（临床医学专业论文）rhbmp2及不同载体在种植体周围骨缺损修复中的应用研究.pdf

博士学位论文 r h b m p 2 及不同载体在种植体周围骨缺损修 复中的应用研究 博士研究生：黄元瑾 指导教师：蔡德鸿教授 章锦才教授 摘要 近年来，用修复设计主导的种植体植入成为大家普遍接受的种植修复方针。 而种植体理想的植入方向和部位受到余留骨组织的部位、骨量、骨密度等的影 响。牙齿缺失、系统性骨疾病、营养不良或长期戴用可摘义齿等造成的牙槽嵴 和骨组织异常等常导致种植体植入困难甚至无法植入。因此，要将种植体植入 理想位置，常常需要进行牙槽嵴骨增量手术。为了获得更好的植骨效果，研究 者们尝试将各种细胞因子应用于植骨手术中，其中重组人骨形成蛋白2 ( r h b m p 2 ) 是目前研究得较多的一种细胞因子。 骨形成蛋i 兰i ( b m p ) 是转化生长因子1 3 ( t g f 1 3 ) 超家族中的一组多功能细胞因 子，是已知效应最强的骨生长因子，具有诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，最 终促使软骨、骨形成的作用。其中作用最显著的是b m p 2 、b m p - 4 、b m p 7 。但 单纯的b m p 在体内扩散太快，也易被蛋白酶分解，因而不能在有效的时间内作 用于更多的靶细胞，其诱导活性难以得到充分的发挥。而将b m p 与载体复合， 可减缓其水解速度，持续诱导成骨。不同的材料都曾被用来作为r h b m p 2 的载体， 包括胶原、明胶、脱矿骨基质、透明质酸、聚乳酸、羟基磷灰石、磷酸钙、羟 基磷灰石胶原复合体等等。据文献报导，多种载体材料与r h b m p 2 复合后，具 有不同程度的促进骨再生的作用。然而，目前尚缺乏对不同的载体材料对 r h b m p 2 骨诱导作用影响的对比研究，众多载体材料中，究竟哪种材料是作为 r h b m p 2 载体的最佳材料，目前尚无较肯定的研究结果。 植体肩部与缺损顶端平齐。将0 0 5 m g m l 和0 2 m g m l 两种浓度的r h b m p 2 分别与 可吸收胶原海绵( a b s o r b a b l ec o l l a g e ns p o n g e ，a c s ) 和珊瑚羟基磷灰石人造骨 ( c o r a l i n eh y d r o x y a p a t i t e ，c h a ) 两种载体材料浸润3 0 分钟后，冷冻干燥，进行复 合。种植体颊侧裂开性骨缺损部位按分组情况分别置入复合了不同浓度r h b m p 2 的羟基磷灰石人造骨或可吸收胶原海绵。上愈合帽。复位粘骨膜瓣，间断严密 缝合。8 只实验犬共植入6 4 枚种植体，每组1 6 枚。每组的种植体周围骨缺损部位 的处理方法分为以下6 种：珊瑚羟基磷灰石人造骨+ 0 0 5 m g m lr h b m p 2 ( 0 0 5 r h b m p c h a ) ；珊瑚羟基磷灰石人造骨+ 0 2m g m lr h b m p 2 ( 0 2 r h b m p c h a ) ；可吸收胶原海绵+ 0 0 5m g m lr h b m p 2 ( 0 0 5 r h b m p a c s ) ；可吸收胶原海绵+ 0 2m g m lr h b m p 2 ( 0 2 r h b m p a c s ) ： n 博士学位论文 珊瑚羟基磷灰石人造骨( c h a 空白) ；可吸收胶原海绵( a c s 空白) 。 于动物处死前第1 0 天和第3 天皮下注射盐酸四环素3 0 m g k g ，进行四环素荧 光标记。分别于种植体植入术后2 ( a 组) 、4 ( b 组) 、8 ( c 组) 、1 2 ( d 组) 周，各处死2 只实验犬，分离下颌骨，获取含种植体骨标本，经梯度乙醇脱水， 氯仿透明和甲基丙烯酸树脂包埋。采用硬组织切片机切片和手工磨片的方法， 制作成厚度为4 0 - - 、，5 0 p x r n 厚的不脱钙的含种植体的硬组织磨片。磨片先荧光显微 镜观察后，再经亚甲基蓝酸性品红染色后作组织学观察和骨组织形态计量学测 量。骨组织形态计量学测量分析测量的主要指标有：( 1 ) 缺损区高度( d e f e c t h e i g h t ， d h ) ；( 2 ) 缺损区骨高度( b o n eh e i g h t ，b h ) ；( 3 ) 缺损区骨面积( b o n ea r e a ，b a ) ； ( 4 ) 缺损区骨种植体结合率( b o n ei m p l a n tc o n t a c t ，b i c ) 。采用s p s s 软件包处理数 据，进行两因素析因设计的方差分析。 结果 1 大体观察 各组动物均无死亡，饮食、活动正常，3 号犬有两枚种植体颈部暴露，种 植体松动，该犬于4 周被处死，松动的两枚种植体分别植入的是可吸收胶原海绵 + o 0 5m g m lr h b m p 一2 及可吸收胶原海绵空白。该两枚种植体未被纳入其后的研 究。其余创口均愈合良好，种植体未见松动。 2 组织学观察 2 周时 a c s 空白组和c h a 空白组的骨缺损区几乎未见新骨形成：其余4 个r h b m p 2 组中可见极少量的淡红色新生骨组织散布在胶原和人造骨颗粒间。位置接近根 方的牙槽骨。种植体表面未见有骨组织附着。 4 周时 r h b m p 2 a c s 组：在骨缺损区可见疏松的编织状新骨，由根方牙槽骨顶端 呈芽状向缺损区中心方向生长，部分区域可见未成熟的片状编织骨。部分骨组 织与种植体表面形成接触。 i l l 中文摘要 r h b m p 2 c h a 组：珊瑚羟基磷灰石人造骨颗粒内部和周围出现呈岛状生长 的新生骨组织，以与牙槽骨骨端接触处最为明显，显示大部分珊瑚羟基磷灰石 人造骨表面有较薄的新成骨，钙化良好，有些颗粒表面可以看到有表面形态不 规则，似有吸收样陷窝，颗粒内孔隙形态大小较均匀。可见新生骨组织与种植 体表面接触。 a c s 空白和c h a 空白对照组：新生骨组织量明显较少，骨小梁相对细小， 散乱，小梁间有较多纤维组织，骨小梁成熟度较低。种植体表面未见有骨组织 接触。 8 n 时 r h b m p 2 a c s 组：新骨量增多，骨小梁也逐渐增宽，新生骨形成大片状 结构，由下至上逐渐充填骨缺损区。新生骨组织成熟度较高。底部的编织状骨 向层板骨过渡，新骨与种植体形成良好的骨性结合。 r h b m p 2 c h a 组：缺损区珊瑚羟基磷灰石人造骨颗粒周围较多骨岛形成， 新骨量增多，骨组织成熟度较高。缺损区内新骨高度增加，颗粒表面可以看到 较明显的吸收样陷窝。与种植体表面接触的骨组织量明显增加。 a c s 空白和c h a 空白对照组：骨组织的形成量较少，集中在缺损区底部， 仅有少量新生骨与种植体表面接触。 1 2 周时 r h b m p 2 a c s 组：缺损区内骨量和骨高度进一步增加，底部的编织状骨向 层板骨过渡，新骨与旧骨之间分界模糊，新骨与种植体形成良好的骨性结合。 r h b m p 2 c h a 组：缺损区内骨量和骨高度进一步增加，珊瑚羟基磷灰石人造 骨颗粒与骨组织融合，形成成熟的骨小梁，骨质钙化程度高，骨陷窝数目相对较 少，骨陷窝周围已形成明显板层结构。 a c s 空白和c h a 空白对照组：骨组织的形成量较少，集中在缺损区底部，仅 有少量新生骨与种植体表面接触。 3 荧光显微镜观察 i v 博士学位论文 c h a 组：2 周时各组未见明显的成骨活动。4 周时各实验组可见较明显的成 骨活动，缺损区内沿珊瑚羟基磷灰石人造骨颗粒周围存在四环素荧光条带，在8 周及1 2 周组中荧光面积明显增大，并与种植体形成较好的骨结合。c h a 空白对 照组成骨活动明显较弱，成骨速度较慢，团块状的珊瑚羟基磷灰石人造骨颗粒 周围四环素标记带明显较弱，仅有散在的荧光条带，荧光较杂乱，细窄。 a c s 组：2 周时各组未见明显的成骨活动。4 周时各实验组可见较明显的成骨 活动，缺损区内存在大小不一的成网状的四环素荧光带，在8 周及1 2 周组中有新 生的骨小梁生成，网状面积明显增大，并与种植体形成较好的骨结合。a c s 空白 对照组成骨活动明显较弱，成骨速度较慢，后期骨小梁纤细，成骨范围也相对 较小，荧光较杂乱，细窄。 r h b m p 2 c h a 和r h b m p 2 a c s 组中，近原有牙槽骨端( 缺损区底部) 区域的荧 光条带间隔比远端区较宽，说明近牙槽骨位置骨改建比远端区骨改建活跃，新 骨形成较多。从荧光示踪还发现骨组织从牙槽骨骨端表面开始向顶端生长，说 明白体骨具有较好的骨诱导作用。 4 骨组织形态计量学测量 各组种植体周围的骨缺损高度的变化幅度平均在3 8 5 m m 至4 1 0 m m 之间，各 组间的骨缺损高度差异无统计学意义。 随时间延长，各种方式处理的种植体周围骨缺损区内新生骨高度、骨面积和 骨种植体结合率均不断增加。4 周、8 周和1 2 周之间骨高度、骨面积和骨种植体 结合率差异有统计学意义( p 0 0 5 ) i nb o n eh e i g h ta m o n g g r o u p s 博士学位论文 a t2w e e k s ，t h ea m o u n to fn e w l yg e n e r a t e db o n ew a sm i n i m a la n dd i dn o td i f f e r s i g n i f i c a n t l ya m o n gt h er h b m p - 2a n dc o n t r o lg r o u p s h o w e v e r ，a t4w e e k st h e r h b m p 2 ( 0 0 5 r h b m p c h a ，0 2 r h b m p c h a ，0 0 5 r h b m p a c s ，0 2 r h b m p a c s ) t r e a t e dp e r i i m p l a n td e f e c t ss h o w e dm o r eb o n ef i l lc o m p a r e dt ot h ec h ac o n t r o la n d a c sc o n t r o lg r o u p ，a n dt h ed i f f e r e n c ei nb o n eh e i g h t ，b o n ea r e aa n db o n ei m p l a n t c o n t a c tw a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) a m o n gt h ef o u rr h b m p - 2g r o u p s c o n c l u s i o n s 1 i nt h i ss t u d y , 3 m m x 4 m md e h i s c e n c ep e r i i m p l a n td e f e c t sw e r ec r e a t e di nb e a g l e d o g s t 1 1 i sd e h i s c e n c ep e r i i m p l a n td e f e c tm o d e ls i m u l a t e dt h ec l i n i c a ls i t u a t i o n a n dc a nb eu s e dt oi n v e s t i g a t eb o n ef o r m a t i o ni np e r i i m p l a n td e f e c t 2 b o n er e g e n e r a t i o ni np e r i i m p l a n td e f e c t sw a se n h a n c e dw i t ht h ea p p l i c a t i o no f r h b m p 一2a n dg o o dc o n t a c tb e t w e e nn e w l yf o r m e db o n ea n di m p l a n ts u r f a c ew a s r e a c h e d 3 f h b m p - 2a tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 0 5 m g m li ss u f f i c i e n tt oe n h a n c eb o n e r e g e n e r a t i o na n do s s c o i n t e g r a t i o ni np 谢i m p l a n td e f e c t t l l el o w e rc o n c e n t r a t i o n o fr h b m p 一2h a sa d v a n t a g ei nm i n i m i z i n gt h es y s t e m i ce f f e c ta n dc o s tl e s s 4 b o t ha b s o r b a b l ec o l l a g e ns p o n g e ( a c s ) a n dc o r a l i n eh y d r o x y a p a t i t e ( c h a ) s h o w e dg o o da c t i v i t y 够t h ec a r r i e ro f r h b m p - 2 t h ee f f e c to fc h ao ns p a c e m a i n t e n a n c ei sb e t t e r v a b s t r a c t k e y w o r d sr h b m p - 2 ：t i t a n i u m ：i m p l a n t ；b o n er e g e n e r a t i o n ：o s s c o i n t c g r a t i o n 博士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i 前言一1 月i j吾 材料和方法5 结果2 6当c 1 木：0 讨论4 5 结论5l 参考文献。5 2 综述5 8 致谢7 7 学位论文原创性声明7 8 博士学位论文 1 l k 日| j舌 近年来，骨内种植体在口腔领域中的应用越来越广泛，不仅被用于单个牙 缺失、部分无牙颌和无牙颌的修复，还越来越多地应用于颜、颌面缺损后的功 能重建。用修复设计主导的种植体植入成为大家普遍接受的种植修复方针。而 种植体理想的植入方向和部位受到余留骨组织的部位、骨量、骨密度等的影响。 牙齿缺失、系统性骨疾病、营养不良或长期戴用可摘义齿等造成的牙槽嵴和骨 组织异常等常造成种植体植入困难甚至无法植入。因此，要将种植体植入理想 位置，常常需要进行牙槽嵴增量手术。目前多数学者认为，种植体周围骨缺损 大于l m m 者，应该进行植骨，以利于新骨生长和种植体的早期稳定。为了获得 更好的植骨效果，研究者们尝试将各种细胞因子应用于植骨手术中，取得了不 同程度的效果。自从1 9 6 5 年u r i s t 首先证实脱钙骨基质具有诱导成骨能力后，人 们对骨形成蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n ，b m p ) 家族进行了广泛的研究。 随着基因工程技术的发展，重组人类骨形成蛋白( r e c o m b i n a n th u m a nb o n e m o r p h o g e n e t i cp r o t e i n ，r h b m p ) 已被成功克隆出来，其中重组人骨形成蛋白一2 ( r h b m p 2 ) 是目前研究得较多的一种细胞因子。 一、r h b m p - 2 载体的选择和评价 骨形成蛋白是转化生长因子1 3 ( t g f 1 3 ) 超家族中的一组多功能细胞因子，是已 知效应最强的骨生长因子，具有诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，最终促使软 骨、骨形成的作用。其中作用最显著的是b m p 2 、b m p 一4 、b m p 7 。但单纯的 b m p 在体内扩散太快，也易被蛋白酶分解，因而不能在有效的时间内作用于更 多的靶细胞，其诱导活性难以得到充分的发挥。而将b m p 与载体复合，可减缓 其水解速度，持续诱导成骨。可作为b m p 载体的生物材料很多，它们对b m p 的 诱导成骨作用的影响有所差别。 理想的b m p 载体系统必须具备以下条件：能提供骨组织生长的空间，利 于血管和细胞的长入；生物相容性好，无免疫原性；可成型，适合各种不 前言 规则的创口；有一定的延展性和柔韧性；可消毒，消毒后不影响其特性； 有足够的抗压和抗拉强度；能降解并被吸收，其降解速度与骨形成速度保 持一致；促进b m p 的成骨活性并使其长期、缓慢地释放有效浓度：与b m p 和宿主骨有很好的亲和力。 不同的材料都曾被用来作为r h b m p 2 的载体，包括胶原、明胶、脱矿骨基质、 透明质酸、聚乳酸、羟基磷灰石、磷酸钙、羟基磷灰石胶原复合体等等。其中， 可吸收胶原海绵( a b s o r b a b l ec o l l a g e ns p o n g e ，a c s ) 是应用较多，研究时间较 长，作用较为肯定的r h b m p 2 载体材料之一。据文献报导，其他载体材料与 r h b m p 2 复合后，也具有不同程度的促进骨再生的作用。然而，目前尚缺乏对不 同的载体材料对r h b m p 2 骨诱导作用影响的对比研究，众多载体材料中，究竟哪 种材料是作为r h b m p 一2 载体的最佳材料，目前尚无较肯定的研究结果。 二、r h b m p 2 在种植治疗中的应用方式 目前，r h b m p 2 在种植中的应用方式主要有两种，一是通过将r h b m p 2 与载 体材料复合，再将r h b m p 2 载体复合体应用到种植体周围；二通过在种植体表 面涂层，形成活性表面，然后将r h b m p 2 复合到种植体表面的涂层材料上。有研 究认为此种方式可使r h b m p 2 结合到种植体表面结构的晶格旱，然后缓慢释放。 将r h b m p 2 复合到种植体表面时，种植体表面形态和化学性能都会影响种植体周 围的骨形成。t o r ui s h i b e 等将l p g m l 浓度的r h b m p 2 肝磷脂结合到磷灰石( 磷酸 钙) 涂层的种植体表面，植入鼠的胫骨。认为可以降低r h b m p 2 的浓度并获得足 够多的新生骨。h a l l 等分别将5 p g 、1 0 9 9 和2 0 9 9 的r h b m p 一2 复合到一种多孔的钛 氧化物表面处理的种植体和机械加工的钛种植体表面，植入鼠的皮下，结果显 示种植体表面性能和r h b m p 2 浓度都能影响种植体周围骨形成，作者认为钛氧化 物表面处理和较低浓度的r h b m p 2 具有更好的促进骨生长的效果。同时，有研究 认为复合到种植体表面的r h b m p 2 虽然能促进种植体周围的骨形成，却不利于骨 组织与种植体表面的整合，降低了种植体骨结合率。 另外，r h b m p 2 与载体材料的复合方式也分为物理吸附和化学共价结合两种 2 博士学位论文 不同的方式。对于这两种复合方式，目前也少有研究将其进行比较。 三、r h b m p - 2 的浓度选择 目前普遍认为，r h b m p 2 局部浓度的不同，可发挥不同的作用。然而，现有 的不同研究中，r h b m p - 2 的浓度相差很大，从0 1 p g m l 至1 4 m g m l 不等。而且对于 不同浓度r h b m p 2 对诱导成骨的影响，各研究结论也各不相同。s y k a r a s 等认为， 在低浓度r h b m p 2 的作用下，骨祖细胞可分化为破骨细胞，浓度较高时，则分化 为成骨细胞。他们在实验中发现，应用r h b m p 2 的种植体植入4 周、8 周后的脱出 力均小于未应用组，而1 2 周后前者大于后者。作者认为，种植体植入的初期阶段， 只有少量r h b m p 2 被释放，局部浓度较低，促进了破骨细胞分化，而后期r h b m p 2 释放量增加，刺激了新骨生成。j e p p s o n 等将2 4 “g m m 3 和o 1 2 i t g m m 3r h b m p 一2 可吸收胶原海绵复合体应用于兔的胫骨骨缺损中，结果显示r h b m p 2 组反而抑制 了骨形成，较可吸收胶原海绵对照组骨形成减少到1 6 和4 2 。作者分析， r h b m p 2 的抑制作用可能由于其非生理性的高浓度，抑制了细胞增殖甚至存在细 胞毒性。s c i a d i n i 等在文献中报道，高浓度的r h b m p 2 可在骨痂内形成囊肿样病 变。而有的研究中，r h b m p 2 的浓度变化未对其成骨效应产生明显的影响。 h a r v i n d e r 等研究犬的脊椎横突间骨融合时，采用t 5 8 l g 、l1 5 1 x g 、2 3 0 “g 、4 6 0 p g 和9 2 0 l g 的r h b m p 2 ，结果显示r h b m p 2 浓度与骨融合无明显关系。作者认为， 当r h b m p 2 达到一个最低的阈值浓度后，进一步增加浓度并不会进一步增加其骨 诱导作用，载体材料、手术技巧、受体部位的状况可能对其骨诱导作用影响更 大。t a t a k i s 等采用0 0 5 m g m l 、o 1 m g m l 和o 2 m g m l 的r h b m p 一2 研究犬的牙槽嵴冠 方5 m m 的垂直向缺损的修复，认为不同浓度对骨诱导和骨整合没有显著性影响。 因此，选择何种浓度的r h b m p 2 ，才能达到最佳的促进骨生成的作用，同时 又避免出现不良的反应，目前的研究结果尚无统一认识。 四、研究目的和意义 鉴于以上的问题和争议，本研究拟建立种植体周围骨缺损的动物模型，采 3 前言 用两种不同的载体材料和两种不同的r h b m p 2 浓度，来观察新骨形成及其与种植 体的结合情况，比较他们对种植体周围骨缺损区内的新骨形成以及新形成的骨 组织与种植体的结合情况的不同作用，为r h b m p 2 在临床的应用提供参考依据， 以进一步寻找最佳的修复种植体周围骨缺损的方法。 博士学位论文 材料和方法 一、主要实验设备和材料 1 实验设备 1 1 先锋钻、种植钻、不锈钢扳手及转移杆：四川大学卫生部口腔种植科技中心 提供。 1 2 种植机：a n t h o g y re x p e r tu n i ti m p l a n t o l o g y ，法国 1 3 双向磁力搅拌器：7 8 2 型，深圳 1 4 真空泵：r e f c or o y a l 2 型，瑞士 1 5 恒温水浴箱：g r a n to l s 2 0 0 ，英国 1 6 慢速技工打磨机：k a v o2 k q 型，德国 1 7 硬组织切片机及锯片：l e i c as p l 6 0 0 型，德国 1 8 不同直径的球钻、裂钻：上海医疗器械厂 1 9 超声清洗机：明珠电器c q 1 0 1 1 0 光学显微镜：o l y m p u sb x 4 1 ，日本 1 1 1 倒置荧光显微镜：o l y m p u si x 5 1 f l ，日本 1 1 2 荧光光源：o l y m p u su r f t t ，日本 2 材料 2 1c d i cs c t i i3 8 x 1 0 m m 柱状螺纹组合式种植体：四川大学卫生部口腔种植 科技中心 2 2 珊瑚羟基磷灰石人造骨( c o r a l i n eh y d r o x y a p a t i t e ，c h a ) ：北京意华健科贸有 限责任公司 5 0 0 r ( o 2 5 - - 一l m m ) ，孔隙率3 0 - - - 7 0 ；平均孔径：1 0 0 岬 - 6 0 0 1 x r n 容重：s 1 8 9 e r a 3 ；抗压强度：之1 5 m p a ；羟基磷灰石含量：芝9 0 ；p h 值范围： 6 5 - 7 5 。 2 3 医用胶原蛋白海绵( a b s o r b a b l ec o l l a g e ns p o n g e ，a c s ) ：上海其胜生物制剂有限 5 材料和方法 公司 由牛跟腱提炼而成，其成分为i 型胶原。孔径大d 、为3 0 0 - - - 5 0 0 p m ，孔隙率在 8 0 左右。 2 4 重组人骨形成蛋白2 ( r h b m p 2 ) ：美国r & ds y s t e m s ，i n c 纯度大于9 5 。 2 5 盐酸四环素荧光标记剂：( s i g m a ) 。 3 实验药物 无水乙醇、丙酮广州化学试剂厂 2 普鲁卡因肾上腺素注射液上海禾丰制药有限公司 3 戊巴比妥钠广东佛山化工实验厂 青霉素钠注射液浙江瑞新药业股份有限公司 0 9 氯化钠注射液四川科伦药业股份有限公司 4 标本处理试剂 甲醛 无水乙醇 9 5 酒精 7 5 酒精 三氯甲烷 甲基丙烯酸甲酯 氢氧化钠 无水氯化钙 无水过氧化苯甲酰 邻苯二甲酸二丁酯 石蜡油 二甲苯 5 染色试剂 广州化学试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 广东徐闻三和发展有限公司 广东徐闻三和发展有限公司 广东西陇化工厂 国药集团化学试剂有限公司 广州南方化玻公司 广州南方化玻公司 国药集团化学试剂有限公司 上海凌峰化学试剂有限公司 南昌白云药业有限公司 天津市富宇精细化工有限公司 6 博士学位论文 亚甲基蓝 酸性品红 高锰酸钾 苦味酸 冰醋酸 甘油 m 匝c h e m 正c h e m 天津市化学试剂三厂 天津市染料化学第二厂 国药集团化学试剂有限公司 北京鼎国牛物技术有限责任公司 二、动物模型的建立 1 实验动物 选用健康雄性b e a g l e 犬( 中山大学实验动物中心提供，所有实验动物符合国 际实验动物要求) 8 只，体质量1 2 1 4k g ，年龄为1 2 个月。所有b e a g l e 犬均采用笼 中独立圈养的方法，定时、定量摄食，自由饮水。适应性饲养l 周后，进行实验。 2 实验分组 分为a 、b 、c 、d4 组，每组两只犬，每只犬双侧下颌骨各植入4 枚种植 体，共6 4 枚种植体。每组1 6 枚种植体。 每组的种植体周围骨缺损部位的处理方法分为以下6 种： 珊瑚羟基磷灰石人造骨+ o 0 5 m g m lr h b m p 2 ( o 0 5 r h b m p c h a ) 珊瑚羟基磷灰石人造骨+ o 2m g m lr h b m p 2 ( 0 2 r h b m p c h a ) 可吸收胶原海绵+ o 0 5m g m lr h b m p 2 ( o 0 5 r h b m p a c s ) 可吸收胶原海绵+ 0 2m g m lr h b m p 一2 ( o 2 r h b m p a c s ) 珊瑚羟基磷灰石人造骨( c h a 空白) 可吸收胶原海绵( a c s 空白) 每组种植体周围骨缺损的处理方式分布如图1 所示。每组有 0 0 5 r h b m p c h a3 枚，o 2 r h b m p c h a3 枚，0 0 5 r h b m p a c s3 枚，0 2 r h b a c s 3 枚，c h a 空白2 枚，a c s 空白2 枚。 7 材料和方法 犬1 图l 每组中种植体周同骨缺损处理方法分布 f i g 1d i s t r i b u t i o no fi m p l a n t st r e a t e db yd i f f e r e n tm e t h o d s 3 r h b m p 2 与载体的复合 于手术前一天将r h b m p 2 与载体复合。 3 1r h b 一2 溶液的配置 取r h b m p 2 ，用4 m o l l 的h c l 溶液溶解，分别配置成浓度为0 0 5 m g m l 和0 2 m g m l 的r h b m p 2 溶液。 3 2r h b 2 与珊瑚羟基磷灰石人造骨的复合 用定量取液器取配置好的一定浓度i 拘r h b m p 一2 溶液，按每0 1 9c h ao 0 5 m l r h b m p 2 溶液的比例，将人造骨在r h b m p 2 溶液中浸润3 0 分钟，然后置于冷冻干 燥箱中真空冻干，4 保存。 3 3r 1 1 b 2 与胶原蛋白海绵的复合 将胶原蛋白海绵制成4 0m m 5 0m m 2 0m m 大小，用定量取液器取配置好 的一定浓度的r h b m p 2 溶液0 0 5 m l ，浸润胶原蛋白海绵，3 0 分钟后，置于冷冻干 燥箱中真空冻干，4 c 保存。 4 动物手术 4 1 牙齿拔除 博士学位论文 实验犬以3 0 9 l ( 3 ) 戊巴比妥钠按1 m l k g 肌肉注射行全身麻醉后，微创拔 除双侧下颌第l 、2 、3 、4 前磨牙和第l 磨牙，间断缝合创口。术后1 - 一3 天给予肌 肉注射青霉素( 8 0 万单位d ) 预防感染。 4 2 种植手术 4 2 1 拔牙后3 个月，拔牙创完全愈合后，行种植手术。 4 2 2 实验犬以3 0 9 l ( 3 ) 戊巴比妥钠按l m l k g 肌肉注射行全身麻醉后，置于 手术台上，侧卧位。常规碘伏消毒，铺孔巾，调整术区灯光。术区以2 普鲁卡因肾上腺素( 1 ：1 0 0 ，o o o ) 浸润麻醉。( 图2 ) a 麻醉前b 麻醉后 ab e f o r ea n a e s t h e t i z a t i o nba f t e ra n a e s t h e t i z a t i o n 图2 实验动物的麻醉 f i g 2 a n a e s t h e t i z a t i o no fa n i m a l s a 拔牙后3 个月 a3m o n t h sa f t e rt e e t he x t r a c t i o n 9 材料和方法 b 铺孔巾 b d r a p i n g d 确定种植体植入位置 d m a r k i n gt h ep o s i t i o nf o ri m p l a n tp l a c e m e n t c 翻开粘骨膜瓣 cr e f l e c t i o no fm u c o - p e r i o s t e a lf l a p e 种植体 ei m p l a n t s f 种植体周同骨缺损 fp c r i - i m p l a n td e f e c t s g 植入人造骨粉 gp l a c e m e n to fc o r a l i n eh y d r o x y a p a t i t e 1 0 博士学位论文 h 植入可吸收胶原海绵 hp l a c e m e n to fa b s o r b a b l ec o l l a g e ns p o n g e i 间断缝合 iw o u n dc l o s u r ew i t hi n t e r r u p t e ds u t u r e s 图3 种植手术( a i ) f i g 3i m p l a n ts u r g e r y ( a - i ) 4 2 3 种植体周围骨缺损区的形成 作牙槽嵴顶近远中向正中切口：沿牙槽嵴切开缺损区粘骨膜，钝性分离， 翻开颊、舌侧全厚粘骨膜瓣后，按种植手术要求，在指定的牙槽嵴位置，逐级 制备种植体窝，转数8 0 0 r m i n ，使各种植体间间隔1 0 m m 。在制备好的种植体植 入床颊侧周围用慢速裂钻钻除骨组织，形成近远中向3 m m ，冠根向4 m m 的裂开性 骨缺损，种植钻孔与形成骨缺损的整个过程中用生理盐水冲洗降温冷却。植入 c d i cs c t i i3 8 1 0 m m 柱状螺纹种植体，使种植体肩部与缺损顶端平齐。骨缺 损部位按分组情况分别置入复合了不同浓度r h b m p 2 的珊瑚羟基磷灰石人造骨 材料和方法 或可吸收胶原海绵。各种植体上愈合帽。复位粘骨膜瓣，使其完全覆盖种植体， 间断严密缝合。术后l 3 天给予肌肉注射青霉素( 8 0 万单位天) 预防感染。 每只实验犬下颌骨左右侧各植入3 8 1 0 m mc d i cs c t1 1 种植体4 枚，8 只实 验犬共植入种植体6 4 枚。 5 四环素荧光标记示踪 分别于动物处死前第l o 天和第3 天皮下注射盐酸四环素3 0 m g k g ，进行四环 素荧光标记。 6 动物处死 分别于术后2 、4 、8 、1 2 周，各处死2 只实验犬。以3 0 9 l ( 3 ) 戊巴比妥 钠按1 m l k g 肌肉注射行全身麻醉后，用心内空气注射法处死实验犬。 三、标本制取 1 标本固定 动物处死后，分离下颌骨，将整个下颌骨取下，通过x 线片对种植体长轴进 行定位，由近远中向沿种植体长轴距离种植体5 m m 左右，锯断下颌骨，取出样本， 将含种植体骨标本置于1 0 福尔马林液在4 c 下固定4 8 d , 时。将己固定好的组织 标本以自来水流水冲洗2 4 d , 时，以完全除去组织中的甲醛。 2 组织脱水、透明、浸润和包埋 2 1 脱水与透明 固定后的标本先采用不同浓度梯度的乙醇进行脱水，再以氯仿进行透明。 脱水及透明时间见表1 。 1 2 博士学位论文 表l 含种植体骨标本脱水时间表 t a b l e1 t i m e t a b l eo fd e h y d r a t i o no fs a m p l e sc o n t a i n i n gi m p l a n t s 脱水溶液脱水时间 7 0 酒精 9 0 酒精 5 酒精i 9 5 酒精i i 1 0 0 酒精i 1 0 0 酒精i i 1 0 0 酒精+ 1 0 0 乙醚( 1 ：1 ) 氯仿溶液i 氯仿溶液i i 氯仿溶液i i i 2 4 d 时 2 4 d 时 3 0 d , 时 3 0 d , 时 2 4 d 时 2 4 d 时 2 4 d , 时 2 4 d 时 4 8 d 时 2 4 d 时 2 2 浸润和包埋 2 2 1 浸润 脱水后将标本置于浸润液中浸泡，浸润液需当天新鲜配制，浸润过程均在 4 c 中进行。浸润液中甲基内烯酸甲酯与邻苯二甲酸二丁酯按表2 方法配制，磁 力搅拌混合均匀( 图4 ) 。依次浸润标本各2 天，每天抽真空2 4 d , 时( 图5 ) 。 表2 含种植体骨标本甲基丙烯酸树脂浸润流程 t a b l e2p r o c e d u r eo fm e t h y l m e t h a c r y l a t ei n f il t r a t i o no fs a m p l e sc o n t a i n i n gi m p l a n t s 材料和方法 图4 双向磁力搅拌器 f i g 4d o u b l ed i r e c t i o nm a g n e t i cs t i r r e r 图5 真空泵及玻璃真空缸 f i g 5 t h ev a c u u mp u m pa n dg l a s sb o w l 1 4 博士学位论文 2 2 2 包埋聚合 配制包埋剂方法 去除成品甲基丙烯酸甲酯中的阻聚剂，将l ：l 成品甲基丙烯酸甲酯和5 的氢 氧化钠加入分液漏斗，充分震荡，静止分层后漏弃下层液体，反复3 次，再用蒸 馏水以同样方法洗3 次，去除液体中氢氧化钠。然后往分液漏斗加无水氯化钙， 震荡混合数分钟，吸除水份，滤纸过滤去除氯化钙。上层滤液收集于瓶中，在4 c 冰箱中保存备用。 取去除阻聚剂的甲基丙烯酸甲酯( 单体) 9 5 m l ，苯二甲酸二丁酯5 m l ，无水过 氧化苯甲酰4 0 9 放入宽口耐热塑料瓶中，放入磁力转子，置于热水杯中水浴恒温 加热，恒温保持在5 0 ，置于磁力搅拌器搅拌2 小时。待液体降至室温，贴上标 签置于一4 冰箱中保存备用。将备好的标本置于底平、壁薄、干洁和大小适宜 的玻璃瓶内，并标记编号。加入包埋剂后盖上胶盖，在胶盖上钻孔以便排气。 继而连续抽真空2 小时，置于3 7 水浴恒温箱2 - 一3 天，取出包埋组织块即可做切 片( 图6 ) 。 图6 恒温水浴箱 f i g 6 e l e c t r i c h e a t e dt h e r m o s t a t i cw a t e rb a t h 材料和方法 2 3 切片制作 包埋后塑料部分均匀透明，可以清楚地观察到塑料内样本，定位简单方便， 也可通过x 线定位。只有种植体长轴与切片方向保持平行时，才能切出更多完整 的切片，从而提高磨片的成功率。下颌骨中植入的直径3 8 m m 种植体的标本可磨 出4 - 5 张磨片。 图7 树脂包埋后的标本 f i g 8 l e i e as p l 6 0 0s a wm i e r o t o m e 1 6 组织 的磨 片机 臂推 将骨 夹， 位上 经是 + 3 0 0 洗除液体石蜡片刻，氯仿数分钟置换出酒精。在洁净的载玻片上滴加l 2 滴市 售5 0 2 胶( 氰基丙烯酸酯) ，立即将组织片放在载玻片上，压平，数分钟后粘贴 牢固，接着手持载玻片用上述方法继续磨至4 0 5 0 9 m 厚。 图1 0 超卢波清洗器 f i g 10u l t r a s o n i cc l e a n e r 完成磨片后，先在荧光显微镜下观察荧光标记情况。然后经亚甲基蓝酸性 品红染色后光学显微镜下观察。 2 4 染色 博士学位论文 采用亚甲基蓝酸性品红染色。 2 4 1 配液 ( 1 ) 亚甲基蓝染液： 溶液a ：蒸溜水7 5 m l ，亚甲基蓝l g ；溶液b ：蒸溜水7 5m l ，高锰酸钾 1 5 9 。将溶液a 、b 混合，1 0 0 。c 水浴直至沉淀重新溶解，然后冷却至室温后过 滤。用滤纸过滤3 次，棕色瓶子装。 ( 2 ) 苦味酸酸性品红染液： 酸性品红0 2 5 9 ，冰醋酸o 5 m l ，甘油1 0 m l ，蒸溜水9 0 m l ，然后加苦昧酸 至饱和。滤纸过滤1 次，棕色瓶子装。 2 4 2 染色步骤： ( 1 ) 亚甲基蓝染液：6 0 。c 水浴染色8 分钟，滤纸吸干染液，然后自然晾干； 6 0 蒸溜水漂洗1 0 分钟左右，空气中干燥后进行下一步。 图1 1h w s l 2 型电热恒温水浴箱 f i g 11 h w s12e l e c t r i c - h e a t e dt h e r m o s t a t i cw a t e rb a t h ( 2 ) 酸性品红染液：把组织片完全泡在苦味酸酸性品红染液中，染色3 分 钟，滤纸吸干染液；空气中干燥后进行下一步。 1 9 材料和方法 2 4 3 脱水和透明 ( 1 ) 9 5 酒精脱水，5 分钟。 ( 2 ) 1 0 0 酒精脱水，5 分钟。 ( 3 ) 二甲苯透明，1 5 分钟。 2 4 4 树胶封片 把切片取出，用吸水纸轻吸干，最好别让切片完全干燥，以保留少量二甲 苯在上面为宜。快速把切片放在干洁的载玻片上，滴- d , 滴中性树胶在切片中 央，盖上盖玻片，由中央往四周均匀用力压紧盖玻片，使树胶往四周流动，然 后保持加压2 天左右待树胶干。 四、荧光及组织学观察 分别在荧光显微镜下和光学显微镜下观察缺损区新骨形成情况。 图1 2o l y m p u si x 5 1 倒置荧光显微镜 r i g 12 o l y m p u si x 51i n v e r t e dm i c r o s c o p e 2 0 博士学位论丈 1 荧光显微镜使用时应注意： ( 1 ) 荧光显微镜需要在暗室内进行观察，否则因有其他光线而影响观察的正 确性。 ( 2 ) 关闭房间内的电灯，开启显微镜荧光光源5 1 5 分钟，待光源