一起甲型h1n1流感疫情实验室检测结果分析

1 / 10 一起甲型 H1N1流感疫情实验室检测结果分析 流感病毒分为：甲型（ A）、乙型（ B）和丙型（ C），甲型症状较严重，容易造成大流行；乙型症状较不严重，可造成大流行；丙型症状轻微，较少造成大流行。本次流感为一种新型呼吸道传染病，其病原为新甲型 H1N1 流感病毒，病毒基因中包含有猪流感，禽流感，人流感三种流感病毒的基因片段。甲型 H1N1 流感病毒属于正粘病毒科，甲型流感病毒属。典型病毒颗粒成球状，直径为 80-120nm，有囊膜，囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是红细胞血凝素（ HA），神经氨酸酶（ NA）和基 质蛋白 M2，病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为 10nm，为单股负链 RNA 病毒，基因组约为 13.6kb，由大小不等的 8 个独立片段组成。病毒对乙醇，碘伏，碘酊等敏感，对热敏感， 56 30 分钟可灭活。甲型 H1N1 流感潜伏期一般为 1-7 天，多为 1-4 天，通常表现为流感样症状，包括：发热，咳嗽，咽痛，咯痰，流涕，鼻塞，头痛，全身酸痛，乏力，部分病例出现呕吐和腹泻，可伴有眼部充血和扁桃体肿大，可发生肺炎等并发症，少数病例病情进展迅速，出现呼吸衰竭，多脏器功能不全或衰竭，患者原有的基础疾病亦可被诱发加重，呈现相应 的临床表现，病情严重者可导致死亡。甲型 H1N1 流感患者为主2 / 10 要传染源，无症状感染者也具有传染性。甲型 H1N1 流感主要通过飞沫经呼吸道传播，也可通过口腔，鼻腔，眼睛等处粘膜直接或间接接触传播，接触患者的呼吸道分泌物，体液和被病毒污染的物品亦可能引起感染 1。由于甲型 H1N1流感病毒属于一种新型呼吸道传染病毒，人体不具有保护性抗体，因此人群普遍易感。本病传播迅速，常呈地方性流行或大流行。 1 对象与方法 1.1 研究对象 从 2016年 9月 15日至 10 月 15日某大学某学院发生的 112名疑似甲型 H1N1流感病例中随机抽取的 35例疑似病例作为研究对象。 2 研究方法 2.1 抽样方法 分层抽样 分层抽样是指先将总体按某种特征分为若干次级总体 (层 )，然后再从每一层内进行单纯随机抽样，组成一个样本。该院分 A、 B、 C、 D 四个系，从每个系中根据单纯随机抽样的方法抽取共 35 例疑似病例进行采样，获取标本并进行实验室检测。 2.2 实验室检测方法 按照国家卫生部出台的甲型 H1N1 流感病毒实验室检测技术方案（试行） 2，应用 real-time RT-PCR方法、3 / 10 RT-PCR 方法、鸡 胚分离方法等实验室检测方法对 35 例疑似病例的标本进行检测。 2.2.1 标本的采集 采集 35 例疑似病例的咽拭子标本，置于无菌采样夜23ml中，立即用冰块或冰排保存或置于 4 （冰箱），并马上送至实验室进行甲型 H1N1 流感病毒的病原学检测，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。如不能立即试验应保存在-70 或 -70 以下，不应保存在 -20 。 2.2.2 核酸检测的材料及仪器 2.3 材料 RNA 提取试剂盒： QIAGen RNeasy Mini Kit 逆转录试剂盒： QIAGEN One step RT-PCR Kit real-time RT-PCR 试剂盒： Super ScriptIM Platirum One step Quantitative RT-PCR System RT-PCR 试剂盒： QIAGEN One step RT-PCR Kit 2.4 仪器。 冷冻高速离心机、漩涡振荡器、实时荧光定量 PCR 仪、PCR仪、凝胶成像仪、电子天平（ 1/1000） 4 / 10 2.5 甲型 H1N1 流 感病毒的核酸检测 基于 PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。 PCR 技术的基本原理类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物， PCR 由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。 RT-PCR 原理是以 RNA 为模板经逆转录产生 cDNA，再以 cDNA为模板进行 PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。甲型 H1N1 流感病毒的核酸检测方法包括real-time RT-PCR 方法和 RT-PCR方法。 2.6 病毒 RNA的提取 取咽拭 子标本 100ul置于 1.5ml灭菌离心管中，采用QIAGen RNeasy Mini Kit 操作说明提取 RNA。取 5ul 总 RNA进行逆转录，其余保存于 -70 。 2.7 real-time RT-PCR检测方法 real-time RT-PCR 检测方法检测甲型 H1N1 流感是用一组寡核苷酸引物和双重标记的 TaqMan探针，对呼吸道样本或体外培养的甲型 H1N1 流感病毒进行定性检测鉴定。引物和探针序列为美国 CDC 设计，引物和探针序列如下表： 本实验在 BSL 2 实验室内进行，所有样本操作均在生物 安全柜（ BSC）内进行，遵循生物安全三级个人防护。 2.8 RT-PCR 检测方法 RT-PCR 检测方法的引物序列为国家流感中心设计，引5 / 10 物如下表： RT-PCR 产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳技术，用 2%的琼脂糖凝胶进行电泳，时间 40min，用凝胶成像分析系统分析相应 PCR产物的条带。本实验在 BSL 2 实验室内进行，所有样本操作均在生物安全柜（ BSC）内进行，遵循生物安全三级个人防护。 2.9 甲型 H1N1流感病毒的鸡胚分离法 甲型 H1N1 流感病毒的鸡胚分离方法的实验室生物安全级别为 BSL-2，实验操作人员进行 BSL-3级防护。 网络实验室在收到标本后 24h内进行病毒接种。鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一。该方法是将 100ul临床标本注入鸡胚羊膜腔，再取 100ul临床标本注入鸡胚尿囊腔，在 35 下，进行甲型 H1N1流感病毒的培养， 2 3天后，获取鸡胚尿囊液和羊水，然后进行红细胞凝集实验和血凝抑制实验鉴定分离物。分离出的病毒株放于 -70 保存。 2.10 结果分析方法 配对设计资料的卡方检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。 3 结果 在 35 例甲型 H1N1 流感疑似病例中，利用 real-time RT-PCR 方法检测阳性 26例，阳性率为 74.29%；利用 RT-PCR6 / 10 方法检测阳性 24 例，阳性率为 68.57%；利用鸡胚分离法检出 19 例，检出率为 54.29%；甲型 H1N1 流感确诊病例共 27例（其中一例应用 real-time RT-PCR 方法检测为阴性，但应用鸡胚分离法可分离出病毒，所以应该是两种方法并联的结果），阳性率为 77.14%；（见表 1） 三种检测方法的检测情况 利用样本检测资料对 real-time RT-PCR 检测方法与鸡胚分离法对确诊疾病的灵 敏度有无差别进行统计学推断（见表 2）。 表 2 两种检验方法检验结果的比较 X2=4, P 0.05，差异有统计学意义，可以认为两种检验方法的灵敏度有差别，鉴于 real-time RT-PCR 方法阳性率为 74.29%，鸡胚分离法检出率为 54.29%，可以认为real-time RT-PCR 方法灵敏度高于鸡胚分离法灵敏度。 4 讨论 某大学某学院共有学生 206 名， 2016 年 9 月 15 日至10月 15日该大学该学院发生 112例甲型 H1N1流感疑似病例，均表现有发热，咳嗽，咽痛，流涕，头痛，全身 酸痛等症状。从 112 名甲型 H1N1 流感疑似病例中采用分层抽样的方法抽取 35例，采集其咽拭子送往网络实验室分别运用 real-time RT-PCR 方法、 RT-PCR 方法、鸡胚分离法三种方法进行实验室检测。本次检测的 35 例标本中，运用 real-time RT-PCR7 / 10 方法检测阳性 26例，阳性率为 74.29%； RT-PCR 方法检测阳性 24例，阳性率为 68.57%，因此可知 real-time RT-PCR方法比 RT-PCR 方法灵敏性稍高，可以检测出少量病毒 RNA。利用样本检测资料（表 2）对 real-time RT-PCR检测方法与鸡胚分离法对确诊疾病的灵敏度有无差别进行统计学推断，检验方法为配对设计资料的 X2检验，结果为 X2=4, P 0.05，差异有统计学意义，可以认为两种检验方法的灵敏度有差别，鉴于 real-time RT-PCR 方法阳性率为 74.29%，鸡胚分离法检出率为 54.29%，可以认为 real-time RT-PCR 方法灵敏度高于鸡胚分离法灵敏度。出现此现象的原因可能是由于：鸡胚分离法分离病毒可能对样本的要求较高，如样本保存过程中出现失误，造成样本中病毒死亡。病毒分离法可以诊断感染，但由于其耗时长，成本高 ，因此无法为临床诊断及时提供结果，在突发传染病应急工作中不常用，应用病毒分离法分离出的病毒常常为病例的确诊提供确切证据，病毒分离阴性并不能排除感。 甲型 H1N1流感爆发是指 1周内，在同一学校 (或同一校区、高校同一学院 )发现 10例及以上聚集性急性呼吸道感染症状者，且其中至少有 2 例为甲型 H1N1 流感确诊病例，即判定学校出现甲型 H1N1流感暴发疫情 3。因此，可以判定此次甲型 H1N1 流感的发生属于暴发流行。本次疫情的暴发历时 16天，传播较快，究其原因可能是与学生开学返校，8 / 10 集体生活引起聚集性群体性发病且无保 护性抗体有关。此次甲型 H1N1 流感小范围暴发的首发病例是从 市返校的 同学， 同学于 9 月 13日返校， 9 月 15日便出现发热 （ 39.2 ），咳嗽，咽痛，头痛，全身酸痛等症状。在此二十多天内，同院便有 112名同学有相同症状出现，多有明确接触史。 输入病例指在外地感染，回到本地后发病的病例。本起某大学甲型 H1N1流感的首发病例 为一例输入性病例。二代病例，指在一个家庭、病房、集体宿舍、托儿所、幼儿班组中第一个病例发生后，在该传染病最短潜伏期到最长潜伏期之间，易感接触者中因受其感染而发病的病例。由 此可知，本次甲流爆发的大部分病例属于二代病例，反映此次甲型 H1N1流感传染性较强。 本次甲型 H1N1 流感传播如此之快，究其原因可能与学校控制措施不力，造成病例不断成为传染源有关。在甲型H1N1流感流行期间，为控制流感进一步扩散，高校应加强流感的健康教育工作，在学校实行晨、午检，对因病缺课者进行登记追踪，以及适时采取停课隔离等控制措施。由于人群对甲型 H1N1 流感普遍易感，主要通过飞沫或气溶胶经呼吸道传播，也可通过口腔、鼻腔、眼睛等处粘膜直接或间接传播，所以甲型 H1N1 流感病毒的生物安全十分重要，即甲型9 / 10 H1N1 流感病毒及其样本的采集和储存应遵照世界卫生组织发布的实验室检测指南 4进行。甲型 H1N1流感病毒及其样本的运输，实验室活动及风险评估应按照世界卫生组织手册及引起当前全球疫情的甲型 H1N1 流感疑似或确诊样本操作实验室生物安全风险管理推荐技术指南 5进行，其中样本检测活动应在生物安全二级实验室进行，病毒分离和培养活动应在生物安全三级实验室进行 6。实验工作人员采取与实验活动相适应的个人安全防护措施，并对其进行必要的健康检查。相关的网络实验室须储备足够的个人防护用品，实验室消毒用品及适量的预防 和治疗药物。对实验室产生的相关废弃物的处理必须严格按照我国生物安全管理规定进行。 参考文献 1 The ministry of health. Circular on issuing “Diagnosis and treatment scheme of pandemic influenza A (H1N1)