开始计时，加酶后盖上硫酸纸，按紧混匀，30秒内放入比色杯架内，仪器每30秒自动记录光吸收值A470nm。 (3)按数据处理中的数据打印，显示8个数据，记录数据。,2019/8/14,(4)操作要点： * 关键是酶稀释的倍数和酶量多少要合适，使A470nm在0.20.4/min，即第1个30秒A470nm在0.1- 0.2。过低过高都应增加或减少酶量重新做。 * 加酶后应迅速摇匀，立即计算时间，2人要配合好，计时不能提前或推后，否则曲线不是从原点开始。 * 每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水冲洗5遍以上，保证不残留上次的溶液，否则影响测定。,2019/8/14,四. 数据处理,1. 用坐标纸作出时间 A470nm曲线，过原点在直线部分作切线，求斜率A470nm /min,0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5,时间/min,1 0.8 0.6 0.4 0.2,A470nm,2019/8/14,2. 代入下式计算酶活力 A470nm /minV POD活力单位（mol/min）= L A470nm /min3 mL = 26.6 mL/ mol cmcm A470nm 3 = (mol/min) 26.6 V 反应液体积 ( mL ) 产物4邻甲氧基苯酚的摩尔消光系数26.6 L/ mmolcm 即26.6 mL/ molcm) L 比色杯光径 (1cm),2019/8/14,实验三,POD蛋白浓度测定 和比活力计算,2019/8/14,一.实验目的,1.学习Folin酚法（Lowry法）测定POD蛋白浓度的原理和方法 2.掌握比活力计算方法,2019/8/14,二.实验原理,1Folin酚法原理 Folin酚试剂由两种试剂组成： 甲试剂：双缩脲试剂 尿素加热至180左右，两分子尿素缩合放出一分子氨，而形成双缩脲。,2019/8/14,NH2 NH2 C = O C = O NH2 180 NH + NH3 NH2 C = O C = O NH2 NH2,2019/8/14,双缩脲在碱性溶液中与铜离子（酒石酸钾钠-CuSO4）络合生成复杂的紫红色化合物。 蛋白质分子中的肽键（CONH）与双缩脲结构相似，也有双缩脲反应，其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此所有蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，可用作蛋白质定性、定量分析。,2019/8/14,甲试剂实质是利用蛋白质中肽键反应进行定量测定，它与蛋白质分子量及氨基酸组成无关，即受蛋白质氨基酸的特异性影响较少。但灵敏度较低，mg级水平，010 mg/mL作标准曲线。,2019/8/14,乙试剂：主要起作用是磷钼酸（磷钨酸），它由钼酸钠 （钨酸钠）在酸性（磷酸等）作用下产生。 钼酸钠（钨酸钠） HCl 碱性 H3PO4 + 钼酸（钨酸） 磷钼酸 钼兰（钨兰） （磷钨酸）还原剂,2019/8/14,H3PO4 + 12H2MoO4 H3Mo12PO40 + 12H2O 碱性还原剂 Mo2O3MoO3 兰色,2019/8/14,Folin酚试剂最初由Folin等于1912年提出，当时只有乙试剂应用于酚类测定，以后才用于蛋白质测定。因为Tyr的酚基也能起还原剂作用，呈兰色反应，因而被利用于测定蛋白质，产物颜色深浅与被测蛋白质含量成正比关系，所以乙试剂作用是利用蛋白质中Tyr、Try、Cys等具有还原性的氨基酸残基的作用进行测定，灵敏度高，但是后来发现有些缺点，出现不少改良方法。,2019/8/14,1951年Lowry（劳里）在 Folin酚试剂 中引入双缩脲反应（加入甲试剂）即成为如今广泛被使用的Lowry法。 为什么要作这样改良？ Folin酚试剂中只有乙试剂，依赖蛋白质中Tyr、Trp等氨基酸残基的反应，而对于不同种类蛋白质，由于它们之间的氨基酸组成不同，在呈色反应中就会有差异，影响实验准确度，即受蛋白质特性影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反应，不受氨基酸组成的影响。,2019/8/14,引入双缩脲试剂后，具有两种试剂双重作用，互相补充，结果大大增加了反应的灵敏度和准确度。Lowry法较双缩脲灵敏度提高100倍，较UV法灵敏1020倍。 Folin酚（Lowry）法，灵敏度高，操作简单，迅速，不需要特殊仪器，常用作蛋白质定量测定，文献引用最多。,2019/8/14,2、蛋白质的定量测定,2019/8/14,3.比活力概念 比较不同重量或不同蛋白含量的酶活力并无实际意义，不同酶或同一种酶在不同情况下的比较应有一个重量标准，于是产生出另一个酶的重要参数比活力。 比活力 指单位质量的酶蛋白所具有的酶活力 单位 酶活力单位 / mg酶蛋白 ( IU / mg酶蛋白 ) 比活力是酶学研究及酶制剂生产制备中经常使用的数据，用来比较单位重量酶蛋白的催化能力( 即酶活力大小 )。,2019/8/14,比活力实际意义 可以说明酶的质量好坏，纯度高低。不同酶比较时，比活力高，说明其质量好，纯度高；对同一种酶，可以比较不同批次的质量和纯度。在酶的生产制备过程，考察比活力尤为重要，随着该酶不断被提纯，它的比活力升高，说明酶逐步被纯化，比如，粗制品总活力很高，蛋白质含量也很高(杂蛋白多)，比活力低。纯化后虽然总活力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白被除去而减少，使比活力升高。酶愈纯，比活力愈高，比活力不再升高，酶就相当纯了，因此比活力用以衡量生产工艺优劣、生产效率高低。它是一个很有实际用途的参数，是经常要测定的数据。,2019/8/14,三、操作步骤 每人取16支试管，按下表平行操作：,2019/8/14,* 标准蛋白质溶液为牛血清清蛋白 ( 150g/mL )。 * 侍测样品x为POD酶原液，轻轻倒置摇匀后用注射器加50L(0.050 mL)，去离子水加0.450 mL。,2019/8/14,2.注意事项： * 定量测定要求各种试剂量取准确，正确规范使用移液管。 * 乙试剂在酸性条件下稳定，而甲试剂在碱性条件下与蛋白质反应，生成碱性的铜-蛋白质络合物溶液，所以在加入乙试剂后，应迅速摇匀(用振荡器)，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。加一管摇一管，直接取0.25mL吹下，二人可合作，乙试剂比重大，一定要摇起来。 * 待测样品所取体积应使其浓度在标准曲线范围内。,2019/8/14,四. 数据处理,1. 制作标准曲线 以标准蛋白质含量 ( 15,30,45,60,75g )作横座标，每管减空白的光吸收值(A640nm) 作纵座标，过原点作直线。,2019/8/14,2. 计算样品(POD)蛋白质浓度 根据7号待测样品管光吸收值从曲线上查出对应的蛋白质含量代入下式： 7号样品对应蛋白质含量 ( g )103 C POD ( mg/mL ) = 样品体积 ( 0.050 mL ),2019/8/14,3. 计算比活力 POD比活力（mol/min/mg蛋白质） 酶活力单位 = 酶活力测定所用酶蛋白量 酶活力单位 ( IU ) = C POD( mg/mL )(0.020 0.200)mL,2019/8/14,注意： 用Folin酚法测出的是酶原液蛋白质浓度（mg/mL），而计算比活力时所用酶蛋白量应是酶原液蛋白质浓度（mg/mL）实际测定时用的该酶体(0.0200.200)m