（中药学专业论文）萸连缓释片体外稳定性及体内药理药效学的研究.pdf

| 一 贵阳中医学院硕士学位论文相关声明1 1 i i i v 1 1 i 。1 1 ，1 1 u 1 1 1 6 1 i i 7 1 1 原创性声明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 t ： 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者： 日期：山rd 年【弱t 夕目 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位沦文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 作者签名导师签 隅如年( 聂t 日 目录 中文摘要1 英文摘要2 前言“3日u舌“”“”“”“”“3 正文“”一”一”“7 第一部分课题研究的实施方案7 第二部分实验研究9 第一章课题组前期开展相关工作的要点回顾9 第二章萸连缓释片体外制备工艺的改进9 1h p l c 法检测萸连缓释片提取液中盐酸小檗碱的含量9 2 萸连缓释片累积释放百分率测定1 5 3 本章小结1 8 第三章萸连缓释片稳定性研究1 8 l 仪器与试药1 8 2 考察项目1 8 3 加速实验法1 9 第四章动物体内试验2 2 第一节萸连缓释片抗胃溃疡作用药效学研究2 2 1 材料”“2 2 2 模型制作及指标检测2 2 3 结果与结论2 4 第二节萸连缓释片家兔胃漂浮性能考察2 6 1 动物体内试验考查内容2 6 2h p l c 法测定家兔胃内容物的盐酸小檗碱含量方法学考察2 7 第三节萸连缓释片药理学考察3 3 1 家兔胃液酸度测定3 3 2 家兔胃液中胃蛋白酶活性测定3 7 第三部分全文结论及讨论4 1 1 讨论一”4 1 2 结论4 2 3 存在问题4 3 4 创新点4 3 全文总结与展望4 5 参考文献4 7 附录一综述4 8 附录二图谱5 7 附录三致谢1 0 0 附录四个人简历1 0 1 贵阳中医学院硕卜学位论文 中文摘要 目的：对萸连缓释片的稳定性、在家兔胃内的滞留时间及其体内药理、药效 学进行研究，为萸连缓释片的临床应用提供理论依据。 方法：以盐酸小檗碱含量为指标，运用稳定性实验中的常温实验法以及经典 恒温法，考察萸连缓释片的稳定性，确定其有效期；通过分析不同给药时段家兔 胃容物中盐酸小檗碱含量，考察萸连缓释片胃内滞留时间；测定胃液酸度及胃蛋 白酶活性，考察萸连缓释片对胃酸及胃蛋白酶活性的抑制作用；采用无水乙醇造 模、水浸拘束造模i 消炎痛造模三种方法，以给药后胃溃疡面积大小为考察指标， 对萸连缓释片胃内药效进行研究。 结果：通过稳定性实验，萸连缓释片的有效期暂定为两年；对家兔胃内滞留 时间的考察表明，萸连缓释片在胃内漂浮时间达到1 2 h 以上；不同时段的给药组 间数据比较结果显示，萸连缓释片有明显的长期抑制胃酸及胃蛋白酶活性的作 用；结合药效学实验结果可以得出，萸连缓释片在胃内能起到治疗胃溃疡的作用， 并且有持续释放药物的效果。 结论：结合已完成的前期研究成果，通过对萸连缓释片的稳定性及体内外药 理药效学研究发现，所制备的骨架型缓释片能达到缓慢释放的效果，并且治疗胃 溃疡效果显著。为传统复方缓释制剂的临床研究提供理沦参考。 关键字：萸连缓释片；稳定性；药理学；药效学 贵阳中医学院硕l 学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t ，t ot h es t a b i l i t yo fy u l i a n h u a n s h i p i a n ， r e s i d e n c et i m ei ns t o m a c ho fa n i m a la n dp h a r m a c o d y n a m i c s ，p h a r m a c o l o g yc o n d u c t s t h er e s e a r c h ，p r o v i d e st h et h e o r yb a s i sf o r t h ey u l i a n h u a n s h i p i a n sc l i n i c a la p p l i c a t i o n m e t h o d ：w i t hb e r b e r i n ec o n t e n ti n d i c a t o r , u s i n ge x p e r i m e n ta tr o o m t e m p e r a t u r e a sw e l la st h ec l a s s i c a li ns t a b i l i t yt e s t ，s t u d yt h es t a b i l i t yo f y u l i a n h u a n s h i p i a na n dt o d e t e r m i n et h e i rv a l i d i t y a d m i n i s t e r e dt h r o u g ht h ea n a l y s i so fd i f f e r e n tp e r i o d si nt h e r a b b i ts t o m a c h c a p a c i t yo fb e r b e r i n ec o n t e n ti nm a t e r i a l s ，s t u d yy u l i a n h u a n s h i p i a n g a s t r i c r e t e n t i o nt i m e d e t e r m i n a t i o no fg a s t r i c a c i d i t ya n dp e p s i n a c t i v i t y , s t u d y y u l i a n h u a n s h i p i a no ng a s t r i ca c i da n dp e p s i na c t i v i t yi n h i b i t i o n ，u s eo fe t h a n o l m o d e l i n g ，f l o o dm o d e l i n gb i n d i n g ，x i a o y a n t o n gm o d e l i n g ，t h r e ek i n d so fm o d e l i n g m e t h o d st ot h es t o m a c h ，g a s t r i cu l c e rs i z ea f t e rt h ea d m i n i s t r a t i o nf o ri n d i c a t o r s ，t o s t u d yt h e y u l i a n h u a n s h i p i a ns t o m a c he f f i c a c y r e s u l t s ：t h r o u g ht h es t a b i l i t yt e s t ，y u l i a n h u a n s h i p i a ni s v a l i df o rt w oy e a r s t e n t a t i v e t h es t u d yo fr a b b i tg a s t r i cr e t e n t i o nt i m es h o w e dt h a ty u l i a n h u a n s h i p i a n f l o a t i n g i nt h es t o m a c ht i m et or e a c hf o rm o r et h a n12 h d i f f e r e n t t i m e d a t a c o m p a r i s o nb e t w e e nt h et r e a t m e n tg r o u ps h o w e dy u l i a n h u a n s h i p i a nh a sal o n g - t e r m s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d g a s t r i c a c i da n d p e p s i na c t i v i t y c o m b i n a t i o n o f p h a r m a c o d y n a m i c se x p e r i m e n t a lr e s u l t sc a nb eo b t a i n e dt h a ty u l i a n h u a n s h i p i a ni nt h e s t o m a c hc a n p l a y ar o l e i n g a s t r i c u l c e r t r e a t m e n t ，a n d h a st h ee f f e c to f s u s t a i n e d r e l e a s ed r u g s c o n c l u t i o n ：c o m b i n e dt h ep r e l i m i n a r ys t u d yr e s u l t st h a th a sb e e nc o m p l e t e d ，t h e s t a b i l i t ys t u d y w i t h y u l i a n h u a n s h i p i a n a n di nv i v o p h a r m a c o d y n a m i cs t u d y p h a r m a c o l o g i c a ls t u d yf o u n dt h a tt h ep r e p a r e ds k e l e t o n t y p es u s t a i n e d - r e l e a s et a b l e t h a v et h eo b v i o u s l ye f f e c to fs l o w - r e l e a s e ，t r e a t g a s t r i cu l c e r , p r o v i d eat h e o r e t i c a l r e f e r e n c et oc l i n i c a lr e s e a r c ho ft r a d i t i o n a ls u s t a i n e d r e l e a s ef o r m u l a t i o n so f c o m p o u n d k e yw o r d ：y u l i a n h u a n s h i p i a n ；s t a b i l i t y ；p h a r m a c o l o g y ；p h a r m a c o d y n a m i c 2 i 1 立题依据 贵阳中医学院硕十学位论文 埠- 日舌 1 1 左金丸缓释制剂( 萸连缓释片) 的剂型改革依据 临床治疗的需要胃溃疡病( g a s t r i e u l e e ，r g u ) 是常见多发病，据统计， 临床发病率为1 0 左右，是一种病情较重、病程较长的慢性病n 1 。然而治疗胃溃 疡的普通剂型药物在临床运用上难以精确定量化，市售左金丸颗粒大小的不均， 临床上医生处方的差异，都可能导致患者日服用量的不准确。如果改成缓释制剂， 不但能够精确定量化，而且使得药物进入人体的血药浓度平稳，大大降低了临床 上用于治疗胃溃疡药物对人体所产生的毒副作用并且提高疗效。 剂型发展的需要中国医药历史悠久，有独特的中医药理论体系，疗效确切， 但目前大多数制剂还停留在“粗、大、黑的阶段，采用先进的制药技术，研究 开发高效、长效的中药缓控释制剂是十分必要的，是中药制药工业发展和社会需 求发展的必然趋势，也是中药现代化的必然。 左金丸的传统制备方法是用药材粉木泛丸，虽然其治疗胃溃疡的作用比较确 切，但是本身仍然有着作用时间短，服用量大，服用次数频繁等缺点。临床上常 用于治疗胃溃疡的中成药制剂有胃舒灵冲剂、胃溃灵冲剂、陈香露白露片、益胃 宁和胃特灵等，有一定的治疗作用，副作用小。但是，都是片剂、颗粒剂和口服 液等普通剂型，在胃内滞留时间仅有2 3 小时或更短的时间，难以发挥持久的治 疗作用，而且频繁用药给患者带来诸多不便。胃溃疡疾病多为慢性疾病，需要较 长时间的用药来控制和治疗疾病，因此这种服药方式无疑给病人带柬很大的不 便。 此外，普通汤剂口服后还有可能使血液中的药物浓度起伏很大j 产生峰谷现 象，血药浓度高时可能会产生毒副作用，血药浓度低时有可能在有效治疗浓度以 下。这时候研究出一种能够在胃内起到滞留作用，能够持久在胃内释放药物的新 剂型显得尤为重要。 现代研究成果为此研究提供了可能现阶段对左金丸中黄连，吴茱萸的盐酸 小檗碱及吴茱萸次碱的作用成分药效学研究取得阶段性进展，并且对于两味药相 互问的配伍比例变换，同样经过了动物试验研究的筛选。通过对左金丸药理效应 的研究，以及体内药代动力学的确定再到左金丸动物体内药效学的研究等，基本 f 气 贵阳中医学院硕 ：学位论文 明确了有效成分在体内的作用机制。从而为萸连缓释片的体内研究打下了有力的 基础。 从以上三个方面考虑，将疗效确切的左金丸制成缓释制剂后，药物服用次数 减少；而且服药后能在较长时间内维持一定的血药浓度，提高了药物的疗效和生 物利用度，降低了药物的服用剂量和不良反应，使药物能够更好地服务于临床。 1 2 萸连缓释片体内研究课题依据 萸连缓释片的来源本实验属于2 0 0 6 年贵州省科技教育人才省长基金资助 项目萸连缓释片的研制 黔科教办( 2 0 0 6 ) 0 7 号 其中的一部分研究项目。对 ， 。 于左金丸制备成骨架型缓释片的依据以及所用辅料的比例都已经过前人的研究 筛选。进一步的体内研究所用萸连缓释片均根据已确定辅料比例进行压制。 萸连缓释片的体内研究近年来，中医经典名方左金丸的体内研究取得新进 展，临床应用范围也不断拓宽。其中主要有针对左金丸中黄连，吴茱萸药对的体 内分析，左金丸总生物碱对胃肠功能的影响等。这些研究为制成萸连缓释片体内 研究提供了研究基础，更为将来进入临床研究做好准备。 2 国内外研究状况 2 1 胃溃疡发病机理研究状况 消化性溃疡( p e p t i e u l e e r ，p u ) ，尤其胃溃疡( g a s t r i e u l e e ，r g u ) 足临床的 常见、多发疾病。国外有学者统计，p u 发病率占总人口的1 0 左右。g u 的病因 学尚未完全明了，国内外学者相继提出了多种假说，但通常认为溃疡的发尘足物 理( 过热或过冷) 、化学( 乙醇、某些解热镇痛抗炎药) 及生物因子( h p ) 等胃粘膜攻 击囚素与防御因素( 如n 0 及其合成酶等) 之间失衡的结果。随着对g u 认识的不断 深入，国内外科研工作者对g u 的治疗进行了积极的研究，但由于其发病机制复 杂，至今仍没有根治g u 的药物。 2 2 胃内漂浮制剂的研究状况 t o s s o u n i a n 和s h e t h 最早对胃内漂浮制剂进行了详细的描述，称之为“生 物有效性制剂”心3 1 。2 0 世纪8 0 年代初 l o f m a n n l ar o c h e 公司首先推出了 v a l r e l e a s e 和v a li u mc r 两个漂浮制剂品种。困内外一直关注漂浮制剂作为缓、 控释给药系统的研究，丌发了许多新品种。据统计国内办有胃内漂浮制剂上市， 但尚多集中于西药丌发上，中药方面较少。 贵阳中医学院硕 ：学位论文 2 3 左金丸复方研究状况 值得注意的足对本方的研究目前多按黄连与吴茱萸6 ：l 比例来进行，面对甘 露散，茱萸丸和反左金丸等类方的研究却较少，可进一步探讨黄连与吴茱萸不同 剂量配伍的药理作用，治疗消化系统疾病及其它疾病的临床疗效和应用，不但可 探明丹溪心法组方的用量比例的科学依据，还可找到发挥最好疗效的配伍剂 量，来拓宽本方的应用范围。 2 4 左金丸方中黄连，吴茱萸单味药药理作用研究状况 黄连：经大量研究证明，黄连具有抗实验性消化道溃疡，治疗胃炎的作用， - ： 其物质基础是生物碱，用含小檗碱和黄连总碱的制剂对应激性胃溃疡，乙醇致胃 黏膜损伤性胃溃疡，幽门结扎型胃溃疡和乙酸灼烧型胃溃疡这4 种实验性消化性 溃疡的治疗均有剂量依赖性防治作用，其对小鼠应激性溃疡作用( 小檗碱为1 3 0 m g k g ，黄连总碱为1 5 0m g k 9 1 ) 似优于西咪替丁( 1 0 0m g k g 。1 ) ，对乙醇致 胃粘膜损伤、幽门结扎型胃溃疡和乙酸灼烧型胃粘膜损伤作用( 小檗碱为1 0 0 m g k g 。1 黄连总碱为1 2 0m g k g _ ) 优于西咪替丁( 7 0m g k g 叱) n 1 。h i r a n o h 伟1 对黄 连中具有防治乙醇引起胃损伤的成分进行了分离和研究，结果表明，黄连碱和氧 化黄连碱c - 9 和c 一1 0 位上的次甲二氧基能够抑制胃损伤，且具有剂量依赖性。 由此可见，黄连对防止乙醇引起的大鼠溃疡作用与黄连碱和氧化黄连碱c - 9 和 c 一1 0 位上的次甲二氧基有关。作用机制可能与其抑制抗h p 、胃酸的分泌、抑制 致炎因子的产生、提高胃粘膜屏障功能、及调节植物神经系统功能等有关。黄连 抗消化性溃疡作用涉及直接抑制胃酸分泌等多种机制，但与胃粘液分泌无明显关 系。tj 吴茱萸；研究表明吴茱萸及其生物碱对实验性消化性溃疡具有防治作用。张 明发哺1 发现吴茱萸水煎煮液对消炎痛加乙醇致小鼠胃溃疡、盐酸致大鼠胃溃疡、 小鼠应急性胃溃疡和大鼠胃幽门结扎性溃疡均有抑制作用。随后证实吴茱萸醇提 取物也具有明显的抗水浸应激性溃疡作用 ，作用机制可能跟其生物碱具有抑制 胃肠道蠕动作用有关。 2 5 左金丸药理药效研究进展 李臻旧1 在治疗由h p 感染所致的胃病时发现，左金丸具有明显抑制h p 和治疗 胃病作用。左金丸同时具有保护胃粘膜的作用，可以防治由辣椒煎液和无水乙醇 员阡l 中医学院硕十学位论义 所造成的大鼠胃粘膜损伤，机制可能跟其抑制炎症因子i l 一8 和t n f q 有关，但 与内源性防御p g e 的合成和释放无关田1 。刘晓伟等n 们采用改良束缚浸水方法，观 察左金丸对应激性胃溃疡模型大鼠的影响。结果发现，左金丸可降低应激性胃溃 疡溃疡的指数，提高胃液p h 值，降低血浆c o r t 与a c t h 含量。 3 科学意义及应用前景 科学意义萸连缓释片在前期的工作中已完成了体外成型工艺的研究。在模 拟人工胃液中缓释片的漂浮时间可以长达1 2 h 以上。本实验中通过家兔造模后的 定时给药，观察溃疡面的愈合率，考察了左金丸剂型改良后的体内药效。从科学 。 研究的角度分析，临床研究要以一定的动物体内药效学以及药代动力学研究参数 为前提，并且结合体外制备工艺以及体外漂浮性能的考察等，使临床研究更有说 服力。由此可以看出对萸连缓释片在动物体内释放行为的考察以及药效学的研究 已成必然。 应用前景胃溃疡的发病原因复杂，而且停药后极易复发，常常需要多种药 物长期联合治疗，再加上当今人们工作生活节奏的加快，常不能保证按时服药。 左金丸治疗胃溃疡效果显著，且目前临床对该方末见任何不良反应的报道，但是 左金丸具有每次服用量较大，服用次数多等缺点，左会丸缓释片( 萸连缓释片) 的研究能够在减少服药次数的前提下，保证平稳的血药浓度，避免峰谷现象，具 有良好的应用前景。 6 本课题属于萸连缓释片的研制的子项目。课题组前期已经完成了体外制 各工艺的研究，包括含量测定( 其中有紫外分光光度法测定吴茱萸次碱的含量， 双波长薄层锯齿扫描法测定盐酸小檗碱的含量) ，萸连缓释片制备工艺的研究， 以及体外释放度的测定。可以由下图中的技术路线所示，清晰看出。 2 本课题研究的主要内容设计 稳定性研究：分别通过常规实验法，经典恒温法两个方法进行稳定性实验。 体内研究：( 1 ) 萸连缓释片胃内漂浮时间的确定，间接通过测定不同时段家兔胃内 容物盐酸小檗碱的含量获得。 ( 2 ) 通过对萸连缓释片体内胃液酸度以及胃蛋白酶活性的测定，从而对 普通制剂组，西药组、缓释片组的药理活性进行对比研究。 ( 3 ) 通过三种家兔胃溃疡的模型，连续给药2 周，观察溃疡面的愈合率， 比较各实验组的疗效。 可以由下图中的技术路线所示，清晰看出。 7 皿避! g 掣嚣删 k 匡留鄙皿嘲 甾赵g 嚣删 际匡留酃皿爆 裂球掣赠燃 粑寰泳甜燃 。旧憾鲻蚓嚣畔崾匣n糯躲矧糯掣医冥翊止婪懋蜊粼，囊截辎，霸皿州求 辎蜊 碌害扑狡柢 。悄嚣魁甾姑稍塑烬嚣皿趟皿警嘏搽鼷文g 求曙轻匿重墨一苔焉hoh 甘 nh眨辎蒹求 。删嚣魁甾妲蝴疑皿甾斌搽藤文熹求曙罪窿重基譬焉h o一 o 甘 nh眨辎蒹求 碌匿扑剐糯 。删妞g餐涨f程耀 披爵s 谗丑皿 群嘏搽碌衩鼎求螺罂匿 重量害g罱h o【 o 寸 nh匪鳝蒹求 磔帮g 亘苔 鼬挺长皿嘏搽 碌枣翟撼 s营赠删罚转黑佃靶 篷枯披燕靼nlc兰皇 嗥毯瞎 。巡蛏s糯g匣佟卜赵赠谁丑*怛裂。咖舡馊爵 婪甾莒披七b稚赠亘l、g 越赠匣佟忡暖咯婪婆 。鞋警叹。，h * 暴求厘林叹午。咂辎哥咚谗匠阳坷 孚!|篮po寸 禽林蝴嚣 妖謇塑馊嚣 妖器武蛞 碌罄扑狡柢，剐榴翟母哒武撼惫箍止涎蟋划粼 螂蛰长辎戳州 议袋逍扑+匿谜扑匦廿医辎 贵舟1 中医学院硕十学位论文 第二部份实验研究 第一章课题组前期开展相关工作的要点回顾以及本次部分体 外试验改进内容 本课题组前期研究工作的主要内容有 建立了双波长薄层锯齿扫描法测定盐酸小檗碱的含量，紫外分光光度法测定 吴茱萸次碱的含量。 对药材的提取，浓缩，精制，成型工艺的优选。 基于前期所开展的工作与本次实验时间上有一定距离，因此在本次试验开展前需 对前期工作不完善地方再做调整。 o 实验改进内容 盐酸小檗碱含量检测手段的改变 由于薄层扫描法属于定性和半定量的方法，用于盐酸小檗碱含量测定并没有 比运用高效液相色谱法的分辨率高，精确。因此，本实验在根据前人优选出的提 取工艺参数进行提取，浓缩，精制的前提下，新建立了运用高效液相色谱测定盐 酸小檗碱含量的方法。 萸连缓释片片型大小的改变 前期已开展的研究工作中，成型工艺优选出的片荆大小不能够在接下来的动 物体内试验中顺利进行。考虑到，萸连缓释片属于骨架型缓释制剂，在主药和辅 料比例不变的情况下改变冲模，相应缩小片剂大小以及片粉重，对缓释片本身的 释药性能，漂浮时f b j 影响不大。因此，本实验改压妻径为5 m m 的小片，并且重新 。 对其释放度进行测定。 第二章萸连缓释片体外制备工艺的改进 1h p l c 法检测萸连缓释片提取液中盐酸小檗碱的含量 萸连缓释片由左会丸改剂型而来，通过对黄连，吴茱萸的提取以及成型工艺 的优选，制备出具有胃内漂浮缓释作用的骨架型缓释制剂。本实验采用h p i 。c 法 对萸连缓释片提取液中盐酸小檗碱含量进行了含量测定。 1 1 仪器与试药 1 1 1 仪器岛津l c 一2 0 a 型液相色谱仪；d z f - 6 2 1 0 真空干燥箱；上海齐欣科学 9 仪器有限公司；手动进样；h t 一2 0 型柱温箱；r e 5 2 - 0 5 旋转蒸发仪；上海亚荣生 化仪器厂。 1 1 2 试药盐酸小檗碱对照品购自中国药品生物制品检验所( 含量测定用，批 号：0 7 1 3 9 9 0 6 ) ；左金丸处方中药材均购自贵阳市同济堂药店( 根据2 0 0 5 版中 国药典一部各药材项下要求进行检测，均为正品) ；乙腈为色谱纯( 产地：天 津市科密欧化学试剂有限公司，批号：2 0 0 7 0 4 1 6 ) ；磷酸二氢钾为分析纯。 1 2 方法与结果 1 2 1 色谱条件色谱柱：迪马k r o m a s i lc 。( 5 um ，2 _ 5 0m m 4 6m m ) ；流动相： ： 乙腈：0 0 3 m o l l 1 磷酸二氢钾= 2 8 ：7 2 ；检测波长：2 6 5 n m ；流速：1 o m l m i n ； 柱温：3 0 ；进样量：1 0l zl 。 l2 2 对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液的制各及色谱图 1 2 2 1 对照品溶液制各精密称取盐酸小檗碱对照品1 4 8 m g ，置2 5 m l 容量瓶 中，加入盐酸：甲醇( 1 ：1 0 0 ) 溶液至刻度，超声3 0 m i n ，定容。精密量取上述对 照品溶液l m l ，置5 0 m l 容量瓶中，加盐酸：甲醇( 1 ：1 0 0 ) 溶液至刻度，配成每 l m l 含1 1 8 4ug 的溶液，摇匀，即得。按2 1 项下色谱条件进样，色谱图见图1 。 u uz oc 1 3，ou u1 二c 口1 0 u1 i om 汀l 4 - 图1盐酸小檗贼对照品色谱图 1 2 2 2 供试品溶液制备按处方量分别称取左金丸各单味药，其中黄连药粉加 入9 倍量的水，浸泡0 5 小时，回流提取两次，每次3 小时。合并煎液，适当浓 缩后真空干燥。另取吴茱萸原药材加入1 6 倍量7 0 乙醇浸泡3 小时，回流提取3 次，每次3 小时，合并煎液。回收乙醇后真空干燥。按黄连：吴茱萸= 6 ：l 的比例 混合浸膏粉( 分别过1 0 0 目筛) ，加入辅料压成片剂。取已压好的片剂4 片，碾 碎，置2 5 0 m l 容量瓶中，加入盐酸：甲醇( 1 ：1 0 0 ) 溶液，超声3 0 m in 溶解，定容 至刻度。精密量取l m l 溶液置2 5 m l 容量瓶中，加入盐酸：甲醇( 1 ：1 0 0 ) 溶液至 刻度，摇匀，放置过夜，即得样品溶液。进样前用0 4 5 | lm 微孔滤膜滤过。按 l o 贵阳中医学院硕十学位论文 2 1 项下色谱条件进样，色谱图见图2 。 图2 样品色谱图 1 2 2 3 阴性样品溶液制备除不含黄连外，其余按咎方比例和制备方法制得不 含黄连的水煎液，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。按1 2 1 项下色 谱条件进样，色谱图见图3 。 图3阴性样品色谱图 1 2 3 线性范围的考察取同一浓度的盐酸小檗碱对照品溶液( “8 4ug m l 叫) ， 分别精密以2 5 ，5 0 ，7 5 ，1 0 0 ，1 2 5ul 进样，按上述色谱条件测定峰面积 值，以峰面积( y ) 为纵坐标，进样量( x ) 为横啦标进行线性回归，得回归方程为： y = 5 8 9 7 2 x + 1 0 5 7 3 ( r = o 9 9 9 9 5 ，n = 5 ) 4 。表明豁酸小檗碱在进样量2 9 6 2 5pg m l 。1 1 4 8 1 2 5 ug m l l 范围内与峰面积呈良好的线性关系。结果见表1 ，图4 。 贵| 钉中医学院硕l 学位论文 o o6i o1 5 浓度u g m l 图4 盐酸小檗碱对照品的标准曲线图 1 2 4 精密度试验精密吸取上述对照品溶液1 0 ul ，重复进样6 次，测赫酸小 檗碱峰面积，结果见表2 。 表2 盐酸小檗碱精密度测定结果( n = 6 ) 编号盐酸小檗碱峰面积平均值r s d 值 5 7 5 8 8 8 5 7 8 7 5 0 5 8 4 0 0 0 5 8 8 3 2 6 6 0 1 1 5 2 5 8 0 0 l l 5 8 4 6 8 7 8 3 31 5 7 1 2 5 重复性试验取同一水煎液，同法制备6 份供试品溶液，分别测得峰面积 并计算盐酸小檗碱含量，结果测得r s d 值为1 2 。结果见表3 。 1 2 裟凇嬲凇 86昂4 3 2 i 取峰 1 2 3 4 5 6 1 2 6 稳定性试验取同二份供试品溶液，分别于0 、2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 h 进样。 测定峰面积值，计算r s d 值为1 9 6 。表明样品含量在1 2 小时内稳定。结果见 表4 。 表4 盐酸小檗碱稳定性测定结果 1 2 7 回收率试验取混合粉术，精密称定9 份，分为3 组，每组3 份，按照高 中低3 个浓度的要求，分别精密加入不同体积的盐酸小檗碱标准品溶液，按供试 品溶液的制备方法制备9 份3 个浓度样品溶液，按照1 2 1 项下色谱条件测定峰 面积，结果见表5 。 贵阳中医学院硕卜学位论文 1 2 8 样品测定按供试品溶液制备方法，制备5 个不同批次的萸连缓释片取液 的供试品溶液，按l - 2 1 所述的色谱条件测试，记录峰面积，测得盐酸小檗碱含 量见表6 。 表6 样品含鲑测定结果 批号峰面积a盐酸小檗碱含耸( ug m l ) 0 8 0 1 0 l 3 4 3 7 3 66 7 8 0 8 0 1 0 23 5 3 9 3 66 9 8 0 8 0 1 0 33 5 0 4 8 96 9 l 0 8 0 1 0 43 5 9 6 9 2 7 0 9 0 8 0 1 0 5 3 4 9 5 8 66 8 l 1 3 讨论 1 3 1 工艺路线的确定1 有研究黄连，吴茱萸合提会造成有效成分的损失，所 以采取分别单独提取制备干浸膏的工艺路线。黄连中喹啉生物碱在热水中有很好 的溶解性，故以水为溶酶回流提取黄连中的有效成分；吴茱萸则用7 0 乙醇为溶 酶叫流提取其有效成分。该工艺路线简单，却又能尽可能地保留了有效成分，适 合工业化大生产。 1 3 2 流动相种类的选择本实验曾用甲醇：水，乙腈：水，乙腈：磷酸二氢钾为流 1 4 贵阳中医学院硕十学位论文 动相进行检测，结果显示流动相为乙腈- 磷酸二氢钾的峰型以及分离度较好。原 因可能足黄连，吴茱萸中成分多属于生物碱类，在样品处理时由于盐酸的加入而 转换为盐，磷酸二氢钾属于缓冲类，根据相似相溶原则，峰的分离度较好。 1 3 3 流动相比例的选择本实验曾按照流动相比例为4 0 ：6 0 ，3 2 ：6 8 ，3 0 ：7 0 ， 2 5 ：7 5 ，2 8 ：7 2 进行检测。结果相比较后得出2 8 ：7 2 的流动相峰型较好，出峰时 问以及拖尾因子均达到最佳标准。 1 3 4 检测指标的确定左金丸的药对是以黄连：吴茱萸= 6 ：l 的比例而来，其中 小檗碱，喹喏酮化合物i v h ，i v d 分别是黄连，吴茱萸中能起到治疗作用的药效 - 成分之二。黄连在左金丸方剂中属于君药，发挥着主药治疗作用。黄连中的小檗 碱在整个药对比例中以及在单味药的成分中，含量均占较高，并且也是主要药效 成分。相反吴茱萸中的药效成分则占总含量较少。经过试验证实盐酸小檗碱的测 定较简便且出峰时间，峰型都较好。 2 萸连缓释片累积释放百分率测定 ? 2 1 萸连缓释片的制备 根据课题组前期已经优选出的制备萸连缓释片所用辅料的比例，按照表7 所 示，自制直径为5 m m 的萸连缓释片( 每片约含黄连生药量为0 0 3 5 9 ，吴茱萸生药 量为0 0 0 5 9 ) ，以供后期实验所用。 表7 萸连缓释片方中各辅料与主药的川造比例 2 2 体外释放度的测定 按照中国药典2 0 0 5 年版二部附录，用桨法测定片剂的体外释放度。将 缓释片放入溶出杯中，转速为l o o t m i n ，溶出介质为9 0 0 m l ，3 7 0 5 的( 9 一1 0 0 0 m l ) 盐酸溶液，每隔一定时问取样l m l ，按照1 2 1 项下的色谱条件，将 样品直接过微孔滤膜测定含量。结果见表8 。 贵阳中医学院硕仁学位论文 表8 五批萸连缓释片累积释放度考察结果( ) 2 0 0 9 0 9 1 1 2 0 0 9 0 91 2 2 0 0 9 0 9 1 3 2 0 0 9 0 91 4 2 0 0 9 0 9 1 5 平均值 1 3 6 2 1 3 1 3 1 2 8 0 1 4 2 0 2 8 4 6 1 6 4 4 2 7 5 8 2 7 2 2 2 6 4 0 2 9 9 2 2 9 6 8 2 8 1 6 3 1 3 2 3 1 2 6 3 0 3 6 3 3 2 4 3 1 6 0 3 1 5 6 3 5 0 0 3 7 2 4 3 7 4 4 3 8 2 4 3 7 8 4 3 7 1 5 4 2 5 6 4 2 3 0 4 2 6 8 4 2 1 4 4 3 3 2 4 2 6 0 4 5 6 0 4 4 3 6 4 5 9 2 4 5 9 6 4 4 3 6 4 5 2 4 4 8 0 4 4 8 0 8 4 8 3 6 4 7 5 2 4 8 0 4 4 8 0 l 2 0 0 9 0 9 l l 2 0 0 9 0 91 2 2 0 0 9 0 9 1 3 2 0 0 9 0 91 4 2 0 0 9 0 9 1 5 平均值 2 6 2 0 2 5 2 5 2 4 6 2 2 7 3 1 2 8 4 6 2 6 3 7 5 3 0 4 5 2 3 5 5 0 7 7 5 7 5 4 5 7 0 8 5 4 1 6 6 0 2 3 6 0 1 2 5 8 3 8 6 3 9 2 6 0 7 7 6 0 6 9 6 7 3 l 7 1 6 2 7 2 0 0 7 3 5 4 7 2 7 7 7 6 2 3 8 1 8 5 8 1 3 5 8 2 0 8 8 1 0 4 8 3 3 l 8 1 9 3 8 7 6 9 8 5 3 l 8 8 3 l 8 5 3 l 8 8 3 8 8 7 0 0 9 2 3 8 9 2 4 6 9 3 0 0 9 1 3 8 9 2 3 8 9 2 3 2 药物释放拟合方程将上述五批萸连缓释片的累积释放百分率对时间( m 。m 。k 。、 m 。为完全释放时药量，m 。为t 时刻累积释放量) 进行零级、一级和h i g u c h i 三种 不同释药模型的拟合，通过比较模型的相关系数( r ) 和离差平方和，来确定制 剂的释药行为。拟合结果见表9 和释放曲线见图5 。 1 6 贵阳中医学院硕士学位论文 表9 释药方程拟合结果 批号 模型类别方程式 相关系数离差平方和 0 9 0 9 1 1 0 9 0 9 1 2 0 9 0 9 1 3 0 9 0 9 1 4 0 9 0 9 1 5 零级m m 。= 5 3 4 t + 3 4 1 8 一级 h i g u c h i 零级 一级 h i g u c h i 零级 一级 h i g u c h i 零级 一级 h i g u c h i 零级 一级 h i g u c h i l n ( 1 一m ；m 。) = o 1 9 t 一0 1 7 m 。m 。= 2 4 7 6 t 2 + 9 2 5 m 。m 。= 5 3 i t + 3 4 2 8 l n ( 1 - - m 。m 。) = - 0 1 9 t 一0 1 9 m m 。= 2 4 8 2 t h 2 + 9 0 8 m 。m 。= 5 6 1 t + 3 2 5 8 l n ( 1 m 。m 。) = - 0 2 0 t 一0 1 3 m 。m 。= 2 6 1 0 t 1 庸+ 6 1 8 m 。m 。= 4 8 4 t + 3 8 8 3 l n ( 1 一m ，m 。) = 一0 1 7 t - o 3 1 m 。m 。= 2 2 8 2 t 1 胆+ 1 5 3 9 m 。m 。= 5 0 9 t + 3 7 7 6 l n ( 1 m m 。) = - 0 1 9 t - o 2 4 m i m 。= 2 3 7 6 t 们+ 1 3 6 5 0 9 4 8 7 0 9 8 9 9 0 9 7 4 7 0 9 4 3 4 0 9 8 7 9 0 9 6 2 0 0 9 4 8 7 0 9 9 3 5 0 9 7 9 8 0 9 1 6 5 0 9 8 4 9 0 9 5 3 9 0 9 3 2 7 0 9 8 9 9 0 9 6 6 4 3 2 6 6 0 8 0 0 9 8 8 1 6 0 4 8 l 3 6 8 3 7 3 0 0 8 6 9 1 6 2 8 1 9 3 4 6 2 8 4 0 0 5 7 4 1 3 8 7 5 7 4 6 0 6 2 0 0 0 8 8 2 2 4 5 5 5 2 3 8 2 7 5 4 0 0 7 4 5 1 9 6 8 4 7 图5 五批缓释片释药过程曲线图 从以上结果可以看出，五批缓释片拟合方程的相关系数( r ) 均以一级方程 1 _ 2 + ， 贵阳中医学院硕 学位论文 的最大，其次是h i g u c h i 方程，最小的是零级方程：离差平方和均以一级方程的 最小，其次是h i g u c h i 方程，最大的是零级方程。因此萸连缓释片的释放行为为 一级释放。 2 3 讨论 2 3 1 本试验中，曾对五批萸连缓释片进行了溶散时限的测定，结果表明，五批 缓释片都可以在2 m i n 之内起漂并且持续漂浮时问能维持在1 2 h 以上，释放率在 1 2 h 后均可达到9 0 以上。 2 3 2 在试验过程中发现，当释放到l o h 以后，小部分缓释片丌始下沉到溶出杯 中部旋转。分析原因可能是在压片时，由于手动压片的原因，导致压力时有变化， 缓释片本身结构的松紧度产生差异。 3 本章小结 经过对萸连缓释片体外制备工艺当中漂浮性能，以及体外累积释放百分率的 简单重复，基本可以得出结论该缓释片成型工艺稳定、可行，能够持续漂浮1 2 h ， 累积释放百分率1 2 h 后可达9 0 以上。 第三章萸连缓释片稳定性研究 1 仪器与试药 1 1 仪器n 本岛津l c 一2 0 a 型液相色谱仪，s p d 一2 0 a 型紫外一可见检测器( r 本 岛津) ，h t - 2 0 型柱温箱；a u y 2 2 0 型电子天平( 同本岛津) ；l r h 一1 5 0 s 恒温恒湿 培养箱；r c - 8 d 智能式溶出仪；d z 一2 8 c 型真空干燥箱；j z x d t l 3 0 0 一b s i i 电热恒 温干燥箱；。h h - 4 数显恒温水浴锅。 1 2 试药萸连缓释片( 自制，批号：2 0 0 8 0 9 2 t 、2 0 0 9 0 9 2 4 、2 0 0 9 0 9 2 5 ) ；甲醇为 色谱纯( 产地：天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：2 0 0 8 0 4 2 0 ) ；赫酸为分 析纯( 产地：遵义师范学院化学试剂厂，批号：2 0 0 7 11 0 1 ) ；盐酸小檗碱对照品 购自中国药品生物制品检验所( 含量测定用，批号：0 7 1 3 9 9 0 6 ) ；乙腈为色谱纯 ( 产地：天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：2 0 0 7 0 4 1 6 ) ；磷酸二氢钟为分 析纯( 产地：天津市科密欧化学试剂有限公司，批弓：2 0 0 7 0 5 1 0 ) 2 考察项目性状、起漂时间、装量差异、漂浮时问、盐酸小檗碱的百分含量。 其中，盐酸小檗碱的百分含量作为重点考察项目。 贵阳中医学院硕二 学位论文 3 加速试验法 3 1 常规实验法在温度4 0 2 、相对湿度7 5 5 的条件下放置6 个月。 所用设备应能控制温度2 ，相对湿度5 ，并能对真实温度与湿度进行监测。 试验期间分别在第1 个月、2 个月、3 个月、6 个月术取样一次。 3 1 1 具体试验方法将一定数量的3 批样品放在盛有饱和氯化钠