米糠多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究(硕士论文).pdf

华中农业大学硕士学位论文米糠多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究申请学位级别：硕士专业：食品科学20060601华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意研究生签名：郦，L五时问：，D年。而9日；学位论文使用授权书本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、-E编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表。传播学位论文的全部或部分内客注：保密学位论文在解密后适用于本授权书学位论文作者签名：召M，岿导师签名：意磐鞠撕期：。编妇7日签名吼。年6月少日。米糠多糖的提取性质和抗肿瘤活性研究摘要本文以脱脂米糠为研究对象，对米糠多糖分离提取工艺进行研究、并对不同工艺提取的米糠多糖的理化性质及体内外抗肿瘤作用等进行初步研究，主要研究结果如下：1米糠多糖的提取工艺：热水提取米糠多糖的优化工艺为：料液比为l：10(ww)，温度为100，时间为1h，在此条件下米糠多糖的得率为O7；微波辅助提取米糠多糖的优化工艺条件为料液比为l：14(ww)，功率为600W，时问为9min，在此条件下米糠多糖提取率为11；预煮后纤维素酶和淀粉酶提取米糠多糖的得率分别为12和14；以混合酶水解处理的米糠多糖得率最高，为18。2米糠多糖的性质：六种工艺提取的米糠多糖均为口D吡喃葡聚糖结构，具有一定的吸湿性，含有少量的蛋白质和还原糖，不含淀粉；不同的提取工艺得到的米糠多糖的得率、性质，结构和纯度存在差异。3米糠多糖的抗肿瘤活性：六种工艺提取的米糠多糖都表现出一定的体外抗肿瘤活性，其中以蛋白酶提取和微波提取的米糠多塘的体外肿瘤细胞生长抑制率较高，最高剂量时分别为50和60。较高剂量的蛋白酶提取米糠多糖能明显抑Nd鼠st80瘤体的生长，适宜的浓度的抑瘤效果为569，与环磷酰胺接近。米糠多糖在抗肿瘤同时表现出对小鼠血清和肝组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肷过氧化物酶活性的促进作用。关键词：米糠多糖；提取工艺；结构；抗肿瘤；抗氧化；免疫活性华中农业大学2006届硕士学位论文ABSTRACTThisworkmainlyfocllSedonextractionandcharacterizationsofricebranpolysaccharide(Ri3s)，theantitumoractivitybothinvitroandinvivoofcrudeRBSwerestudiedThemainresultswereshownasfollows：ITheoptimalextractionprocessingparametersicrowave-assistedextractionweretheratioofwatertosample10：1(ww)，microwavepower600W：extractiontime10mins，andtheyield11，compared、iththatofthehotwaterextractionO7Precookingwflsgoodforhi。gheryieldwhenamylaseandcellulase、ereusedforextractionThreeenzymeswereusedintheextractionandthehighestyieldwas182RBSfromsixextractionswerehygroscopie，containingalittleprotein，n0starchPreliminaryconclusionwasthattheywerekindsofa-glucanDifferentextractioninfluencedthestructureofBRS3TheRBSextractedbyflavorzymeandmicrowaveshowedpotentantitumoractivityonSis0invitroandtheinhibmonrateofStso、ere50and60respectivelyHighdosageofRBSbyflavorzymeshowedpotentantitumoractivityontumor-bearingmiceandthehighestinhibitionactivityofSis0weFe569atthedosageof150mgkg。dRBScouldimprovesuperoxidedismutase(SOD)andglutathioneperoxidase(GSH-Px)anddecreasemalondialdehyde(MDA)inbloodserumandlivdhomogenateinmice。Keyword：Ricebranpolysaccharide；Extractionprocessing；Structure；Anti-tumor；Anti-oxidation；Immunomodulation2米禳多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究第一章绪论1米糠的成分及相关的米糠研究现状米糠是稻谷脱壳后依附在糙米上的表面层，由外果皮、中果皮、交联层、种皮及糊粉层组成，其化学成分以糖类，脂肪和蛋白质为主，还含有较多的维生素和灰分(周世英和钟丽玉。1986)。我国是世界第一产稻大国，年产稻谷约2亿吨，米糠是稻谷加工的副产品，约占稻谷质量的555，故我国年产米糠在1000万吨以上，约占世界总产量的13(童永鹏和阎蒙刚，2006)。米糠作为一种廉价的原料来源，并且因为含有大量的蛋白质、油脂、糖化合物、肌醇和Y氨基丁酸等成分，其成分的提取工艺研究以及性质研究成为研究的熟点。米糠是在稻谷经垄谷脱壳，碾米等加工精米过程中得到的副产品。当糙米经碾米机碾磨时，果皮糊粉层和大部分米胚都被碾去，这些碾去的部分在工艺学上叫做米糠(周世英和钟丽玉，1986)。米糠含有120o16的蛋白质、16-22的脂肪、8-12的粗纤维、约35的无氮抽出物、7-10的灰份和8-12的水分。目前，全世界每年生产大米约3亿吨，副产米糠500600万吨，数量相当可观，因此，米糠这一资源的有效利用引起了人们的广泛关注。近十几年来，世界各国围绕着米糠的深度开发利用做了大量的工作，特别是在其化学成分及药理作用方面所取得的一系列研究进展十分引人注目，据不完全统计，先后发表了40多项有关专利。国外科研人员的研究成果表明，从米糠中可以提取一系列具有药用价值的化学成分，这些化学成分具有抗肿瘤、降血脂，降胆固醇、杀菌，消炎、增强免疫等作用(姜燕，1992)。2植物多糖的研究进展21植物多糖提取工艺的研究现状多糖是动植物体内重要的生物活性物质，有许多关于活性植物多糖的报道，从一些常用的药用植物如人参、枸杞、黄芪、当归、五味子、甘草等中提取具有各种活性功能的多糖，也有从食用植物如南瓜、大蒜、葡萄、茶叶等中提取活性多糖。多糖由于具有广泛的药理作用，独特活性和低毒效应，随着分离提纯、组分测定和结构分析技术的日渐提高，多糖的研究继核酸、蛋白质后成为了另一个热点。多糖的提取是研究和应用多糖的一个重要环节。目前已有多种新的工艺应用于多糖的提取过程中，下面对目前应用的提取方法进行介绍：华中农业大学2006届硕士学位论文211物理方法2111热水提取热水提取法是一种常用的传统提取方法。大多数多糖的提取采用这一方法。熬制中药是一种在一定的温度下长时间用水浸提中药中有效成分的热水提取方法，为了充分有效的提取，通常需要花很长时间，目前这种方法跟不上快速、大量的工业化生产需求。随着科技进步，越来越多的新技术和新设备被用于植物中有效成分包括多糖的提取。2112超声波提取超声波是一种高频机械波，主要通过超声空化向体系提供能量，瞬间空化可实现5000C的高温和50MPa的局部高压。超声波能加速植物有效成分的溶出，它的、次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速提取成分的扩散4。释放并使之充分与溶剂混合，利于提取，因此在有机物降解和天然药物有效成分的提取等方面有一定的应用。其得率有可能大大超过索氏提取法，已被许多中药分析过程选为供试样处理的手段。该技术具有提取时间短、产率高、无需加热、有利于保护有效成分等优点。中药药用成分大多为细胞内产物，提取时往往需要将细胞破碎，而现有的机械或化学破碎方法有时难以取得理想的破碎效果，超声波在中草药的提取中已显示出了明显的优势(郭孝武，1993)。超声波处理南瓜后，南瓜细胞破裂，促进了南瓜多糖的提取，并且避免了因为高温提取带来的不良反应导致的颜色产生(向东，2004)；用超声波辅助提取芥菜中多糖的提取率为15O，大于传统热水112的多糖提取率(李夏兰等，2005)；但是超声波处理在提高提取率的同时会带来多糖的降解(林勤保等，1996)，引起结构的变化(Tanigamieta1。1991)。2113常温高压提取高压技术是最近发展起来应用于食品行业的一种新技术，主要用于食品的加工和灭菌。在有效成分提取工艺中也有研究。传统回流法、浸渍法和超声波法提取黄芪多糖的提取率分别为2389、2014和2256；而采用高压提取方法的提取率可达2428，比传统回流提取法增加2O，比浸渍提取法增加206，比超声法提取增加76。其特点是：常温提取，操作简便，有效成分无损失、无变性。生产周期短，提取率高，有利于纯化和分离，节省能源，无污染，经济性好，是一种非热“绿色”提取技术(刘春娟，2005)。4米椽多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究2114微波提取微波是电磁波的一部分，在微波场中，由于物质介电常数不同，物质吸收微波的能力也不同，使得提取体系中不同组分被选择性加热，因此，微波提取具有较好的选择性，使目标组分直接从基体分离。另外，微波强化提取受提取溶剂亲和力的限制较小，因而可供选择的溶剂较多，而且，微波所具有的非热效应可以松弛氢键，击穿细胞膜，加速溶剂分子对基体的渗透和目标组分的溶剂化，提高了提取效率。微波辅助提取技术与热水提法相比较，在多糖的提取方面具有提取率高，节省时间的优点，明显提高了提取效率。微波辅助提取技术提高提取效率的原因，主要是由微波加热的特殊性质决定的。从细胞破碎的角度看，微波加热方式将导致细胞内的极性物质，尤其是水分子，吸收微波能后产生大量的热量，使得细胞内部温度迅速上升，液态水分汽化产生的压力将使细胞膜和细胞壁急剧破裂，形成微小的孔洞，持续的迅速加热，将导致细胞急剧收缩，表面出现裂纹。细胞膜和细胞壁上孔洞和裂纹的存在使细胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物。对植物中有效成分的提取方面，微波强化技术具有操作时间短、溶剂消耗少、能耗低、有效成分损失少、目标组分得率高、不产生噪音等优点，已作为一种新型技术应用于有机污染物的提取、天然化合物及生物活性成分的提取等方面，特别是中药有效成分分析的样品制备过程中(张代佳等，2000)。在植物多糖提取方面，也有很多的报道。用微波提取工艺对荔枝和沙棘叶中多糖的提取做了尝试(赵二劳等，2005；董周永等，2006)；微波提取板蓝根多糖的得率和质量分数都比水提法的高(刘依和韩鲁佳，2002)；在茶叶多糖的提取过程中，用微波提取技术与传统热水浸提法相比较，具有提取率高，节省时间的特点(江和源和蒋迎，2003)。2，115冷冻融化法冷冻融化法是利用低温条件下植物细胞内冰晶形成过程中，冰晶体积增大对细胞组织产生破坏作用，从而达到破壁作用。过冷液氮淬冷破壁法可以使灵芝的细胞壁破碎，并且增加冻结、解冻循环次数能在一定程度上提高灵芝孢予破壁率(周顺华等，2002)；经过缓冻处理过的新鲜南瓜，大部分南瓜细胞呈破碎状态，使南瓜中的多糖溶出，从而提取率更高(向东等，2004)。2116超微粉碎超微粉碎处理后的样品粒径很小，样品的表面积相应增大，从而促进了有效成分的溶出速率。由于细胞壁在粉碎时大部分被破坏有效成分不需要通过细胞壁和细胞华中农业大学2006届硕士学位论文膜就能释放出来，这样就提高了有效成分的释放速度。超微粉碎处理过的黄芪和淫羊藿用热水浸提后多糖的提取率明显提高(刘迎，2006)；Knuckles指出干磨和筛分可以得到富含B葡聚糖的大麦和燕麦组分，可以使B葡聚糖的含量比籽粒中增加2449倍；干磨和气选分级也可以使B葡聚糖的浓度达到3l(Knuckles，1992)。Mallki等提出用乙醇处理，干磨和湿磨相结合可使燕麦麸皮的B-葡聚糖含量达1520(Mallki，1992)。21。2化学方法纤维索是细胞壁的重要构成成分之一，纤维素溶于稀碱，用稀碱液浸提提取植物组织能破坏细胞结构，从而促进多糖的溶出，增加多糖的提取率。用稀碱液对新鲜南瓜处理提取多糖成分时，发现南瓜细胞与细胞之间在碱液的作用下变得更加疏松，从而有利于南瓜多糖的提取(向东等，2004)。在pH92或10，温度为50条件下，可从燕麦麸皮中提取7089的B一葡聚糖(DawkinsandNnanna，1993)。在用碱法提取大枣渣中的多糖时，比较了Ca0，Na：CO和0H几种碱对大枣多糖提取的影响，发现选择Na。CO。做碱原料提取率高(杨云等，2004)。说明强碱能使多糖结构发生降解。在酸性条件下，同样会发生多糖降解问题。213酶法由于多糖以多种形式存在于植物体内，用酶法可降解植物组织，促进多糖成分的溶出，从而增加多糖的提取率。目前，酶法用于中药提取方面研究较多的是纤维素酶，纤维素酶可以破坏植物细胞壁，有利于有效成分的提取。用单酶、复合酶或发酵产生的酶来可提高真菌多糖的提取率(陈哲超和林字野，1995；李平作和孙希雯，1996；欧阳小丽，2004)。在热水浸提前用纤维素酶处理茶叶可大大提高茶叶多糖的提取率(刘冬和李世敏，2004)。214联合提取方法联合提取方法是将几种方法用于一种工艺提取过程中，利用各方法的优缺点互补，达到提高提取率，降低杂质含量的目的。22多糖结构与活性的研究概况多糖以多种形式存在于植物体内。根据它的存在部位，分为三类：细胞内多糖，细胞壁多糖和细胞外多糖。前者除淀粉形成颗粒外，其它以溶液或高度水合状态存在于液泡中，这些主要为果聚糖和甘露聚糖；细胞壁含纤维素、半纤维素、果胶和其他基质多糖，同时含有非糖聚合物如蛋白质、木质素等，细胞壁多糖主要指半纤维素和果胶类物质(张惟杰，1999)。6米糠多籍的提取，性质和抗肿瘤活性研究多糖的生物大分子结构非常复杂，不仅因为组成多糖的单糖的品种繁多(已知单糖约有200多种)，而且即使只是由一种单糖组成，因其连接方式不同，可能有支链，多糖的结构和功能也有所不同。多糖的构效的关系，是指多糖一级结构和高级结构，目前多糖的构效关系研究很不完善，主要是由于多糖的分子结构过于复杂所造成的。多糖的抗肿瘤作用与单糖之间的糖苷键的结合方式有关。葡萄糖是许多多糖的基本结构单位。水溶性D葡聚糖有抗肿瘤作用，尤其是直链、无过长支链不易被体内D葡聚糖酶水解的多糖具有明确活性。目前认为以B-1，3-葡聚糖和蚤-I，4-葡聚糖占优势的多糖具有明显的抗肿瘤活性。也有研究显示以aD-葡聚糖为主的多糖也有抗肿瘤作用。如云芝多糖以a-1，4-或B-D葡聚糖为主链，对多种肿瘤细胞生长有抑制作用，并能抑制3-甲基胆葸诱发的纤维肉瘤的肺转移、淋巴细胞白血病P。细胞淋巴转移以及其他肿瘤细胞的转移。对多糖构效关系的研究至今尚不完善，但高级结构对功能的影响比一级结构还重要。多糖的生物活性与其空间结构(立体结构)、分子量、分支度、取代基、溶解度、粘度等有关，甚至给药剂量、给药途径等也能影响其生物活性，决定不同种类多糖的免疫调节作用的差异，关键在于多糖免疫调节作用的构效关系。有关多糖构效关系的研究具有十分重要的意义，它不但有助于阐明各种多糖免疫调节的差异性，进而深化对其药学理论的认识，为新药开发打下坚实的基础，而且有助于对各种多糖的结构与化学合成的研究(王忠民，2002)。对于米糠多糖的结构有不同的说法，不同的提取分离处理方法，结构与功能活性不同。有研究报道认为用热水提取的米糠多糖如RBS，RON，RDP及SPR-901等是一类a一葡聚糖CVoshinorieta1，1991；Hiroyukieta1，1991；Hiroyuldeta1，1992；汪艳等，2000)，分子量超过l106Da单糖组分为葡萄糖；而Mamdooh等人通过酶修饰后获得的米糠多糖MGN3，分子量范围在6105Da-65106Da左右，其主链为木聚糖，其具体的结构未知：Hikino等人分离得到的降血糖活性多糖贝g主要由四种成份：OryzabransA(Mw20106Da)、OryzabrailsB(Mw52104Da)、OryzabransC(Mw74104Da)和OryzabransD(Mw80104Da)组成；Yamagishi等人采用饱和硫酸氨沉淀法分离得到一种米糠糖蛋白B，蛋白质含量高于50，但只是从化学结构的角度分析了该米糠糖蛋白的蛋白质与多糖部分可能是通过L阿拉伯糖与羟脯氨酸连接，未见其对分子量及其它结构特点的描述与分析，也未对其做生物活性方面的研究(Yamagisheta1。1976)。通过对国内外研究现状的综述可知米糠中多糖的种类是比较多的，不同的人通过不同的工艺方法所获得的米糠多糖类型及所研究的生物活性的角度也不尽相同。由于多糖有着种类繁多的结构，而且人类对于多糖参与生命活动微观作用的认识远7华中农业大学2006餍硕士学位论文少于对蛋白质和核酸的了解，同大部分多糖一样，人们对米糠多糖的结构及其活性机制的深入研究还有待于科研工作者的继续努力。3研究目的和意义为了提高米糠多糖的提取率，采用微波技术和酶水解方法多种工艺进行米梭多糖提取率的比较，初步研究不同工艺方法对米糠多糖性质和结构的影响，初步研究不同工艺方法对米糠多糖活性的影响，并从其对氧自由基的消除及抗脂质过氧化作用方面来探讨米糠多糖的抗癌效果。4本论文的主要研究内容本论文的研究目标是提高米糠多糖的提取率，提取米糠中具有免疫调节活性的多糖类物质，研究其分子结构及其抗肿瘤作用机理，并探讨其分子组成与生物活性之间的关系。本论文的主要研究内容：1研究热水提取工艺的较优条件，优化微波提取工艺和酶法水解提取米糠多糖；并对这几种工艺的得率进行比较。2研究六种工艺方法提取的米糠多糖的基本物化性质，初步分析它们的单糖组成和进行光谱分析，对它们的结构进行初步探讨。3初步研究六种提取工艺的米糠多糖体外抗肿瘤活性，并选择活性较高的两种进行体内抗肿瘤实验，以进一步验证其抗肿瘤活性。米辕多糖的提取，性质和抗肿瘤活性研究第二章米糠多糖的提取工艺研究1引言从天然植物中提取多糖大多数可采用一定温度的水或稀碱溶液做溶剂来提取；由于多糖存在于植物组织的细胞结构中，有些多糖不容易溶出，需要通过各种手段破碎细胞壁、分离组织中缔结组分或糖化合物。从某些生物组织中提取多糖前，还需进行脱脂或脱色处理等，预分离工艺可在提高提取率的同时可以降低目标产物的杂质成分，有利于获得较高纯度的产品。提高米糠多糖的提取率，有利于降低成本，节约原料。因此粗多糖提取工艺研究在整个多糖研究过程中是一个相当重要环节。本实验中除了采用传统常用的热水提取方法外，尝试了对原料进行细微化处理，还进行了微波提取，酶水解提取等方法，并进行了优化，以期得到更高的米糠多糖提取率。2材料与方法21实验材料211原料_米糠：2005年秋季稻，湖北银欣米业有限公司212主要试剂纤维素酶：活力15Umg，分子量约52000，上海东风生化技术有限公司淀粉酶：高温d一淀粉酶蛋白酶：风味蛋白酶(flavorzyme)丹麦诺维信酶制剂公司乙醇：AR，上海振兴化工一厂石油醚；AR，天津化学试剂有限公司浓硫酸：AR，河南信阳化学试剂厂苯酚：AR，上海化学试剂厂213主要仪器水浴锅：HH6型，江苏省常州市国华电器有限公司微波炉：WLS1型，南京三乐微波研究所离心机：TDL-5A型，上海安亭科学仪器厂球磨机：QMESP2型，南京大学仪器厂生产真空冷冻干燥器：Alpha1-4LD型，德国MCHRIST公司9华中农业大学2006届硕士学位论文22方法221分析方法2211米糠粗脂肪含量的测定：索氏抽提法(GBT551285)；2212米糠蛋白质含量的测定；凯氏定氮法(GB5009585)；2213米糠水分含量的测定：105恒重法(GB5497-85)；2214多糖的测定：硫酸苯酚法(张惟杰，1999)。222脱脂米糠的制备及基本成分将米糠过40目筛，用石油醚回流抽提4h，然后通风橱内风干，在50。C烘箱中烘5h。原料米糠中水分含量为1152，脂肪含量为2047：脱脂干燥处理后水分含量为458，脂肪含量为49，蛋白质含量为973。223工艺流程2231热水提取工艺。按一定比例往脱脂米糠中加入蒸馏水，置于三角瓶中，搅拌均匀，在定的温度下保持一定的时间，冷却后离。&(2000rlmia，IOmin)，取上清液按25：Rvv)加a淀粉酶，80C保温2h：沸水灭酶30min，离一=(2000rmm，lOmin)后取上清液，加入乙醇到终浓度为30，离心去上清得沉淀，加一定的蒸馏水复溶，离，L(2000rrain，lOmin)取上清，然后50(2真空旋转浓缩、冷冻干燥得水溶性米糠粗多糖(下统称米糠多糖)。2232淀粉酶处理提取工艺按一定比例往脱脂米糠中加入蒸馏水，置于三角瓶中，搅拌均匀，加入a淀粉酶80C保温1h后沸水浴1h，冷却后离一C(2000rmin，lOmin)，其余工艺部分与热水提取工艺相同。2233蛋白酶处理提取工艺将淀粉酶改加为蛋白酶，保温温度为50。C，其余工艺部分与淀粉酶处理工艺相同。2234纤维素酶处理提取工艺将淀粉酶改加为纤维素酶，调节pH值到49，保温温度为50(2，其余工艺部分lO米臻多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究与淀粉酶处理工艺相同。2235混合酶处理提取工艺分别加入蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶三种酶，在其适宜的温度和pH值条件下处理，后续工序与淀粉酶处理工艺相同。2236加入预煮处理的提取工艺在酶处理过程之前先沸水预煮20min，酶处理后沸水40min灭酶，后续工序与前相同。224球磨处理条件将409脱脂米糠，并称取大小磨珠共重849(重量比例为60：24)，两者混匀(不加介质)后装入球磨机玛瑙罐中，调节转速为450rmin，进行一定时间的球磨粉碎。球磨粉碎后米糠的温度不高于40。225微波辅助提取工艺按一定比例往米糠中加入蒸馏水，在一定的功率下微波先处理几分钟，让物料温度升到80C100C(温度超过100C时物料容易喷出三角瓶，造成很大的试验误差)。然后取出摇动三角瓶，降温后继续置于微波炉中加热lmin(保证物料温度不超过100C)，取出继续摇，如此反复，直至到达计划的时间，取出冷却后离心(2000rmin，10rain)，其余工艺部分与热水提取工艺相同。226得率计算得率cb鼍篇掣圳。227试验数据处理采用SAS曾81和MicrosoftExcel却软件进行数据处理。华中农业大学2006届硕士学位论文3结果与分析3。1热水提取米糠多糖311料液比对米糠多糖得率的影响图2-1为80条件下不同料液比提取1h的米糠多糖得率。从图中看出，随着加水量的增大得率逐渐提高，但是提高到一定得率增加不显著。因此，以下用料液比为1：10(ww)做单因素实验。00印O001：6l：8l：10l：12料水比，ww(80C，lh)图2-1料液比对米糠多糖得率的影响Fig2-1Influenceofliquidsolidratio011theextractingratio312温度对米糠多糖得率的影晌图22为在料液比为l：lO(ww)、提取时间为lh，不同提取温度下米糠多糖的得率。随着温度的提高，得率逐渐提高，在IOO时提高很显著，而在120和100之间提取率没有显著的差异，因此用100提取做单因素实验。嘏糌之256080100120温度，(1：10，lh)图2-2温度对米糠多糖得率的影响Fig2-2Influenceoftemperatureontheextractingratio米操多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究313提取时间对米糠多糖得率的影响图2-3为在100热水，料液比为hlO(ww)条WF，不同提取时间下的米糠多糖得率。从图中看出，1h比05h得率有显著的提高，1h和更长时间没有显著性的差异，得率最高为07。誊碍骧o5h1h15h2h3h时间。h(Ioo。1：lO)图2-3时问对米糠多糖得率的影响Fig2-3Influenceoftimeoiltheextractingratio综上所述，通过热水提取的单因素试验结果可知，用热水提取米糠多糖得率最高的条件：料液比为1：lO(ww)，时间lh，温度100C，最高的得率为07。32原料细微化处理对米糠多糖得率的影响图2-4为经过Oh50h球磨处理的米糠在100(2、料液比为l：lO(ww)的条件下提取1h的米糠多糖得率。从图中可看出不同球磨处理时间的米糠经热水提取的米糠多糖得率为07左右，没有显著性的差异。080-7g06缚o5砭040302Oh5h10h20h30h40h50h球蘑时间hOooc。lh，1：10)图2-4原料细微化对米糠多糖得率的影响Fig20Influenceofultra-fineeomminufionontheextractingratio由上可看出，在此试验条件下通过球磨处理减小米糠粒径到一定的程度并不能提高米糠多糖的得率。报道指出，将大分子的多糖如淀粉球磨处理后分子量减小，华中农业大学2006届硕士学位论文在常温下糊化，水溶性增加(史俊丽，2005)。本实验预试验过程中，也发现冷水条件下米糠多糖经球磨处理后得率增加的现象，但增加幅度不如因温度变化导致米糠多糖得率增加幅度大。说明米糠多糖与淀粉之间有一定结合关系。33微波辅助提取米糠多糖33。1正交试验根据预实验结果，选择料液比、微波、时间三项为考察因素，各取3个水平，进行采用L9(33)正交试验设计，其实验因素与结果见表21。表2-1微波辅助提取米糠多糖正交设计试验结果Table2-1ResultsofortbogonaltestonRBSextractionbymicrowave表2-2为方差分析结果，模型的F值为4492，P值小于O0001说明三个因素对米糠多糖得率的影响达到显著性的水平，其中料液比对米糠得率影晌最大，其次依次为时间、功率。选择各因素平均值最大的水平作为最优的工艺条件，即为料液比为l：14(ww)，功率为600W，时间为9min，能耗为5400Wmin。由于在能耗为5400Wrain条件下，正交试验结果得到的米糠多糖得率最大，为了进一步摸索条件以得到更高的得率，所以用能耗为5400Wmin时的不同时间和功率条件进一步试验。14米糠多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究表2-2方差分析结果Table21ResuitsofANO、後332不同微波功率和时间多糖得率由图2-5可知，根据能耗一定不同的功率与时间条件下，功率为600W、时间为9min条件下得率最高，即11。誉斟备辎热水120w45min360wlSmin600w9min840w65min图2-5同一微波能耗下的多糖得率Fig2-5Extractingratiounderthesameenergybymicrowave从细胞破碎的微观角度看，微波加热导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞；进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞或裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物(张代佳，2000)。与热水提取相比，微波具有更强的渗透性，微波使水更容易进入细胞内，溶解出更多的成分其中包括多糖成分，所以合适的微波条件可以提高米糠多糖的得率由上可知，与热水提取比较，微波提取工艺不仅能提高米糠多糖的得率(约为热水提取的15倍)，而且工艺时间缩短为原来的15，显示出微波提取工艺巨大的15llO00OOO华中农业大学2006届硕士学位论文工业化应用潜力。34酶法提取米糠多糖341不同酶的处理对米糠多糖得率的影响图2-6为采用不同的酶处理方法提取得到的米糠多糖得率。从图2-6可知，不同酶处理得到米糠多糖得率从高到低为：蛋白酶纤维素酶淀粉酶不加酶。121#08静0。6040。20川窝禽淀粉酶蛋白酶纤维素酶不加酶图2-6不同酶处理对米糠多糖提取的影响Fig2-6Influenceofdifferentenzymeontheextractingratio由于米糠中多糖主要存在于水稻颖果稃片和颖片的细胞壁中，与纤维素、半纤维素、淀粉、蛋白质等成分复杂结合，要提取水溶性多糖，首先要使细胞壁成分降解或分离，从热水提取米糠多糖的实验可知升温的方法促进米糠多糖的提取；从本实验结果可知，加入酶水解后，米糠多糖的得率都有所增加，其中蛋自酶水解提取的得率最高，其次是纤维素酶水解提取，淀粉酶水解提取增加较最小。从上可知，由于酶的水解作用，可以将与多糖相结合的蛋白质、纤维索、淀粉等成分水解，促进了米糠多糖的溶解，从而使米糠多糖的得率提高，所以加入蛋白酶和纤维素酶能增加米糠多糖的得率。342预煮对酶处理米糠多糖提取的影响由图27可知，预煮后，除蛋白酶水解提取米糠多糖的得率较未预煮的没有显著性的提高外，经淀粉酶、纤维素酶处理得到的米糠多糖较未预煮都有显著性提高(a淀粉酶纤维素酶=蛋白酶，其中混合酶水解处理米糠多糖的得率最高，达到18。预煮过程会使米糠中淀粉糊化，物料粘度加大，蛋白质发生变性，纤维素的结晶结构发生变化，三种成分发生的变化都有利于相应的酶水解。结合上图可知，该过程对淀粉酶和纤维素酶的作用效果影响显著，而蛋白酶的作用效果却没有反映出16米辕多糖的提取，性质和抗肿瘤活性研究来，说明米糠多糖在细胞组织内与淀粉和纤维素组分结合较为紧密，而与蛋白质结合不紧密。：14孔08拦02淀粉酶蛋白酶纤维秉酶混合酶图27预煮对米糠多糖提取率的影响Fig27Influenceofpre-cookingontheextractingratio4结论41采用热水提取、微波提取、淀粉酶提取、蛋白酶提取、纤维素酶提取、混合酶提取等工艺方法得到米糠多糖的得率分别为：07、11、146、122、128和18。热水的提取温度为100C，料液比为l：lO(ww)，提取时间为1h；微波提取米糠多糖的优化工艺条件为：料液比为h14(ww)，功率为600W，时间为9min，混合酶提取时米糠得率最高。42米糠多糖存在于细胞壁或细胞内，与淀粉和纤维素分子较为紧密的结合在一起。17华中农业大学2006届硕士学位论文第三章米糠多糖的性质、结构研究1引言多糖结构是其生物活性呈现的基础，认识和了解多糖的结构有助于更好地利用和开发多糖。多糖构效关系研究表明，多糖中单糖的组成、糖苷键的类型、异头物构型、取代基及取代位置、糖链有无分支及分子大小等对其生物活性都有影响。由于米糠中存在多种类型的多糖，不同提取工艺得到的米糠多糖的单糖组成，结构以及分子大小是否一致，对于其生物活性是否产生差异影响非常重大。因此本章初步对六种工艺提取的米糠多糖进行结构分析，一方面证实所得到的米糠多糖是否属于已知的多糖类型；另一方面为这几种多糖是否具有活性和具有的生物活性差异提供一些参考依据。2材料与方法t21实验材料211试验样品按第二章方法制备米糠多糖样品。212主要试剂硅胶GCP中国青岛海洋化工集团公司阿拉伯糖AR上海化学试剂厂核糖生化试剂上海化学试剂厂葡萄糖AR中国医药公司北京采购供应站木糖生化试剂上海伯奥生物科技有限公司半乳糖生化试剂上海伯奥生物科技有限公司SepharoseCL2B300美国Sigma公司正丁醇、异丙醇、丙酮、三氟乙酸、羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钠、磷酸、氯乙酰、甲醇、三甲基氯硅烷、六甲基二硅氮烷、冰醋酸、碘、碘化钾、浓硫酸、苯酚，以上试剂均为国产分析纯试剂。213主要仪器与设备旋转蒸发器：BuehiREUI型，Switzerland紫外可见分光光度计：UV-265FW型，Shimadzu，Japan气相色谱仪：Agilent6890N型红外分光光谱仪：PEParagon1000FT型，Japan米糠多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究恒温水浴锅；上海医疗器械五厂干燥箱：重庆试验设备厂一分厂分析天平：AC2IOS型，SartorillS，German真空干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司乌氏粘度计：1836稀释型，上海宝山启航玻璃仪器厂22实验方法22-1基本成分分析糖含量测定：以葡萄糖为标准品制作标准曲线，采用硫酸苯酚法(张惟杰，1999)蛋白质含量测定：以牛血清蛋白(BSA)溶液为标准制作标准曲线，采用考马斯亮蓝法(韩雅珊，1992)222单糖组成分析样品衍生物的制备：取样品O059防于安培管中，加25mL2的三氟乙酸封口在105水解12h，冷却至室温，然后70(2减压干燥。加入3mL毗啶溶解，再加入06mL六甲基二硅氮烷及06mL三甲基氯硅烷，室温下反应15min，加少许无水Na2S04，10000rmin离心3min，取上清01uL上气相。标准单糖衍生物的制备：准确称取各单糖标准品5mg，各加入O5mL吡啶溶解，再加入O1mL六甲基二硅氮烷及01mL三甲基氯硅烷，室温下反应15min，加少许无水Na2S04，10000rmin离心3min，取上清01IlL上气相。气相色谱分析条件：石英毛细管柱HP5(5-苯基聚硅氧烷黄聚物色谱柱，30m032minX025弘m)，氢火焰离子化检测器，检测器和进样口温度均为280，H2流量为300mUmin，空气流量为3000mLmin，N2流量为300mLmin，分流比为30：1，程序升温条件为150停留4min，以100Crain升至160停留8min，再以10min升至180停留2min，最后以4Cmin升至2lO停留4min(张惟杰，1999)。223紫外光谱法多糖溶液(2mgmL)经UV-265FW紫外可见记录光谱仪于190nm400nm扫描。224红外光谱分析RSPSL3经KBr压片，全反射光谱测定法(ATR)进行测定。光谱测定范围4000cm400cm，仪器分辨率O5cm。扫描次数32。19华中农业大学2006届硕士学位论文225特征粘度测定在恒温(30C)条件下，利用乌氏粘度计测定蒸馏水和米糠多糖水溶液的流出时间to和t，则米糠多糖水溶液的粘度比巩一古，粘度相对增量=玑-1，粘数为n；p，c，对数粘数为InnC，以rI。p，C和InrlIc分别为纵坐标，C为横坐标作图，得两条直线，分别外推至C-O处，其截距即是特征粘度【rI】。胁】=lim鲁：lhn簪226凝胶过滤柱层析将多糖溶液经024um薄膜过滤后，取2ml滤液上柱(层析柱：1775cm)进行层析，用50mmolLNaCL的洗脱液(含002的叠氮钠)洗脱，洗脱液流速为16mLh。用自动部分收集器洗脱液，每管收集4ml，取Iml洗脱液用苯酚一硫酸法测定总糖。3结果与分析31基本理化性质分析表3-1米糠多糖的基本理化性质Table3-1BasicphysicochemicalcharacteristicsofRBS表31为六种工艺提取的米糠多糖的基本理化性质，六种样品多为浅黄色，具有一定的吸湿性，吸水后颜色加深；与碘试剂反应均无蓝色显示，说明提取样品中不含淀粉；与斐林试剂反应有颜色，说明样品中含有还原糖；与考马斯亮蓝试剂反应阳性，说明样品中含有蛋白质，经凯氏定氮法测定上述方法提取的米糠的多糖的蛋白质含量分别为608、303、307、369、356和358；综合可知，六种工艺提取的多糖中含有少量的蛋白质和还原糖，不含淀粉。米糠多糖的提取，性质和抗肿瘤活性研究32单糖组成分析表32为单糖和各种工艺提取的多糖经衍生化后过气相后的出峰时间表，由于糖的异构化，在某些某些衍生物的制各过程中，会产生衍生物的异构体，使色谱分析时每种糖产生几个峰(张惟杰，1999)。试验中木糖出现了三个峰、阿拉伯糖出现了一个峰、其他的糖出现了两个峰。淀耪薅1图31不同工艺提取米糠多糖的衍生单糖的气相色谱图Fig31GaschromatographyofthetrimethylsilyIderivativesofsixricebranpolysaccharides由图3-1可知，六种工艺提取的米糠多糖的衍生物均在213min和241min两处出现峰，说明这六种糖的单糖组成成分相同，再对照各种单糖的衍生物的出峰时间可知，葡萄糖的衍生物刚好在这两个出峰时间上出现峰，说明这六种米糠多糖是21竺!查些盔堂!竺!旦堡主兰垒兰塞均由葡萄糖组成的葡聚糖。表32标准单糖和样品的衍生物出蜂时间表Table32RetentiontimeofthetrimethylsilylderivativesofmonosaecharidesandRBS衍生化样品出峰保留时问min标糖一葡萄糖2143524043标糖_二半乳糖2046121797标糖三木糖153252041221746标糖四阿拉伯糖11823标糖五核糖1338413881样品一热水2137424077样品二微波2115923874样品三淀粉酶2139624107样品四蛋白酶2136324069样品五纤维素酶2138824098样品人混合酶213962410233紫外光谱分析图3-2不同工艺提取米糠多糖溶液的紫外扫描Fig32UVspectrumofsixricebranpolysaeeharides米糠多糖的提取、性质和抗肿瘤活性研究从图32可知，六种工艺提取的米糠多糖均在280nto处无明显吸收峰，在220hm和260nto处有吸收峰，可能存在氨基酸杂质成分，也可能是多糖中存在与氨基结合的现象，可能的氨基酸基团为核酸、苯丙氨酸和酪氨酸。34红外光谱分析l一商i一j订i赢一-一热水提取蛋白酶提取淀粉酶提取微波辅助提取纤维素酶提取混合酶提取图3-3米糠多糖的红外光谱图Fi93-3mspectrumofthetrimethylsilylderivativesofricebranpolysaccharides华中农业大学2006届硕士学位论文表34多糖的红外光谱分析表Table3-4IRanalysisofpolysaccharide从图谱3-3可知，这六种多糖具有以下结构特征(见表3-4)，3500cml3000cml的宽峰是沪H和NH的伸缩振动峰，存在着分子间和分子内的氢键，且其宽峰性状为典型的一COOH峰形。在3000cml“2800cm。1的一组峰是糖类C-H伸缩振动，1440cm。11395cml的一组峰是羧基-COOH中C-O的伸缩振动，由这两组峰则可以初步判断这六种化合物为糖类化合物。在1600cm-”1800cm1组峰中，1650cml左右的为酰胺基RCONHR一的酰胺I吸收带，1540cml是N-H的变角振动，为RCONHR-的酰胺II吸收带，可能是蛋白质杂质造成的。淀粉酶水解提取和混合酶提取的米糠多糖在这两个带没有明显的吸收。从红外光谱的指纹区(1000cml)可知，这六种多糖测得917cm-113cml吸收带有一较强吸收峰，推测是由葡萄糖毗喃糖类化合物糖环的非对称收缩的coc骨架振动引起的。844cm18cml的吸收带是d型cH变角振动的特征吸收峰区，具有Q一型差向异构体的特点(张惟杰，1999)。因此可以推断这六种多糖以Q-D-吡喃葡聚糖为主要成分。皇旨一Ui鲞壁量望塑堡塞：竺堡塑蔓壁塑适丝堕塞一一35特征粘度图34为六种工艺处理所得米糠多糖在水溶液中的浓度与n。c及InTIrc的关5040善30三皇20鸯lOO0善20三1510000100020003000400050浓度，Gg，砌3025u20善王15。鲁loF5O000005000lO0015000200025浓度C，gml1815罢12墨9色o630000t000200030004浓度Gg，“000005O001000150002000250003浓度C，gml0000050001000150002000250浓度C。g，d000l00020003浓度Cgrd图3-4米糠多糖在水溶液中的浓度与llc及InTIrc的关系图(30C)Fig3-4Relationshipbetweenconcentrationand11spC，Inll小inRBSwatersolution口、厶It斟甜”：2坦96，0otI丑口一芝dsf华中农业大学2006届硕士学位论文由表35可见，纤维素酶处理得到米糠多糖的特征粘度值最大，其次依次为蛋白酶提取样，微波辅助提取，淀粉酶提取样和混合酶提取样，热水浸提样所得米糠多糖的特征粘度在六种处理方法中最小。溶液的粘度不仅与分子量有关，还与聚合物分子的结构、形态和在溶剂中的扩张程度有关。提取工艺对米糠多糖的分子结构或分子量产生了影响，导致多糖的粘度不同。36凝胶过滤柱层析图35是六种工艺提取的米糠多糖凝胶过滤柱(GelPermeationChromatography，GPC)层析图，从图中可看出，每种多糖只有一个峰，出峰时间不同。其中出峰前后顺序依次为微波提取、纤维素酶提取、热水提取、蛋白酶提取、混合酶提取和淀粉酶提取。只有一个峰说明提取的多糖具有一定纯度，多糖的出峰时间与多糖分子量有关，出峰越早，分子量越大。图中可以看出微波工艺提取的米糠多糖分子量最大，其次是纤维素酶提取、热水提取、蛋白酶提取、混合酶提取，淀粉酶提取的米糠多糖分子量最小。2521