几种增加小鼠骨髓染色体中期细胞数方法的比较.doc

几种增加小鼠骨髓染色体中期细胞数方法的比较 【摘 要】目的：探索提高小鼠骨髓染色体中期分裂相的获得的方法。方法：小鼠随机分成3组，对照组、两次注射秋水仙素组和酵母组秋水仙素组，每组分别用注射冲洗法、剪碎静置法和剪碎震荡法收集骨髓细胞。结果：与对照组相比，两次注射秋水仙素组和酵母组秋水仙素组中期细胞有明显增加；与注射冲洗法相比，剪碎法获得的中期细胞数有明显增加。 【关键词】小鼠 染色体 中期细胞 染色体的结构和数目是研究生物体遗传、变异、发育的基础，而动物的骨髓细胞具有分裂旺盛、数量多等的特点，可以直接进行染色体标本的制备，不需体外培养和无菌操作，还可以真实反映完整机体所受的环境影响1。染色体是生物体遗传信息的载体，在细胞分裂时期（体细胞的有丝分裂和生殖细胞的减数分裂）特定存在，对处于分裂期的细胞经秋水仙素处理，阻断其纺锤丝微管的组装，使细胞分裂停止于中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态。染色体制备对人类遗传病、血液病的研究和诊断有着重要的临床意义，在医学细胞生物学和医学遗传学中是经典的实验项目之一。 在教学中用，学生可以通过实验了解小鼠染色体的数目及形态特征，掌握中期染色体制备的实验原理和方法。该实验操作步骤简单，但容易出现中期分裂相少、染色体过于短小、染色体分散不好、染色体边缘发毛等情况2，另外该实验需要实验前预处理，且耗时时间长，不利于在教学中推广。本文参考比较各种改进方法，先总结如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物 昆明种小鼠45只，体重（222）g，由新乡医学院实验动物中心提供。 1.2 实验仪器 解剖盘；眼科剪；低速台式离心机（上海手术器械厂）；电子天平（上海衡平仪器仪表厂）；双目光学显微镜；电热恒温水浴箱（上海跃进医疗器械厂）；隔水式培养箱（上海跃进医疗器械厂）；震荡器（常州国宇仪器制作有限公司）。 1.3 实验试剂 秋水仙素（上海抚生生物科技有限公司）；酵母粉；葡萄糖粉；甲醇；冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）；低渗液（0.075mol/LKcl）、生理盐水；Giemsa染液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。 1.4 实验方法 （1）实验动物处理：将酵母粉1g，葡萄糖粉2.2g，充分溶解于10ml蒸馏水中，放置于40恒温水浴箱中，1.5-2h。取小鼠45只；15只为对照组，实验前4h腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（体重）；15只为实验组1，在取材14h前，腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（体重），实验前4h腹腔注射秋水仙素10ug/gBW（体重）；15只为实验组2，取材前24h在小鼠背部皮下注射配置的酵母葡萄糖液10ul/gBW，实验前2h腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（体重）。（2）骨髓细胞收集：用颈椎脱臼法处死小鼠，用剪刀剪开四肢骨的皮肤和肌肉，用纱布将附在股骨上的肌肉搓净净，小心去除股骨两端，暴露出骨髓腔。将对照组、实验组1、实验组2再分为3组，每组5只小鼠，分别用三种方法收集细胞，一种是注射器吸取低渗液反复冲洗至股骨泛白，第二种，将股骨剪碎后放入培养皿中，加入3ml低渗液，静止8min，然后将上清液吸入离心管中备用；第三种，将小鼠股骨剪碎后移入离心管中，再加入3ml低渗液，然后用SK-1型震荡混匀器震荡30s，使骨髓细胞充分游离到低渗液中，离心取上清液。（3）预固定：取37的预热的低渗液5ml加入有骨髓细胞的离心管中，吹打混匀后至于37的恒温水浴箱中，保温30min后取出，加1ml固定液（甲醛：冰乙酸=3：1），1500r/min，离心10min，弃上清。（4）固定：于沉淀中加6ml固定液，吹打混匀，2000r/min，离心3min，弃上清。（5）制细胞悬液：于沉淀中加0.2ml-0.3ml固定液（视细胞量的多少），混匀。（6）制片：取-20预冷的玻片，于25cm处快速滴下，吹片是细胞悬液分散，与酒精灯火焰出烤片，往返5次，自然晾干。（7）染色：至于Giemsa染液中染色8min，取出标本，流水冲洗，室温晾干，在显微镜下镜检。 2 结果 小鼠染色体数为2n=40，制作成功好的染色体呈圆盘状分散分布，近端着丝粒染色，形态呈“U”形，极少有短小、聚集成团及相互缠绕等现象。 实验组1和实验组2较对照组染色体数有明显升高，特别是实验组2用剪碎法，染色体中期分裂相有明显的增多，而实验组1与实验组2的注射冲洗法相比，染色体中期分裂相没有明显的增高，各组间用剪碎震荡法和剪碎静置法获得染色体中期分裂相也没有明显升高，但较常规的注射冲洗法获得的中期分裂相有明显升高。如 3 讨论 染色体制备是生命科学研究和遗传学研究中的重要技术，小鼠骨髓染色体的制备操作过程虽然简单，但是制作过程中的微小改变，就能造成染色体中期分裂相少、染色体短小、重叠甚至断裂，相互缠绕等，影响检测效果3。本实验结果显示，取材前分两次注射秋水仙素和用酵母液加秋水仙素的方法可明显增加染色体中期分裂相；用剪碎法去骨髓细胞相比用冲洗法取骨髓细胞能更大量的获得染色体中期分裂相；但取材前用酵母液加秋水仙素混合注射比分两次注射秋水仙素，中期分类相虽有所增加，但没有明显的增多。由于样本的量小，实验结果可能会存在误差，需要在课程实践中增大样本检测量，进一步改进实验方法。 综上所述，取材前分两次注射小鼠、收集细胞过程中采用震荡法收集细胞，较传统的提前4h注射秋水仙素和用冲洗骨髓收集的方法，细胞的获得率，及中期分裂相的得率有很大提升，能够提高分裂中期染色体制备的效果。 参考文献： 1刘星，冯昆，张青峰等.小鼠骨髓细胞中期染色体标本制备方法的改进J.卫生职业教育，2015，18（33）：101-