家兔血浆中北豆根碱的高效液相色谱法测定及药动学研究

1 / 7 家兔血浆中北豆根碱的高效液相色谱法测定及药动学研究 作者：朱孝芹，臧亚如，张欢，刘翠哲 【摘要】 目的 建立家兔血浆中北豆根碱（ RM）的 HPLC分析方法，并对 RM 静注给药在家兔体内药动学过程进行分析研究。方法采用乙腈、二氯甲烷沉淀蛋白质并提取药物，采用 HPLC法测定。色谱柱为 Discovery C18 柱（ 4.6 mm250 mm ， 5 m ）； 流 动 相 为 乙 腈 水 磷酸=16840.15(VVV) ；检测波长 208 nm；柱温为室温；流速 0.5 mlmin -1；动物实验使用家兔 6 只，采用静脉注射给药（ 10 mgkg -1），进行血药浓度测定和药动学参数计算。结果家兔血浆内源物质对药物测定无干扰，在血药浓度0.01 0.10 mgml -1 范围内，浓度对峰面积有良好的线性关系， r= 0.999 8，提取回收率大于 85%，方法回收率在98.3% 100.5%之间；日内、日间精密度 RSD均小于 10%（ n=5）。北豆根碱在家兔体内的血药浓度 -时间曲线符合二室模型。结论该法准确、简便、灵敏，可用于北豆根碱在兔体内药动学的研究。 【关键词】 北豆根总碱； 高效液相色谱法； 家兔； 药动学 AbstractObjectiveTo establish an HPLC method for 2 / 7 determination of dauricine in rabbits plasma and study the related pharmacokinetics in rabbits after injection.MethodsAfter protein was precipitated with acetonitrile and dichloromethane, dauricine in plasma was determined on HPLC with UV detection at 208 nm, and the mobile phase was acetonitrile-water-phosphoric acid(16840.15), running at a flow rate of 0.5 mlmin -1. We detected the concentration of dauricine in plasma and caculated pharmacokinetic parameters by 6 rabbits after injection (10 mgkg -1).ResultsDauricine and endogenous could be separated. Its calibration curve was linear(r=0.999 8) within range of 0.01 0.1 mgml -1, the extraction recovery was more than 85%, the method recovery was within range of 98.3% 100.5%, the intra-day and inter-day precision was less than 10%(n=5). The concentration-time curve of dauricine in rabbits plasma could be fitted to two-compartment model.ConclusionThis method is sensitive, simple and accurate. It is suitable for the pharmacokinetic study of dauricine in rabbits. Key wordsDauricine; HPLC; Rabbits; 3 / 7 Pharmacokinetics 北豆根为防己科植物蝙蝠葛 Menispermum dauricum DC.的干燥根茎，有清热解毒、祛风止痛作用，其有效部位是生物碱，现已知北豆根中含有近二十种生物碱，总碱含量可达 1%以上，其中含量最高的生物碱为 RM，其含量约占总生物碱的 50%左右 1。临床及实验均证实 RM有良好的抗心律失 常作用，且 RM 延长心肌动作电位时程作用存在剂量依赖性 2。此外，北豆根碱还有抑制动脉血栓形成 3、抗氧化 4、抗肿瘤等 5作用，具有广泛的应用前景。本实验采用单剂量静脉注射给药的方法，检测北豆根碱在家兔体内的血药浓度，应用 3p87 软件计算药动学参数。 1 仪器与试药 80-2B 型台式离心机； 80 2B 型台式离心机； LG16 W型离心机； ZH-2型全自动涡流混合器； JASCO高效液相色谱仪（ UV-15紫外 -可见光检测器， RU 1580泵， CKChom 色谱工作站，日本）；北豆根饮片，市售，承德产 ，经鉴定为蝙蝠葛；北豆根碱，对照品，自制（含量 99.0%）；无水甲醇、磷酸为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 4 / 7 色谱柱为 Discovery C18 柱（ 4.6 mm250 mm ， 5m ）；流动相为乙腈 水 磷酸 =16840.15(VVV) ；检测波长 208 nm；柱温为室温；流速 0.5 mlmin -1。 2.2 对照品储备液精密称取北豆根碱对照品 (60 干燥至恒重 )5.0 mg置 25 ml容量瓶中，用流动相溶解并定容，作为对照品储备液。 2.3 样品处理方法 6 精密吸取家兔血浆 1 ml，加乙腈 0.5 ml，二氯甲烷 4 ml，旋涡混合 5 min， 3 000 rmin -1 离心 15 min，将有机相转入 10 ml离心管中，剩余水相再加入二氯甲烷 2 ml，同法萃取并离心，合并 2次萃取液， 40 水浴， N2 吹干，残渣用流动相 0.2 ml 定容，充分溶解后， 16 000 rmin -1离心 5 min，取上清液 20 l 进样。 2.4 标准曲线的制备取空白血浆 1 ml 置离心管中，加入北豆根碱对照品溶液，使其浓度分别为 0.01， 0.02，0.03， 0.04， 0.06， 0.08， 0.10 mgml -1，按 “ 样品处理方法 ” 项下操作，以 RM峰面积对 RM血药浓度进行回归，其回归方程为： Y = 1.53 108X + 1.8103 ， r = 0.999 8(n=7) ，线性范围为 0.01 0.1 mgml -1。 5 / 7 血浆样品典型色谱图见图 1 3。 2.5 回收率测定分别取空白血浆 1 ml，准确加入北豆根碱对照品溶液，配制高中低 3个浓度的血浆样品，按 “ 样品处理方法 ” 项下操作，使其最终浓度为 0.01， 0.06， 0.1 mgml -1，同时配制相同浓度的北豆根碱对照品水溶液进行测定，每个浓度测定 5次。计算提取和方法回收率。结果见表 1。表 1 RM 血浆样品回收率壹（略） 2.6 精密度测定将高、中、低浓度的对照品血浆分别进行日内精密度和日间精密度测定。结果见表 2。表 2 RM血浆样品的日内和日间精密度（略） 2.7 家兔血浆样品测定健康家兔 6 只，雌雄兼用，雌兔无孕，体重 (1.60.24) kg ，于耳缘静脉注射给予北豆根碱，剂量为 10 mgkg -1。于给药前和给药后 2， 5， 10， 20，30， 45， 60 min及 1.5， 2， 4， 6， 8， 12 h在另一侧耳缘静脉采血 2.5ml,置肝素化离心管中， 3 000 rmin -1 离心 15 min，分离血浆， -40 贮存备用。血浆样品照 “2.3” 项下处理，测定。将实验结果绘制血药浓度 -时间曲线如图 4 所示。应用 3p87软件进行模型拟和。以 AIC 和拟和优度（ r）为判别指标，确定血药浓度为二室模型。结果 RM 在家兔体内过程符合二室模型，其相关药动学参数见表 3。表 3 药动学参数（略） 6 / 7 3 讨论 家兔静脉注射 10 mgkg -1北豆根碱后，药物自中央室向周边室分布很快， T1/2 约为 5 min， 药物从中央室消除也较快， T1/2 约为 1 h， Vd值大于实际的体液体积，说明北豆根碱因脂溶性强而在体内广泛分布。 有文献报道 7 8，北豆根碱口服给药，在大鼠和狗体内存在着胃肠循环， C-T 曲线明显存在着双峰现象。狗大剂量 (50 mgkg -1)口服给药时，药物消除为非线性， T1/2，CL， AUC 等重要参数显著改变。但由于种属差异的问题，在兔体内是否也存在这一现象，尚需进一步研究。 在本实验中，从高效液相色谱图上可以看出，在给定的实验条件下，血浆中杂质不干扰测定，说明本实验的样品处理方和 色谱条件可行，通过 3 p87 药动学软件处理数据，北豆根碱在家兔体内符合二室模型，可做为人体药动学研究的参考。 【参考文献】 1徐国钧，徐珞珊，何宏贤，等中国药材学 M .北京：中国医药科技出版社， 1996. 2 Guo DL,Zeng FD,Hu CJ. Effects of Dauricine,quinidine,and sotlot on action potential 7 / 7 duration of papillary muscles in vitro J .Acta Pharmacol Sin， 1997， 18： 384. 3刘俊田，邱培伦，高小利山豆根碱对实验性血栓形成的影响 J .西安医科大学学报， 1991， 12(1)：33. 4何丽娅，李立中，吴基良，等 .蝙蝠葛碱的抗氧化研究 J .中草药， 1997， 28（ 8）： 479. 5叶祖光，王金华，孙爱续，等粉防已碱、甲基莲心碱、蝙蝠葛碱增强长春新碱诱导人乳腺癌 M