pcr实验报告实验分析

1 / 16 pcr 实验报告实验分析 PCR实验报告 7月 19日 高遄 实验目的：了解 PCR 技术原理，掌握最基础的 PCR实验步骤。 实验试剂：模板 DNA， Mg2+， buffer， dNTPs， Taq DNA聚合酶，引物， H2O，石蜡油。 实验原理： ? PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或 DNA序列最常用的方法。 ? 基本原理：首先将双链 DNA 分子在临近沸点的温度下加热分离成 2 条单链 DNA 分子， DNA 聚合酶以单链 DNA为模板并利用反应混合物 中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的 DNA 互补链。 PCR 反应时，只要在试管内加入模板 DNA、PCR 引物、四种核苷酸及适当浓度的 Mg2+， DNA 聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增 100万倍以上。 双链模板 DNA 分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板 DNA 两端的特定序列相结合，产生双链区。 DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。 在后续反应中，无论是起始模板 DNA 还是经复制的杂合 DNA 双链，都会在高温下解 2 / 16 开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板 DNA。 由于在 PCR 反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计 的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的 DNA 链上都有新的引物结合位点。 整个 PCR 的反应全过程，即 DNA 解链、引物与模板DNA结合、 DNA 合成三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链 DNA分子数，即两条引物结合位点之间的 DNA 区段 的拷贝数，理论上的最高值应该是 23 / 16 ，能进一步满足遗传分析的需要。 ? 试剂作用： 引物： DNA 复制的起始点，针对复制 DNA片段的两端，有 5引物和 3引物 Taq DNA 聚合酶：促进 dNTPs 与模板结合。 Buffer： Tris-HCl 反应缓冲液， Taq DNA 聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 Mg2+：对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则 影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的 DNA新链。 石蜡油：防止 PCR 加热过程中 DNA 蒸发。 ? 试剂配置体积： 热启动： 94， 510min 变性： 94， 4560s。 退火： 5065， 1min。退火温度计算： Tm-， Tm=4 +2。 延伸： 72， 1。 步骤 热循环 2530个周期 保温：延伸 72， 10min 4 / 16 ? 产物检测：凝胶电泳。 实验步骤： 设计 20 l 体系各试剂配比： 按照预先设计的 20 l体积配置 6 管试管量，实际加入量如下表 完成后分 6 管加入 pcr管中，每管 15 l体积，标注1-6 号码。 在前 1-4 号 PCR 管中加入模板 DNA，在 5 号管中加入 C3H 模板作为阳性参照， 6 号中不加任何模板 DNA，作为阴性参照。 在加完模板的 6管试剂中各加入 20 l石蜡油 将 PCR管放入 PCR 仪，按之前设定的加热温度与时间设置 a热启动： 94， 2min； 80， 1min； 此时在各管中加入 dNTPs 4 l b变性： 94， 30s； c退火： 65，； d延伸： 72， 2min 步骤 bd循环 40次 e保温： 72， 10min 完成后用 3%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 实验结果： 5 / 16 PCR目标产物约为 295bp 琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示 1 2 3 4 5 6Marker 1、 2 号泳道为性小鼠 DNA模板的 PCR产物 3、 4号泳道为性小鼠 DNA模板的 PCR产物 5号泳道为 C3H阳性参照 6号泳道为阴性参照 由 Marker 参照可知， PCR产物大小约为 290300bp PCR扩增及 DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳 1131428 环境科学 一、实验目的 1学习并掌握 PCR扩增的基本原理与实验技术。 2对扩增后的 DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增 多聚酶链反应技术的原理类似于 DNA 的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板 DNA、四种脱氧核苷酸、耐热 Taq聚合酶及两个合成 DNA 的引物，而后加热使模板 DNA在高温下变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温与模板 DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至6 / 16 中温，在 Tap 酶作用下，用四种 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和 DNA 合成这 一循环，使产物 DNA 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物 DNA可作为后一循环的模板 DNA而参与 DNA的合成，使产物 DNA的量按指数方式扩增。经过 30 40个循环， DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。 DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的 DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物， 利用 DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 三、实验材料 仪器： PCR 扩增仪、薄壁管、离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。 试剂： TapDNA聚合酶、 dNTP、 buffer、两种引物、16S全长 DNA样本、无菌 ddH2O、模板 DNA 、 TBE、琼脂糖、EB、显色剂。 四、 实验步骤 7 / 16 1. PCR扩增 本次试验选择细菌 16S rDNA V3 区片段进行扩增。 根据计 算，首先取离心管按照 10 Buffer 、 1 ul dNTP、 ul 341GC、 ul 534、 ul Taq、 ddH2O 的比例配置足量的 PCR反应体系。 分别向 9 个薄壁管中分别加入 24 ul的反应体系，并分别添加 8种不同的模版，并于第 9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。 将薄壁管放入 PCR扩增仪中，按照预定程序进行 PCR扩增。其中循环过程需要达到 3040 次。程序如下： 预变性： 94 3min 循环： 94 变性 30s 55 退火 30s 72 延伸 30s 末次延伸： 72 5min PCR扩增完成后，将样品取出并保存于 15环境中。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验 称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至 60左右，在胶液内加入适量的 EB。 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。 8 / 16 待胶凝固后 ，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。 在槽内加入 TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取 1 l缓冲液和 5 l待测 DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。 接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过 5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。 观察溴酚兰的带的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室 外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。 五、实验结果与讨论 如图所示：从左至右，分别是模版 1-8号，第 9 列为阴性对照。 前 8 列均有明显的条带出现，而阴 性对照无显示，说明扩增整体效果很 好。图中有上下两条线，上面一条线所 覆盖的条带基本可以代表扩增的产生 的片段位置，参照图可以看出扩增片段 在 200bp左右。在第 9个阴性对照的第 9 / 16 二条线处可以看到较为模糊的条带，并 非是出现假 阴性，而是由于二聚物而产 生的条带。通过该条带与最右侧的 marker对比可知该片段出现在 100bp左 右，并非由于实验操作等问题而产生的 污染。 实验的照片显示实验结果有拖尾 现象，但是并不影响后续实验。在实验 过程中由于有些试剂加到了管壁上面， 并没有完全加入，可能会出现一些误 差。另外在第 1 列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实验结果较为满意。 六、实验注意事项 1.由于 PCR 技术非常敏感，可使一个 DNA 分子得以扩增，装有 PCR试剂的离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。 PCR 扩增反应的条件，要控制好温度、时间和循环次数。 2.最好在加完所有其它反应成分后才 加模板 DNA。 3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。 10 / 16 具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。并在专门的实验室内使用。 七、实验收获 1.通过本次实验学习并掌握了 PCR反应的基本原理、实验过程及技术。 2.通过本次实验掌握了电泳实验分离 DNA 的原理和方法。 八、思考题 1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？ 通过 PCR 扩增出想要的片段，然后通过凝胶电泳实验进行回收，并与合适的载体连 接，转化进感受态细胞。经过培养提取质粒，进行酶切或 PCR 验证，测序最终验证，保存菌种 2.一对引物序列为 5 -GACTCCAGTCGAATCTACCA-3和 5 -AACCGTGGCGACACCGCTAA 请计算它们的 Tm 值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做 PCR 时没有得到相应的产物，你怎么解决？ 5 -GACTCCAGTCGAATCTACCA-3 Tm值 =4+2- =4+2- 11 / 16 =60 - =5055 5 -AACCGTGGCGACACCGCTAA Tm值 =4+2 - =4+2 - =64 -=5459 因此退火温度可以选择在 55 可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的 Tm5，以 2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm值。引物对的 Tm差异如果超过 5，就会令引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5 或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 实验四 定量 PCR 扩增 姓名：李宗翰 专业：环境工程 学号： 1432999 同组人姓名：刘雪飞 一、实验目的 复 12 / 16 习定量 PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程 二、实验原理 实时荧光定量 PCR 是在 PCR 反应体系中加入荧光基团 ，利用荧光信号累积 实时监测整 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 PCR扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过 Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 三、实验仪器及材料 real time PCR 仪 ，微量移液器， Tip头，光学薄 壁管， 8联 PCR管，离心管， SYBR Mix，引物及 108 copy/ul 标准品 四、实验步骤 1、标准样品稀释：取 4个的离心管，写上标记 107， 106, 105, 104，向每 管加入 90 l ddH2O，取 10 l 108 copy/ul 的标样加入到 107 管中，充分混匀 后，从管中取 10 l 107 copy/ul 的液体到 106 管中。按上述操作依次稀释，得到 5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换 Tip头。 2、配制预混液：取 119 l ddH2O、 7 l引物 4204f、13 / 16 7 l引物 4448r和 7 l Rox 到装有 175 l SYBR Mix 液的离 心管中，混匀。 3、分装预混液：取 7 个小离心管，分别标记 108、107、 106、 105、 104、 UNK 、 NTC。向其中分别加入 42 l 预混液和 l 模板，混匀。 4、戴上手套取两个 8联管，并排放置管架上。分别取上述样品 20 l 至第 1-7 管中，每个样品两个重复，共 14个样品。将加好样的 8 联管振荡。 5、设置分析仪参数如下： 95 3min； 95 15s+60 40s为一个循环，循环次 数 40，融解曲线温度范围 6095。振荡好 的样品进机进行 PCR扩增。 6、扩增后利用软件分析 CT值及未知样的定量结果。 五、实验结果与讨论 1、实验结果如何？试分析。 答：实验结果及分析如下。 、实验具体数据见下表 Quantity Well Task C C Mean C SD Quantity Mean Quantity SD Ct Threshold A1 STANDARD 100000000 14 / 16 A2 STANDARD 100000000 B1 STANDARD 10000000 B2 STANDARD 10000000 C1 STANDARD 1000000 C2 STANDARD 1000000 D1 STANDARD 100000 D2 STANDARD 100000 E1 STANDARD 10000 E2 STANDARD 10000 F1 UNKNOWN 59501332 58302584 F2 UNKNOWN 57103836 58302584 G1 NTC G2 NTC 其中， A-E 为标准样品， F 为位置样品， G 为阴性对照。每个样品做两个平行。 通过软件分析，由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为 107。 、扩增曲线 从扩增曲线中可以看出，样品均经历了良好的扩增过程。 、标准曲线 从标准曲线中可以看出， R2 值较好，标准曲线可以15 / 16 使用。但扩增效率一般。其中 106 和 107的两