江南大学食品微生物学试题汇编.pdf

江南大学食品学院微生物学江南大学食品学院微生物学 97-07 年硕士研究生试题汇编及简答年硕士研究生试题汇编及简答 作者：作者：babybath 97 硕士题硕士题 1如何使微生物合成比自身需求量更多的产物？举例说明如何使微生物合成比自身需求量更多的产物？举例说明； 见练习题第 19 题,周德庆二版教材 P144 考察知识点，代谢调控理论，周德庆二版上的内容；应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节；应用抗 反馈调节菌株解除代谢调节 答：为了使大量积累中间代谢产物或终产物，必须破坏或解除原有的调控关系并建立新的调节机制，使它 按照人们的意愿使目的产物大量生成和积累 （一）调节初生代谢途径 微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位 以限制它与相应底物的接近，以及调节代谢流等，其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括调节酶的合 成和调节现成酶分子的催化能力，两者密切配合，以达最佳效果。在发酵工程业中常通过三种调节初生代 谢途径而提高发酵生产率 (1) 应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节 营养缺陷型菌株丧失了某种酶合成能力，只有在加有该酶的培养基中才能生长，在直线型的合成途径 中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物，但在分支代谢途径中，通过解除某种 反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。 如高丝氨酸营养缺陷型菌株由于该菌株不能合成高丝氨酸脱氢酶因此不能生产高丝氨酸脱氢酶，也不 能产苏氨酸和甲硫氨酸，在补给适量高丝氨酸（或苏氨酸和蛋氨酸）的条件下突变株可以在含高浓度糖和 铵盐的培养基中产生出大量赖氨酸。 (2) 应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节 此菌株对反馈抑制不敏感，或对阻遏有抗性，或兼而有之的组成菌株。这类菌株其反馈抑制或阻碍已 解除，故可分泌大量末端代谢产物。抗反馈调节的突变株可从结构类似物抗性突变菌株和营养缺陷型回复 突变株中获得。结构类似物抗性突变株的末端产物合成酶系的结构基因发生了突变，故不再受末端产物的 反馈抑制，于是末端产物就大量积累，利用结构类似物作筛子，可筛选其对应氨基酸的高产株 以赖氨酸发酵为例,谷氨酸棒杆菌对赖氨酸的结构类似物 S-( 氨乙酰基)胱氨酸(AEC)敏感,是赖氨酸毒 性类似物。它能抑制合成途径中的天冬氨酸激酶,但不能参与蛋白质的合成。当细胞在含有 AEC 的培养基 中培养时,野生型菌株由于得不到赖氨酸营养而遭淘汰,抗 AEC 突变型则因编码天冬氨酸酶结构基因发生了 突变,变构酶调节部位不再能与代谢拮抗类似物相结合,而其活性中心却不变,这种突变型在正常代谢时,最 终产物与代谢类似物结构相似,故也不与结构发生改变的变构酶相结合,这样,这种抗反馈调节突变型对产物 抑制脱敏,仍有正常的催化功能,从而过量生产赖氨酸。 （3）控制细胞膜的渗透性 改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗透到细胞外，以解除末端产物反馈抑制作用， a. 通过生理学手段控制细胞膜的渗透性 例如在谷氨酸发酵生产中,在谷氨酸生产菌的细胞生长期加入添加适量青霉素，可抑制细菌细胞壁肽聚糖 合成中的肽链交联，造成细胞壁的缺损，有利于代谢产物生物素外泄，降低了谷氨酸的反馈抑制提高谷氨 酸产量 b. 通过细胞膜缺损突变控制其渗透性 应用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培养基中也因能细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产 量。原因是油酸是一种含有双键的不饱和脂肪酸是细菌细胞膜磷脂中的重要脂肪酸，其油酸缺陷型突变株 因其不能合成油酸而使细胞膜缺损。 （二）控制发酵条件 （1）控制培养基营养成分的组成，浓度配比和 PH 实质上是利用 M 本身固有的代谢调节系统来改变其代谢方向， 使之朝着人们希望的方向进行， 如酿酒 酵母在中心和酸性条件下将葡萄糖发酵产生乙醇和 CO2，而在碱性条件下，产物就会主要变成甘油，而培 养基中的 C/N 比很重要，N 源过多，使微生物生长过于旺盛，而不利于产物的累积，N 源不足，限制了微 生物的生长速度和生长量，也不利于产物的合成 （2）控制发酵温度 温度不仅会影响微生物生长和产物合成的水平，也会影响微生物代谢的途径和方向，如灰色链霉菌嗜 冷突变株在利用烷烃发酵生产抗生素，即使其他发酵条件相同，但发酵温度不同也会使产生的产物完全不 同。 （3）添加诱导物 在培养基中加入适当的诱导物（多为底物或结构类似物）可以增加酶的产量，如木霉发酵生产纤维素 酶时，添加槐糖可以诱导纤维素酶的产生 （4）添加生物合成前体 在色氨酸的合成代谢中，其最终产物的色氨酸对代谢途径中的第一个酶有很强的反馈抑制作用，使色 氨酸的合成受阻，而邻氨基苯甲酸作为前体仅参与色氨酸最后阶段的合成，不受色氨酸反馈抑制的影响， 在培养基中加入邻氨基苯甲酸，虽然色氨酸的反馈抑制还在，但不影响前体的转化，可大幅度提高发酵产 量，在许多次级代谢产物的发酵中，加入前体也可以促进产物的合成，或使之形成特定的产物。 （5）去除代谢产物 反馈抑制是代谢末端产物达到一定量之后会反馈抑制代谢途径中第一个酶的活力，或阻遏第一个酶的 合成从而降低产物生成的能力。因此在发酵中不断去除末端代谢产物，降低其在发酵系统中的浓度，可以 减少反馈抑制，增加产物的产量，可以在发酵过程中采用限量添加这类物质，或改用难以被水解的底物的 办法减少阻遏作用的发生，提高产酶量 2如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？Why？ 练习题第 32 题，本题的知识点系食品微生物范围。 答：食品原料的 PH 值几乎都在 7 以下， 酸性食品：PH4.5（水果） 低酸性食品：PH4.5(蔬菜，鱼，肉，乳) 在酸性食品中，细菌因在过低的 PH 值环境中已受抑制，能生长的仅为乳酸菌，酵母菌和霉菌，因为酵母 菌的最适生长 PH 值为 3.8-6.0.霉菌为 4.0-5.8,芽孢菌不能生长，且霉菌和酵母菌在常压，高温条件下即可 杀死，因此采用高温煮沸的方法即可达到长期保养的目的。 低酸性食品中所有微生物均能生长，细菌生长繁殖的可能性最大，而且能够良好的生长，因为绝大多数细 菌的生长适应的 PH 为 7，当 PH5.5 时腐败细菌已基本被抑制，但有少数细菌仍可生长。且细菌中的芽 孢菌耐高温，因此需要在高温下（大于 100）下持续一段时间以杀死细菌的芽孢。一般 121，20min 杀菌温度： 低酸性食品：高温高压 121。因所有微生物均能生长，芽孢的耐热温度是 120 高酸性食品：沸水 90-100，酸性中酵母菌、霉菌的孢子在 95以上均可以杀死。 3设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的试验方案，并解释主要步骤的基本原理；设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的试验方案，并解释主要步骤的基本原理； 筛选筛选 xx 菌的题目，万能公式菌的题目，万能公式 (1)高温（中温）淀粉酶产生菌的实验方案高温（中温）淀粉酶产生菌的实验方案 (2)果胶酶产生菌的实验方案果胶酶产生菌的实验方案 (3)酸性蛋白酶酸性蛋白酶 (4) 筛选低温乳糖酶产生菌筛选低温乳糖酶产生菌 (5)纤维素酶纤维素酶 答:（1）从高温堆肥中采集菌样（中温淀粉酶从粮食加工厂或者饭店附近的土壤中采样）-用含淀粉液体 培养基增殖（温度 50-60，PH 中性，中温淀粉酶培养温度则为 37左右）-淀粉平板上划线分离或者 涂布（注意点：平板表面不可有水膜或水滴，接种环要光滑，无菌操作）-依据透明圈的大小挑选菌种 （注意点 2,其为淀粉水解圈，越大越好，因为越大则该菌产淀粉酶越多）-再划平板划线分离-模拟工 业发酵进行摇瓶发酵-筛选菌株（初筛，复筛，注意点 3：初筛以量为主，复筛要测定数据的精确度，以 质为主）-测定酶活-鉴定菌株-获得高产菌株 原理，采用淀粉培养基原因：一般细菌不能直接利用淀粉为碳源，而产淀粉酶的菌株可以淀粉酶糖化淀粉 作为 C 源，高温可以杀死一般细菌，只有耐高温的细菌可以存活。 （2）果胶酶： 果园土壤中采集菌样-液体果胶培养基中增值（37）-果胶平板划线分离或涂布（平板表面不可有水 膜或水滴，接种环要光滑，无菌操作）-依据透明圈大小挑选菌株（果胶水解圈越大越好，越大说明菌株 产酶量大）-再划线纯化-模拟工业发酵条件进行摇瓶培养发酵-以后同前面 如果考果胶酶的合成是操纵子的阻遏机制，如何利用这一机理设计有效的筛选方法？ 回答如下: 由于果胶酶受阻遏型操纵子的编码调控，则末端产物的反馈阻遏了酶的进一步合成，我们可以应用抗反馈 调节的突变株来解除反馈调节 具体操作:可以把菌样培养在含果胶的结构类似物的培养基上， 该结构类似物能抑制该菌的正常生长时采用 经诱变以后（如 x 射线，亚硝基胍）长出的抗结构类似物的突变株进行发酵就能分泌较多的果胶酶， 由于该突变株的某些酶的结构基因发生了改变，不再受果胶酶的反馈抑制，于是就有大量的果胶酶产生 如果考果胶酶作为一种食品工业用酶，则必须考虑其安全性，从那几个方面着手来保证该酶的安全性？， 回答如下： 安全性检测：菌种用动物实验测安全性，酶安全性实验，生产过程要符合 GMP 操作，包装原辅料符合生 产安全， 毒性试验: a来自动植物可食部位及传统上作为食品成分或传统上用于食品的菌株所生产的酶，如符合适当的化学 和微生物学要求，即可视为食品，而不必进行毒 性试验 b由非致病性的一般食品污染微生物所生产的酶要求做短期毒性试验 c由非常见微生物所产生的酶要做广泛的毒性实验 （3）酸性蛋白酶 在肉类加工厂，饭店排水沟中的污泥污水中采集菌样-酸性条件下用牛奶作为碳源和氮源-牛奶平板划 线分离-后面与其余相同 原理一般产蛋白酶的细菌不能在酸性条件下生长，酸性条件下可以抑制大量细菌生长，只有产酸性蛋白酶 的细菌可以在酸性条件下利用蛋白质为碳源生长 （4）低温乳糖酶 来源：乳制品厂周围的土壤采集菌样-低温条件下用乳糖作为唯一碳源（15）-乳糖平板划线分离- 后同 耐低温菌株常采用一次性筛选法，将处理过得菌悬液在一定低温下处理一段时间后再分离，对温度敏 感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对低温有较好的耐变性。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。 本题中指示剂用溴甲酚绿，其在酸性条件下呈黄色，碱性环境中呈蓝色，在分离培养基 PH6.8 中加入溴甲 酚绿指示剂后呈蓝绿色，当细菌在该培养基中生长并分解乳糖产生乳酸之后使菌落呈黄色，菌落周围的培 养基也变为黄色。 （5）纤维素酶：(已知纤维素酶的合成是操纵子的阻遏机制，如何利用这一机理设计有效的筛选方法？) 在堆肥，朽木中采集菌样-纤维素液体培养基-纤维素平板划线分离-后面同前 由于纤维素酶受阻遏型操纵子的编码调控，则末端产物的反馈阻遏了酶的进一步合成，我们可以应用 抗反馈调节的突变株来解除反馈调节来提高代谢产物的产量，可用 2-脱氧葡萄糖作为降解产物阻碍物，诱 变处理，定向选育能继续产生葡萄糖的高产菌株，如果发现葡萄糖可继续合成，则已经突破了葡萄糖的反 馈抑制 本题型万能套路：本题型万能套路： （1）先查资料看有无相关报道富集经验 （2）采样，以采集土壤为主（根据分离目的，选择适合该微生物生产的环境进行采集） （3）富集培养 （通过选择性培养基（营养成分，抑制剂添加） ，通过选择一定的培养条件（培养温度， PH 值）来控制，具体可利用微生物利用 C 源的特点，选定待分离微生物的特定碳源，淘汰掉杂菌。 （4）培养分离：采取稀释分离法或平板划线分离法分离单个菌落 （5）筛选：通过菌落形态观察，选出所需菌落，取一半并作鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可移至 试管斜面纯培养，然后采取与生产相近的培养基和条件通过三角瓶小型发酵实验以求的适于工业生产的菌 种 （6）毒性试验，均需通过两年以上的毒性试验 a来自动植物可食部位及传统上作为食品成分或传统上用于食品的菌株所生产的酶，如符合适当的 化学和微生物学要求，即可视为食品，而不必进行毒性试验 b由非致病性的一般食品污染微生物所生产的酶要求做短期毒性试验 c由非常见微生物所产生的酶要做广泛的毒性实验 （7）鉴定 通过形态，生理生化指数，16sRNA 等手段鉴定菌株 4下列食品如变质，主要是有什么类型的微生物所引起？下列食品如变质，主要是有什么类型的微生物所引起？Why？1市售面包市售面包 2充充 CO2 的 果汁； 的 果汁； 变质微生物题，题目属食品微生物内容，补充一下练习题第 33，39 题，各种食品列举如下： 1）添加有山梨酸钾防腐剂的面包出现中心发粘变质的情况。 原因：山梨酸钾是在 PH4.5 条件下抑制酵母菌和霉菌的防腐剂，而面包 PH4.5,所以山梨酸钾抑菌 能力差。面包主要成分是淀粉，酵母菌只能利用单糖或二糖，不能利用多糖（淀粉），高温焙烤，霉菌也 被杀死。但面包中心温度较表面温度低，会有耐热的芽孢杆菌和细菌芽胞存在，在适宜的条件下就会生长 繁殖，中心发粘是有荚膜的细菌造成的。 防止措施：提高焙烤温度，使焙烤充分 2) 市售面包，月饼表面出现丝状生长物 可能是霉菌，来自机会：所有制作糕点的原料，特别是糖，坚果和香料，也可在加工过程中和由空气 中进入，高湿度环境有利于霉菌在糕点表面生长。 防止措施，控制生产的卫生条件，加工工艺，加入适当防腐剂（如丙酸盐）和注意产品的包装及贮存 条件 3）经高温高压杀菌的低酸性罐头出现变质，检测发现其中有大量的革兰氏阴性杆菌。 若 G-是死的则说明原料已经变质，防止措施对原料进行控制，保证原料的新鲜度，可通过检测细菌总 数来确定 若 G-是活的，说明是在罐头生产过程中造成的 原因：G-杆菌不耐热，高温杀菌后仍检出，则说明只可能是漏罐，密封不严，在加工过程中由于冷却 水的渗漏污染，进入 G-杆菌。 防止：密封过程中应严格把关，使用的冷却水应先经过 x 射线或 r 射线消毒 4）巴氏消毒牛奶： 主要是细菌 原因：巴氏消毒法无法彻底杀灭牛奶中的芽胞，残留大约 1%左右，加热之后，室温下芽胞可以萌发 生长，而霉菌和酵母菌都被杀死了，牛奶营养丰富，利于细菌生长。 5）真空包装的蜜饯产品： 主要是酵母菌 原因：真空包装的蜜饯是含糖量高，无氧的食品，因此需氧菌和霉菌生长均会受到抑制，在此条件下， 仅有酵母菌（耐高渗）, Aw0.85, 可以生长，在无氧条件下兼性厌氧的酵母菌可以发酵糖类产酸 6）面粉（米粉）： 主要是干性霉菌 原因： 面粉 （米粉） 的主要成分为淀粉和蛋白质， 酵母菌只能利用单糖或二糖， 不能利用多糖 （淀粉） ， 大多数酵母菌分解蛋白质的能力极弱，又因为面粉水分活度较低，不能达到细菌生长所需水分活度，而霉 菌具有分解淀粉和蛋白质的能力，霉菌生长所需的 Aw 最低为 0.8，在 0.65 时还有干性霉菌生长，因此主 要为干性霉菌。 7）充 CO2的碳酸饮料： 可能是酵母菌或乳酸菌，原因，充 CO2的果汁是一种酸性的含糖低氧含量的食品，而细菌生长的合适 PH 值为 7.08.0，很难生长，霉菌生长 PH 值为 4.05.8，酵母菌生长 PH 为 3.86.0，可在酸性条件下生长， 但霉菌对 CO2敏感，因为其为好氧型微生物, CO2抑制了霉菌的生长,而酵母菌属于兼性厌氧微生物，在无 氧条件下可以发酵糖类产能，乳酸菌亦可在此条件下生长。 8) 杀菌不足的肉类罐头 可能是某些耐热的兼性厌氧或厌氧菌 原因：1.杀菌不足是指灭菌时间不够，但已达到杀菌温度 121，在此温度下，酵母菌和霉菌已被杀死， 又因为罐头加工过程抽真空，霉菌生长也会受到抑制， 所以只可能存在厌氧性和兼性厌氧菌 2.经杀菌后，密封性不好，重要污染源是冷却水 肉类罐头主要是低酸性食品和中酸性食品， 在其中的菌类主要是嗜热性细菌， 产芽孢的中温性厌氧细菌 （肉 毒梭菌），本题与第三小题很接近，需要注意 9）瓶装果汁饮料（果奶）产品发生变质 果汁（果奶）中含有不等量的酸，因此 PH 值较低，一般在 2.44.2 之间，并且还含有一定糖分，适合 这种条件生长的微生物主要是酵母菌，霉菌和某些细菌（主要是乳酸菌） 发生变质的主要原因： （1） 若产品中检出酵母菌和霉菌，则可能是巴氏消毒不充分，有霉菌存在还有可能是瓶子封口不严， 有氧气进入（霉菌是好氧菌，生长需要氧气），一般的巴氏消毒可以杀死酵母和霉菌 （2） 若产品中有细菌，则可能果汁酸度不够或杀菌不充分 防止措施：充入 CO2，或进行超高温瞬时灭菌 10）变酸的果酒 变酸的果酒主要是由醋酸菌和乳酸菌引起，原因：果酒酒度低，酒精含量不了管理起到有效的抑菌效 果，并且还含有糖分，由于果酒通常是采用添加 SO2灭菌，而添加 SO2灭菌对醋酸菌的抑制作用不明显， 所以消毒不好的果酒易酸败。 防止措施：为达到果酒的生物稳定, 果实榨汁后要马上添加 SO2 以抑菌, 或榨汁后进行巴氏杀菌, 同 时还可起到灭酶的作用。发酵完的酒液要马上进行离心分离除去酵母，最后灌装前采用微孔膜超滤技术去 除有害菌体。 11）把酿酒酵母接入煮过的糯米中室温发酵，无法制得酒酿。 （这个不是变质题，只是列举出来） 原因：酵母菌发酵单糖，而不能发酵糯米中的淀粉，故不能制得酒酿。 方法：加入淀粉酶，使淀粉分解为糖类，酵母菌分解糖类，产生酒酿。 分析变质题可从以下六个方面考虑分析变质题可从以下六个方面考虑 （1）食品物料）食品物料 所有细菌和许多霉菌都有利用蛋白质的能力，酵母菌基本不能利用蛋白质，霉菌有利用淀粉的能力，绝 大多数的酵母和细菌基本不能利用淀粉 所有细菌和许多霉菌都有利用蛋白质的能力，酵母菌基本不能利用蛋白质，霉菌有利用淀粉的能力，绝 大多数的酵母和细菌基本不能利用淀粉(酵母菌只能利用单糖或二糖，不能利用多糖酵母菌只能利用单糖或二糖，不能利用多糖(淀粉淀粉)，分解脂肪的 主要是霉菌和细菌，酵母菌分解脂肪的很少。 ，分解脂肪的 主要是霉菌和细菌，酵母菌分解脂肪的很少。 （2）氧气）氧气 霉菌是需氧微生物，酵母菌一般兼性厌氧。细菌都有霉菌是需氧微生物，酵母菌一般兼性厌氧。细菌都有 故无氧时主要是厌氧的梭状芽胞杆菌和兼性厌氧的酵母菌和细菌（厌氧乳酸菌）故无氧时主要是厌氧的梭状芽胞杆菌和兼性厌氧的酵母菌和细菌（厌氧乳酸菌） （3）水分活度）水分活度 细菌要求最高，一般在细菌要求最高，一般在 0.900.99 之间，霉菌最低，最低为之间，霉菌最低，最低为 0.80，但在，但在 0.65 时尚有干性霉菌可以生长，酵 母介于两者间 时尚有干性霉菌可以生长，酵 母介于两者间 （4）渗透压）渗透压 高渗时：酵母菌和霉菌的可能性比较大高渗时：酵母菌和霉菌的可能性比较大 耐高渗：霉菌酵母菌细菌耐高渗：霉菌酵母菌细菌 （5）PH 值值 PH4.5 ,酸性食品，酵母菌、霉菌和乳酸菌酸性食品，酵母菌、霉菌和乳酸菌 PH4.5 ,各种微生物都可以生长各种微生物都可以生长 （6）温度）温度 抗热性：芽胞抗热性：芽胞G+G霉菌酵母菌，一般霉菌酵母菌，一般 100灭菌，霉菌和酵母菌被杀死，但耐热细菌尤其 是芽胞能存活，需要 灭菌，霉菌和酵母菌被杀死，但耐热细菌尤其 是芽胞能存活，需要 121，10min 以上，故巴氏消毒只能杀死霉菌和酵母，不能杀死细菌芽胞以上，故巴氏消毒只能杀死霉菌和酵母，不能杀死细菌芽胞 防腐剂：防腐剂： 苯甲酸钠：抑制霉菌、酵母菌生长，对酵母菌影响大于霉菌，而对细菌效力较弱，使用范围：高酸性食品 （果汁、饮料） 山梨酸钾：抑制霉菌、酵母菌、细菌，对厌氧性微生物和嗜酸乳杆菌几乎无效，防腐效果较苯甲酸广，ph 56 下使用适宜，效果随 PH 增高而减弱，PH 为 3 使用效果最好 使用范围： 奶酪、焙烤制品、果汁、.食品中允许使用最大量：0.2% 丙酸盐：霉菌抑制剂，酸性范围内使用，以下对霉菌的抑制作用最佳；时抑菌能力明显降低。 丙酸钙对霉菌和能引起面包产生粘丝物质的好气性芽孢杆菌有抑制作用，对酵母无抑制作用 使用范围：面包、蛋糕 5.菌种保藏主要利用什么手段？原理？举例说明；菌种保藏主要利用什么手段？原理？举例说明； 练习题第练习题第 36 题题 菌种保藏原理：菌种保藏原理：根据微生物生理、生化特点，选用优良的菌株，最好是他们的休眠体，人工的创造适 合休眠的环境条件，即干燥、低温、缺乏氧气和养料等使其代谢活动处于最低状态，但又不至于死亡，从 而达到保藏的目的。 手段：手段：冰箱保藏法（斜面），冰箱保藏法（半固体），石蜡油封保藏法，甘油悬浮液保藏法，砂土保 藏法，冷冻干燥保藏法，液氮保藏法 举例： 冷冻干燥保藏法：冷冻干燥保藏法： 1、准备安瓿管 2、准备菌种 3、制各菌悬液及分离 4、冷冻：迅速降温至-40 -70 摄氏度 5、抽真空：完成时有干燥块 6、抽真空，封口 7、冰箱保藏 冷冻干燥保藏法原理：冷冻干燥保藏法原理：通过洗涤液体的所有对细胞生长有害的物质，脱脂牛奶或糖、甘油等可以与大 分子形成氢键的物质做保护剂，防止细胞损伤；在-20 摄氏度以下快速冻结，形成的冰晶小，细胞质浓缩 现象减少，防止细胞损伤；在 0 摄氏度保证不解冻的条件下，高度的冷冻干燥，低温、封口，使保藏时间 延长。 98 年硕士年硕士 1 如何使微生物合成比自身需求量更多的产物？举例说明；如何使微生物合成比自身需求量更多的产物？举例说明； 见 97.1 2 如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？Why？ 见 97.2 3 菌种保藏主要利用什么手段？原理？简述冷冻干燥法的过程与原理；菌种保藏主要利用什么手段？原理？简述冷冻干燥法的过程与原理； 见 97.5 4 什么是大肠菌群，测检食品中大肠菌群的意义是什么？常用什么培养基？该培养基中各种 成分的主要作用是什么？这是一类什么性质的培养基？ 什么是大肠菌群，测检食品中大肠菌群的意义是什么？常用什么培养基？该培养基中各种 成分的主要作用是什么？这是一类什么性质的培养基？ 答：大肠菌群：任何 3724h 可以发酵乳糖产酸产气的-杆状无芽胞，兼性厌氧的肠道细菌。典型代表 E. Coli，产气肠杆菌，柠檬酸杆菌属。 大肠正常菌群对宿主有很多有益作用，包括排阻，抑制外来致病菌，提供维生素等营养，产生淀粉酶、 蛋白酶等有助消化的酶类，分解有毒或致癌物质，产生有机酸，降低肠道 PH 和促进他的蠕动，刺激机体 的免疫系统并提高其免疫力，以及存在一定程度的固氮作用等。 检测食品中大肠菌群的意义： （1） 作为食品被粪便污染的指示菌（食品不卫生/工厂卫生条件差） （2） 作为食品被肠道致病菌污染的指示菌(说明可能有肠道致病菌存在)， 因为大肠菌群与肠道致病菌来 源相同，在外界环境中生存时间，繁殖速度以及对不良环境的抵抗力与主要致病菌类似 常用麦康开培养基（属于选择性，鉴别性培养基，半组合液体培养基） 原因如下：由于是培养液且蛋白胨等为天然有机物，而 NaCl 等为化学试剂，所以为半组合培养基，又因 为其能抑制 G+生长，加了指示剂中性红，用于肠道细菌的培养，因此属于选择性和鉴别性培养基 功能功能 蛋白胨蛋白胨 氮源，碳源 乳糖乳糖 碳源 NaCl 无机盐 牛胆酸盐牛胆酸盐 G+抑制剂 1%中性红中性红 产酸指示剂 发酵管发酵管 判断是否产气 PH7.4 适宜菌生长 灭菌条件：中性，115，30min，高压蒸汽灭菌，可去除细菌芽胞，温度过高会使乳糖分解导致变色 5 试设计一种快速检测致病性大肠杆菌的方法，并说明原理；试设计一种快速检测致病性大肠杆菌的方法，并说明原理； 快速检测题，见 99 6 6 下列食品如变质，主要是由什么类型的微生物所引起？下列食品如变质，主要是由什么类型的微生物所引起？Why？1市售面包市售面包 2充充 CO2的果 汁； 的果 汁； 见 97.4 99 年硕士年硕士 1 如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？为什么？如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么温度杀菌？为什么？ 见 97.2 2 试设计一种从自然界中筛选果胶酶产生菌的试验方案，并解释原理；如果果胶酶作为一种 食品工业用酶，则必须考虑其安全性，从那几个方面着手来保证该酶的安全性？ 试设计一种从自然界中筛选果胶酶产生菌的试验方案，并解释原理；如果果胶酶作为一种 食品工业用酶，则必须考虑其安全性，从那几个方面着手来保证该酶的安全性？ 见 97.3 3 试述微生物菌种保藏的原理和常用方法，你认为对于试述微生物菌种保藏的原理和常用方法，你认为对于 Escherichia coli 和和 Aspergillus niger 分别采用什么保藏方法为好？请说明理由；分别采用什么保藏方法为好？请说明理由； 接 975，此类题一般都是考查一种细菌的和一种霉菌的保存，即细菌采用冷冻干燥保藏法，霉菌除了可以 用冷冻干燥保藏法之外还可以利用其产生孢子的特性采用沙土保藏法保藏。其保藏期可达 110 年。沙土 保藏法（干燥载体保藏法）的成本更低廉。 具体步骤：是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保 藏用得较多，制备方法为：将河砂经 24 目过筛后用 10%20%盐酸浸泡 34 h，以除去其中所含的有机物， 用水漂洗至中性，烘干，然后装入高度约 1cm 的河沙于小试管中，121间歇灭菌 3 次。用无菌吸管将孢 子悬液滴入砂粒小管中，经真空干燥 8 h，于常温或低温下保藏均可，保存期为 110 年。一般细菌芽孢常 用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏（即用麸皮加水/营养液后拌匀，灭菌代替河沙，其余同前） 4影响微生物抗热力的因素有哪些？解释影响微生物抗热力的因素有哪些？解释 D 值、值、Z 值以及值以及 D 值和值和 Z 值的关系。值的关系。 影响微生物抗热力的因素： （1）菌种的不同，对热的抵抗力也不同，与细胞结构特性和细胞组成特性有关，例如嗜热菌抗热力嗜 温菌，孢子菌丝体，芽胞菌非芽胞菌，球菌无芽胞杆菌，G+G-, 霉菌酵母菌 （2）不同菌龄对热抵抗力不同 同一温度下，对数生产期的菌体细胞抗热力较小；稳定期老龄细胞抗热力较大；老龄的细胞芽胞大于幼龄 的细胞芽胞 （3）微生物数量的多少与抗热力有明显关系，菌量越多，抗热力越高，杀死最后一个微生物细胞所需时 间越长（因为菌体细胞可以分泌出对菌体有保护作用的蛋白质性质物质，有降低热力的作用 （4）基质的影响因素 微生物的抗热力随着水分减少而增大，即使是同一种微生物，它们在干热环境中的抗热力要比在湿热环境 中的抗热力大得多； 基质中蛋白质，脂肪，糖等物质对微生物有保护作用，有些盐类的存在也可增强抗热力，但钙，镁离子存 在会降低微生物抗热力； PH 为 7 时抗热力最强，偏酸对抗热力减弱明显； 基质中有一些抑制性物质存在也可以减弱微生物抗热力，例如 SO2,亚硝酸盐， （5）加热温度和时间 温度升高，抗热力下降，加热时间越长，热致死作用越大，一定高温范围内，温度越高，杀菌时间越短 D 值：作用一定温度进行加热，活菌数减少一个对数周期时所需时间 Z 值：如果在加热致死时间曲线中，时间降低一个对数周期，所需升高的温度 两者之间关系： Z= 21 12 lglgDD TT 证明过程： 设 T1温度下菌数下降 10 n 需时 1 t即 1 D。n 1 D= 1 t 2 T温度下菌数下降 10 n 需时 2 t即 2 D。n 2 D= 2 t 则杀菌时间下降（ 21 lglgDD ）需温度升高 T2-T1故 21 lglgDD 与 T2-T1成正比关系 Z= 21 12 lglgDD TT 5.什么是大肠菌群，测检食品中大肠菌群的意义是什么？常用什么培养基？该培养基中各种 成分的主要作用是什么？这是一类什么性质的培养基？ 什么是大肠菌群，测检食品中大肠菌群的意义是什么？常用什么培养基？该培养基中各种 成分的主要作用是什么？这是一类什么性质的培养基？ 见 98.4 6.根据免疫学的原理，设计一种快速灵敏的检测细菌或毒素的方法，并说明原理。根据免疫学的原理，设计一种快速灵敏的检测细菌或毒素的方法，并说明原理。 检测食品中的致病菌和毒素的快速灵敏的检测方法有：免疫荧光技术，ELISA 酶联免疫技术，PCR 技术， 荧光酶标免疫分析，免疫电镜技术，放射免疫技术。DNA 探针技术，HPLC 高效液相检测细菌毒素， 采用 ELISA 和 FAT（荧光免疫）相结合的技术 原理：应用双抗体夹心法 (1)利用已知具有高度特异性的单克隆抗体捕获样品中的目的抗原（细菌，毒素）,如果目的毒素是一 种半抗原，只有免疫反应性没有免疫原性，不能直接刺激机体产生抗体则采用载体蛋白与之结合形成完全 抗原之后再制备具有高度特异性的单克隆抗体, (2)再以标记有酶的相同抗体与抗原结合，加入酶底物检测反应; 具体为以包被有高度特异的单克隆抗体混合物的 SPR 包被针吸取待检测样品，并利用固定于 SPR 包 被针上的单克隆抗体捕获目的抗原，而非特异性抗原则被洗去，特异性抗体和碱性磷酸酶的复合物和目的 抗原反应并结合，酶和底物（4-甲基伞形基磷酸盐）反应产生蓝色荧光，其强度与样品中的目的抗原含量 成正比。 另外一种方法，对于致病菌的话可利用被检测微生物的 16sRNA 序列设计一段特异的寡核苷酸序列进 行特异性杂交 00 年硕士题年硕士题 1.举例说明微生物的特点举例说明微生物的特点。 练习题第 2 题 答：微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。 特点：a.体积小，面积大：典型的菌株体积仅 1m3左右，比面值却极大 b.吸收多，转化快：发酵乳糖的细菌 1 小时可分解其自重 1000-10000 倍的乳糖 c.生长旺，繁殖快：大肠杆菌每分裂 1 次时间为 12.5-20.0min，每昼分裂 72 次，后代 4722366500 亿万个。 d.适应强，易变异：某些硫细菌可在 250甚至 300高温下生存。微生物个体一般是单细胞，单倍 体，繁殖快，数量多，即使变异率很低，也可在短时间内产生大量变异后代。如 1943 年每毫升青霉素生 产菌发酵液只分泌 20 单位的青霉素，而现在其发酵水平已经超过每毫升 5 万单位。 e.分布广，种类多：人体肠道中聚居着 100-400 种不同微生物，个数大于 100 万亿。 2.酸性食品和非酸性食品常用什么温度杀菌？为什么？酸性食品和非酸性食品常用什么温度杀菌？为什么？ 见 97.2 3.叙述微生物的营养物跨膜输送方式；叙述微生物的营养物跨膜输送方式； 练习题第 20 题 单纯扩散、促进扩散、主动运输、基团移位四种不同营养物质运送方式。单纯扩散、促进扩散、主动运输、基团移位四种不同营养物质运送方式。 比较项目比较项目 特异性载 体蛋白 特异性载 体蛋白 运送 速度 运送 速度 溶质运送 方向 溶质运送 方向 平衡时内 外浓度 平衡时内 外浓度 运送分子能耗 运送前后 溶质分子 载体饱 和效应 运送分子能耗 运送前后 溶质分子 载体饱 和效应 与溶质类 似物 与溶质类 似物 运送抑制 剂 运送抑制 剂 单纯扩散单纯扩散 无 慢 由浓至稀 内外相等无特异性不需不变 无 无竞争性无 促进扩散促进扩散 有 快 由浓至稀 内外相等特异性 不需不变 有 竞争性 有 主动运输主动运输 有 快 由稀至浓 内外高 特异性 需要不变 有 竞争性 有 基团移位基团移位 有 快 由稀至浓 内外高 特异性 需要改变 无 竞争性 有 4.当培养基中葡萄糖和乳糖同时存在时，当培养基中葡萄糖和乳糖同时存在时，E.coli 的生长现象并分析其原因；的生长现象并分析其原因； 本题是生物化学题，乳糖操纵子模型（大肠杆菌的二次生长现象） ，优先利用葡萄糖，当培养基的葡萄糖 消耗完之后经过一个停滞期然后开始二次生长，乳糖酶被诱导产生。生化三版有关乳糖操纵子问题 5.试设计一个试验证明基因突变的自发性和不对应性。试设计一个试验证明基因突变的自发性和不对应性。 本题考察平板影印培养法，周德庆二版教材 p206 面 答：采用 Lederberg 的影印平板法证明基因突变的自发性和不对应性，影印培养法影印培养法就是一种 通过盖章的方式能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同的遗传型菌落的接种和培养方法。它证明了 微生物的抗药性是在未接触药物前自发产生的，这一突变与相应的药物环境不相干是自发的 实验设计：利用影印培养法证明 E.coli 如何通过自发突变产生抗链霉素突变株 具体步骤如下： 首先把大量对链霉素敏感的 E.coli K12 细胞涂布在不含链霉素的平板（1）表面，待其长出密集的小菌 落之后，用影印法接种到不含链霉素的平板（2）上，随即再影印到含链霉素的选择性培养基平板（3）上。 影印的作用是保证这 3 个平板上所长出的菌落的亲缘和相对位置保持严格的对应性。 经培养之后， 平板 （3） 上出现了个别抗链霉素菌落。对培养皿平板（2）和（3）进行比较之后，就可在平板（2）的相应位置找 到平板（3）上那几个抗性菌落的“孪生兄弟”。然后将（2）中与此最相近的部位上的菌落再挑至不含链霉 素的培养液（4）中培养，再涂布到平板（5）上，重复以上各步骤，即可做到只要涂上越来越少的原菌液 至培养皿（5）和（9）上，就可得到越来越多的抗性菌落，最终甚至可以得到纯的抗性菌株细胞群。 因为全过程中原始的链霉素敏感株只要通过（1）-（2）-（4）-（5）-（6）-（8）-(9)-(10)-(12)的移种和选 择序列，也就是没有接触任何一点链霉素的条件下即可筛选到大量抗链霉素的突变株。证明基因突变的自 发性和不可对应性 6.果奶产品经过封口杀菌后，出现部分产品发生变质，是分析是什么原因，如何防止？果奶产品经过封口杀菌后，出现部分产品发生变质，是分析是什么原因，如何防止？ 变质题，见 97.4 7.试设计选育高纤维素酶高产菌的实验方案，如已知纤维素酶的合成是操纵子的阻遏机制， 如何利用这一机理设计有效的筛选方法？ 试设计选育高纤维素酶高产菌的实验方案，如已知纤维素酶的合成是操纵子的阻遏机制， 如何利用这一机理设计有效的筛选方法？ 筛选题，见 97.3， 01 年硕士题年硕士题 1试以梯度培养皿法来说明定向培育吡哆醇高产菌株的过程与原理；试以梯度培养皿法来说明定向培育吡哆醇高产菌株的过程与原理； 答：定义：通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板，在其上涂布诱变处理后的细胞悬液，经培养后再 从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应的抗药性突变株。 例如：筛选抗异烟肼的吡哆醇高产突变株 先在培养皿中加入 10ml 融化的普通琼脂培养基，皿底斜放，待凝，再将皿放平，倒上第二层含适当浓度 的异烟肼的琼脂培养基（10ml）待凝固后，在这一具有药物梯度浓度的平板上涂以大量经诱变后的酵母菌 细胞，经培养后即可出现抗性菌落、 推测：有可能产生了能分解异烟肼酶的突变株，也有可能产生能合成更高浓度的吡哆醇以克服异烟肼的竞 争性抑制的突变株，经检测后者为大多数。 2.试述微生物菌种保藏的原理。试述微生物菌种保藏的原理。 Lactobacillus bulgaricus 和和 Aspergillus niger 若要长期有效的 保藏，可分别采用哪些方法？为什么？ 若要长期有效的 保藏，可分别采用哪些方法？为什么？ 见 975，993 3 在以消毒奶为原料生产酸奶的过程中， 为什么要在尽可能短的时间内达到酸凝？可采取哪 些措施？ 在以消毒奶为原料生产酸奶的过程中， 为什么要在尽可能短的时间内达到酸凝？可采取哪 些措施？ 答：未加热的新鲜牛奶中由于牛奶含有抗菌物质，梭菌不能生长，然而加热之后，牛奶的 Eh 降低，梭菌 可以旺盛生长，同时，由于巴氏消毒奶不可能彻底杀灭原料中的细菌芽胞，因此，需要使消毒奶的 PH 值 迅速下降以抑制细菌芽胞生长，因为当 PH 小于 4.5 时，腐败细菌受到抑制无法生长 采取措施： 关键：1、用消毒的牛奶，以防止因牛奶而带入杂菌；2、缩短延滞期；3、控制冷藏的温度、时间，温 度过低会有多种菌生长，过低高会破坏牛奶中的蛋白质，缩短培养时间，卫生指标数；4、酸度，PH4.5， 芽孢不再生长，否则芽孢繁殖 4下列食品如果变质，主要是由什么类型的微生物所引起？下列食品如果变质，主要是由什么类型的微生物所引起？Why？1市售的米粉市售的米粉 2肉类 罐头 肉类 罐头 变质题，见 97.4 5利用免疫学原理设计一种快速灵敏的检测金黄色葡萄球菌的方法，并说明原理。利用免疫学原理设计一种快速灵敏的检测金黄色葡萄球菌的方法，并说明原理。 见见 996 答：黄曲霉毒素是一种半抗原，只有免疫反应性没有免疫原性，故不能直接刺激机体产生抗体。 具体方法：黄曲霉毒素+载体蛋白（MBSA）-形成完全抗原-刺激家兔-在家兔血液中提取黄曲霉毒素 的特异抗体(免疫球蛋白)-采用 ELISA 法(双抗体夹心法)可以快速测定黄曲霉毒素 具体步骤: (1) 将上述免疫获得的抗体吸附在微量滴定板的小孔中洗涤; (2) 加入待测样品,如样品中含有黄曲霉毒素,则和抗体特异结合,洗涤; (3) 加入酶联抗体,形成夹心,洗涤 (4) 加入该酶的底物,产生有色的酶解产物,比色,有有色酶解产物产生,证明有黄曲霉毒素存在,或反之 02 年硕士题年硕士题 1细菌芽孢有何特点？举例说明细菌芽孢实践的重要性。细菌芽孢有何特点？举例说明细菌芽孢实践的重要性。 练习题第 17 题 答：芽孢是某些细菌在其生长发育后期， ，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、壁厚、含水量低、抗逆性 强的休眠构造。无繁殖功能，芽孢有极强的抗热抗辐射，抗化学药物和抗静水压等特性。芽孢具有极强的 休眠能力，可以保存几年至几十年而不死亡，芽孢的有无、形态和位置，在细菌分类和鉴定中是重要的形 态学指标，实践上芽孢的存在亦利于菌种的筛选与保藏，有利于对各种消毒、杀菌措施优劣的判断等。 芽胞是一种休眠体，每一细胞仅形成一个芽胞，无繁殖能力。 产芽孢的菌有：革兰氏阳性菌：好氧的芽孢杆菌属，枯草芽胞杆菌 厌氧的梭菌属，肉毒梭状芽胞杆菌 芽孢八叠球菌属 革兰氏阴性菌：脱硫肠状菌属 实践重要性： （1） 菌种鉴定中的形态学指标 （2） 有利于菌种的筛选和保藏 （3） 衡量消毒灭菌措施的主要构造 举例：肉类罐头的肉毒梭状芽孢杆菌为灭菌程度的依据，一般 121，20min 外科器械灭菌以破伤风梭菌和产气荚膜梭菌的芽胞耐热性作为灭菌程度依据，一般 121，10min 在实验室或发酵工业以能否杀死自然界中耐热性最强的嗜热脂肪芽孢杆菌芽胞为目标， 一般 121， 20min 2如要长期保藏酸性食品和非酸性食品，常用什么温度杀菌？为什么？如要长期保藏酸性食品和非酸性食品，常用什么温度杀菌？为什么？ 见 97.2 3如何运用代谢调控理论使微生物合成比自身需求量更多的有用代谢产物？举例说明。如何运用代谢调控理论使微生物合成比自身需求量更多的有用代谢产物？举例说明。 见 97.1 4试用平板影印培养法证明基因突变的自发性和不对应性。试用平板影印培养法证明基因突变的自发性和不对应性。 见 00.5 5设计一种从自然界中筛选酸性蛋白酶产生菌的试验方案，说明其原理；若该酶作为食品工 业用酶，如何保证其安全性？ 设计一种从自然界中筛选酸性蛋白酶产生菌的试验方案，说明其原理；若该酶作为食品工 业用酶，如何保证其安全性？ 筛选题，97.3 03 年硕士题年硕士题 1长期保存低酸性和酸性食品采用什么温度杀菌长期保存低酸性和酸性食品采用什么温度杀菌,为什么？为什么？ 见 97.2 2试诉微生物菌种保藏原理试诉微生物菌种保藏原理.若长期保藏若长期保藏 Lactobacillus bulgaricus,Aspergillus niger,可分别采 用什么方法 可分别采 用什么方法,为什么为什么,简述过程及原理简述过程及原理 见 975，993 3 什么是大肠菌群 什么是大肠菌群,检测它的意义检测它的意义,常用方法和培养基常用方法和培养基,该培养基中各成分的作用该培养基中各成分的作用,是什么性质的 培养基 是什么性质的 培养基 见 98.4 4如何使微生物合成比自身需求量更多的产物如何使微生物合成比自身需求量更多的产物,举例说明举例说明 见 97.1 5设计筛选低温乳糖酶产生菌的实验方案设计筛选低温乳糖酶产生菌的实验方案,解释主要步骤和原理解释主要步骤和原理 见 97.3 6设计快速检测金黄色葡萄球菌的方法设计快速检测金黄色葡萄球菌的方法,说明原理说明原理 见 01.5 7如果下列食品变质如果下列食品变质,使什么类型微生物引起使什么类型微生物引起,为什么为什么,如何防止如何防止. (1)市售的面包(2)肉类罐头 见 97.4 04 年硕士题年硕士题 1. 试比较细菌、放线菌、酵母菌、霉菌细胞壁成分的异同，并讨论它们的原生质体制备方法试比较细菌、放线菌、酵母菌、霉菌细胞壁成分的异同，并讨论它们的原生质体制备方法 答：细胞壁成分比较： 细胞壁 细菌 肽聚糖，磷壁酸（G+） ， 脂多糖（G-） 放线菌 肽聚糖 霉菌 主要由几丁质构成， 酵母菌 葡聚糖 原生质体制备方法： 1) G+菌原生质体获得： 人工条件下用溶菌酶除净原有细胞壁或者用青霉素抑制细胞壁的合成后获得 2) G-菌原生质体获得：EDTA 鳌合剂处理去除 Ca2+，脂多糖（LPS）就解体，G-菌的内壁层肽聚糖 暴露出来，再用溶菌酶水解 3) 放线菌原生质体获得：同 G+ 4) 霉菌原生质体获得：纤维素酶 5) 酵母菌原生质体获得：用玛瑙螺胃液制备的蜗牛消化酶对酵母菌的细胞壁水解制备 2.在以消毒奶为原料生产酸奶的过程中，为什么要在尽可能短的时间内达到酸凝？可采取哪 些措施？ 在以消毒奶为原料生产酸奶的过程中，为什么要在尽可能短的时间内达到酸凝？可采取哪 些措施？ 见 01.3 3.在遗传育种过程中，紫外线是应用最方便和最普遍的诱变育种方法之一，为达到良好的诱 变效果，你认为怎样操作比较合理 在遗传育种过程中，紫外线是应用最方便和最普遍的诱变育种方法之一，为达到良好的诱 变效果，你认为怎样操作比较合理 答：操作方法如下 1. 由于存在光复活作用，故辐照和处理后的培养应避免可见光照射（应在红光下照射） 2. 微生物所受射线的制备取决于灯的功率，照射距离和时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量， 一般用 15W 的紫外灯，距离在 30cm，选用致死率达 90%-99.9%所需的辐射时间进行诱变处理，各类微生 物所需的最佳时间不同。 3. 照射不宜在肉汤等成分复杂的液体中进行，以免化学反应的干扰，同时要有电磁搅拌设备，以求照射均 匀，尤其在菌液浓度较大或菌体，孢子等较大时很容易在处理期间发生沉降，造成不均匀 4. 照射前紫外灯宜先预热 2030min，使光线稳定。 4.试述艾姆氏实验（试述艾姆氏实验（Ames test）法检测致癌剂的理论依据，方法概要和优点。）法检测致癌剂的理论依据，方法