（临床检验诊断学专业论文）hgf促动脉血管形成的机理研究.pdf

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p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r反转录p c r s d f 1 s t r o m a lc e l l d e r i v e df a c t o r - 1 基质细胞衍生因子1 v e g fv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r血管内皮生长因子 v e g f r 一2v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r 2 血管内皮生长因子受 体2 强度， 的调节 用，及 来阐明 发生的 角度探讨h g f 是否通过n o t c h 信号通路调控祖细胞的分化来促动脉形成的机理 提供体外细胞模型。 方法： 第一部分体外培养h f a e c s ，并用不同感染强度( m o i ) ( 5 0 ，1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0 ， 2 5 0 ，3 0 0 p f u c e l l ) 的携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒( a d g f p ) 转染h f a e c s ， 通过流式细胞仪( 检测转染效率) 和m t t 法( 检测细胞损伤程度) 筛选和确定 最佳m o i ( 高转染效率且对细胞低损伤) ，作为下一步携带h g f 基因的重组腺 病毒( a d h g f ) 转染细胞的最优条件。a d ，h g f 以最佳的m o i 转染h f a e c s 4 8 h 后，收集细胞上清，用e l i s a 法检测h g f 蛋白的表达水平，选取h g f 表达水 平最佳的细胞提取总r n a ，通过反转录p c r ( r t - p c r ) 来检测n o t c h l 和d 1 1 4 基因的转录水平。以转染a d g f p 的细胞作为对照。 第二部分基于前期研究，a d h g f 以最佳m o i ( 2 0 0p f u c e l l ) 转染h f a e c s 后o h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h ，分别收集细胞上清，用e l i s a 法检测不同时间点h g f 蛋白的表达水平；同时收集细胞提取总r n a ，通过r t - p c r 检测不同时间点 h f a e c s 中n o t c h l 、d 1 1 4 和h e y 2 基因的转录水平；并采用m t t 法和t r a n s w e l l 迁移实验分别观察h f a e c s 增殖和迁移能力的变化及与d l l 4 - n o t c h h e y 2 信号通 兰州大学硕士学位论文 路激活的关系；均以转染a d g f p 的细胞作对照。 第三部分无菌、肝素抗凝，取脐血( 兰州军区总医院妇产科提供，产妇均 知情同意) 作为e p c s 的标本来源。用p b s 等倍稀释后取7m l 脐血缓慢加入装有 3 m l 淋巴细胞分离液的离心管中，2 0 0 0 r m i n 离心2 5 m i n ，取云雾状灰白色层单 个核细胞。将细胞接种在人纤维粘连蛋白包被的6 孔板中，培养于m 1 9 9 培养 基中。观察贴壁细胞的形态变化；采用免疫细胞化学法鉴定e p c s 。 实验数据采用s p s s l 3 0 软件进行统计分析。 结果： ( 1 ) 以高转染效率且对细胞低损伤为标准，确定最佳m o i 为2 0 0p f u c e l l ； e l i s a 法检测h g f 表达水平的结果显示，a d g f p 组：( 3 6 7 2 - - 匕0 8 1 n g m l ； a d h g f 组：( 8 6 3 1 8 4 - 3 8 6 4 ) n g m l 。两组比较转染后4 8h 的h g f 表达水平有统 计学差异( 氏o 0 5 ) ； ( 2 ) a d h g f 转染h f a e c s 4 8h 后，r t - p c r 结果显示，通过紫外凝胶分 析仪，可观察到a d h g f 组的n o t c h l 和d 1 1 4 基因转录水平明显上调；应用凝胶 成像分析系统分析凝胶成像图中目的基因的相对强度，结果显示：a d g f p 组和 a d h g f 组的数据分别为：d 1 1 4 ，o 7 8 8 + 0 0 2 1 和0 9 3 6 + 0 0 1 8 ；n o t c h l ，0 和 0 4 5 8 + 0 0 2 3 ，两组间进行单侧f 检验分析，p 0 0 5 ) ；迁移介质中含h g f 时，在2 4 h 、4 8 h a d h g f 兰州大学硕士学位论文 组细胞的迁移能力明显强于对照组( 0 0 5 ) ，且迁移能力在4 8 h 强于在2 4 h 但无 统计学差异( 矿0 0 5 ) ； ( 6 ) e p c s 体外培养形态观察结果：细胞呈梭形，随培养时间的延长呈“铺 路石”样，与有关文献报道相一致； ( 7 ) 免疫细胞化学法鉴定e p c s 的结果显示：分离培养的细胞v e g f r 一2 和c d l 3 3 均呈阳性反应，c d 3 4 反应较弱。 结论： ( 1 ) h g f 对h f a e c s 的n o t c h l 受体和d 1 1 4 配体有诱导作用。暗示了h g f 促动脉形成机制可能与n o t c h 信号通路有一定的关联性； ( 2 ) h g f 可能通过激活动脉内皮细胞的d 1 1 4 n o t c h h e y 2 信号通路，间接 地增强动脉内皮细胞增殖和迁移能力，来促进子代动脉分支的形成； ( 3 ) 采用密度梯度离心法从人脐血中分离培养的细胞具有e p c s 特性，可 作为我们所需的体外细胞模型。 关键词： 肝细胞生长因子( h g f ) ；n o t c h 信号通路；动脉生成；基因转录；内皮 祖细胞( e p c s ) ； i v 兰州大学硕士学位论文 t h e s t u d yo nt h em e c h a n i s mo fh g f m e d i a t e da r t e r i o g e n e s i s o b j e c t i v e ： a b s t r a c t ( 1 ) t oi n v e s t i g a t et h er e g u l a t i o no fd 1 1 4a n dn o t c h lm e d i a t e db yh e p a t o c ”e g r o w t hf a c t o r ( h g f ) i nh u m a nf e m o r a la r t e r ye n d o t h e l i a lc e l l s ( h f a e c s ) ，a n dt o e s t a b l i s ht h eb a s i sf o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i n gt h em e c h a n i s mo fh g fp r o m o t i n g a r t e r i o g e n e s i s ； ( 2 ) t oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep r o l i f e r a t i o na n dm i g r a t i o n a b i l i t yo fa r t e r ye n d o t h e l i a lc e l l sa n dd l l 4 - n o t c h - h e y 2s i g n a l i n gp m h w a yi nt h e p r o c e s s o fa r t e r i o g e n e s i s ，a n de l u c i d a t et h em e c h a n i s mo fh g fp r o m o t i n g a r t e r i o g e n e s i s ( 3 ) e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ( e p c s ) w e r ei s o l a t e d ，c u l t u r e da n di d e n t i f i e d n v i t r o ，a n dw h i c hw e r eu s e da sas t u d ym o d e lf r o mt h ep o i n to fa n g i o g e n e s i s ，t of u r t h e r i n v e s t i g a t et h a th g fp r o m o t e dt h ef o r m a t i o no fa r t e r yw h e t h e rv i an o t c hs i g n a l p a t h w a yr e g u l a t i n gt h ed i f f e r e n t i a t i o no fp r o g e n i t o rc e l l so rn o t m e t h o d s ： p a r t1h f a e c sw e r ec u l t u r e d nv i t r oa n di n f e c t e dw i t ht h ed i f f e r e n t m u l t i p l i c i t yo fi n f e c t i o n ( m o i ) o fa d g f p ( 5 0 ，10 0 ，15 0 ，2 0 0 ，2 5 0 ，3 0 0p f u c e l l ) t h e o p t i m a lm 0 1w a ss c r e e n e da n dd e t e r m i n e db ym t t ( d e t e c t i n gt h ed e g r e eo fc e l l d a m a g e ) a n df l o wc ) ，t o m e t r y ( d e t e c t i n gt h er a t eo ft r a n s f e c t i o n ) ，a n du s e da st h e o p t i m a lm o i o fa d h g f a t4 8ha f t e rh f a e c sw e r ei n f e c t e dw i t ht h eo p t i m a lm o i o f a d h g f ，h g fe x p r e s s i o n l e v e li nt h e s u p e r n a t a n t w a sd e t e c t e d b y e l i s a ；m e a n w h i l e ，t h et r a n s c r i p t i o no fn o t c hla n dd 1 1 4g e n e sw a sd e t e c t e db y r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r ( r t - p c r ) a d - g f p - i n f e c t e dh f a e c sw e r eu s e da s n e g a t i v ec o n t r o l s v 兰州大学硕士学位论文 p a r t2o na c c o u n to fp r o p h a s es t u d y ，c e l l sa n ds u p e m a t a n tw e r eh a r v e s t e da t t h ei n d i c a t e dt i m e s ( 0 ，2 4 ，4 8 ，7 2h ) a f t e rh f a e c sw e r ei n f e c t e d 诵t ht h e2 0 0p f u c e l lo f a d h g f h g fe x p r e s s i o ni nt h es u p e m a t a n tw a sd e t e c t e db ye l i s aa n dt h e t r a n s c r i p t i o no fn o t c h l ，d 1 1 4a n dh e y 2g e n e sw a sa n a l y z e db yr t p c r t h ec h a n g e s i nt h e p r o l i f e r a t i o n ，s u r v i v o r s h i p a n dm i g r a t i o n a b i l i t yo fh f a e c s ，a n dt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd l l 4 - n o t c h h e y 2s i g n a l i n gp a t h w a ya n dt h e mw a sd e t e c t e d r e s p e c t i v e l yb ym t ta n dt r a n s w e l lm i g r a t i o ne x p e r i m e n t a d g f p - i n f e c t e dh f a e c s w e r eu s e da sn e g a t i v ec o n t r o l s p a r t3c o r db l o o d ，a s e p s t i c ，a n t i c o a g u l a t e db yh e p a r i n ，w a su s e da st h e e x a m p l er e s o u r c eo fe p c s a f t e rd i l u t i n gw i t hp b s ( i ：i ) ，7m lo fc o r db l o o dw a s a d d e ds l o w l yi n t oc e n t r i f u g et u b ew h i c hc o n t a i n i n g3 m lo fl y m p h o c y t ei s o l a t i o n t o c e n t r i f u g ef o r3 0m i na t2 0 0 0r m i na n dc o l l e c tt h em o n o n u c l e a r c e l l si nc l o u d i n e s s b u f f yc o a t c e l l sw e r ei n o c u l a t e d i n6 - w e l l p l a t ec o a t e dw i t hh u m a np l a s m a f i b r o n e c t i n p u r i f i e dp r o t e i na n dc u l t u r e d i nm 一19 9m e d i u m t oo b s e r v et h e m o r p h o l o g i cc h a n g eo fa d h e r e n tc e l l sa n di d e n t i f ye p c sb yi m m u n o c y t o c h e m i c a l m e t h o d e x p e r i m e n t r e s u l t sw e r e p r e s e n t e da s m e a n + s d s t a t i s t i c a l a n a l y s i s w a s p e r f o r m e du s i n gt h es p s s13 0s o f t w a r ep a c k a g e r e s u l t s ： ( 1 ) t h eo p t i m a lm o iw a s2 0 0p f u c e l la c c o r d i n gt ot h eh i 曲r a t eo ft r a n s f e c t i o n a n dt h el o wd e g r e eo fc e l ld a m a g e ；t h ee l i s ar e s u l t ss h o w e dt h a t a d g f pg r o u p - ( 3 6 7 2 + 0 8 1 0 ) n g m l ；a d - h g fg r o u p ：( 8 6 3 1 8 + 3 8 6 4 ) n g m 1 a t4 8 ha f t e r t r a n s f e c t i o n ，h g fe x p r e s s i o nl e v e lh a ds t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eb e t w e e nt w o g r o u p s ( p o 0 5 ) ； ( 2 ) a f t e ra d - h g ft r a n s f e c t e dh f a e c sf o r4 8 h ，t h ei u 乙p c rr e s u l t ss h o w e d t h a tt h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo fn o t c h la n dd 1 1 4g e n e sw a so b v i o u su p - r e g u l a t i o ni n a d h g fg r o u p ；t h er e s u l t so fg e l - - i m a g ea n a l y t i c a l s y s t e ms h o w e dt h a td 1 1 4 ： o 7 8 8 4 - 0 0 21a n d0 9 3 6 + 0 018 ；n o t c h l ：0a n d0 4 5 8 士0 0 2 3r e s p e c t i v e l yi na d g f p a n da d h g fg r o u p s ，a n dt h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo fo b je c t i v eg e n e sh a ds t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( p 0 0 5 ) b yh a l f t - t e s tw a sp e r f o r m e db e t w e e nt w og r o u p s ( 3 ) a f t e ra d h g ft r a n s f e c t e dh f a e c sa tt h ei n d i c a t e dt i m e s ，t h ee l i s a r e s u l t s v l 兰州大学硕士学位论文 s h o w e dt h a ta d h g fe f f e c t u a l l yt r a n s d u c e di n t oh f a e c s ，a n dh g f e x p r e s s i o nl e v e l h a dt i m e d e p e n d e n c ew i t h i n4 8 h ，a n db e g a nt od e c r e a s ea t7 2h ： ( 4 ) a f t e ra d - h g ft r a n s f e c t e dh f a e c sa t t h ei n d i c a t e dt i m e s ，t h er t - p c r r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o no fo n l yd 1 1 4g e n ew a sd e t e c t e da t0h ：t h e t r a n s c r i p t i o no fn o t c h la n dd 1 1 4g e n e sh a dt i m ed e p e n d e n c ew i t h i n4 8h ：t h e t r a n s c r i p t i o no fn o t c h lg e n eh a dn o tb e e nd e t e c t e da n dd l l 4w e a k e n e do b v i o u s l ya t 7 2h ：k i n e t i c so fh e y 2i n d u c t i o nb yh g fw a sc o n s i s t e n tw i t ht h a to fn o t c h l t h e r e s u l t so fg e l i m a g ea n a l y t i c a ls y s t e mw e r ec o n s i s t e n tw i t ha b o v e - m e n t i o n e d o b s e r v a t i o nr e s u l t s ； ( 5 ) i nm t te x p e r i m e n to fa d h g f i n f e c t e dh f a e c s a tt h ei n d i c a t e dt i m e s ，i t w a si n i t i a l l yo b s e r v e dc o m p a r i n gw i t ht h ea d g f pg r o u pt h a tt h ep r o l i f e r a t i o na n d s u r v i v o r s h i pa b i l i t y o fh f a e c se n h a n c e do b v i o u s l y t h et r a n s w e l lm i g r a t i o n e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em i g r a t i o na b i l i t yo fh f a e c sb e t w e e nt w o g r o u p sw a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ti nt h ea b s e n c eo fh g fa tt h ei n d i c a t e dt i m e ( 矿o 0 5 ) ；b u tt h em i g r a t i o na b i l i t yo fh f a e c si na d h g fg r o u pw a so b v i o u s l ym o r e e n h a n c e dt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u pi nt h ep r e s e n c eo fh g fa t2 4ha n d4 8 h ( p o 0 5 ) ，a n dt h a ta t4 8hw a sm o r ee n h a n c e dt h a na t2 4hi na d h g fg r o u pb u th a d n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( 矿o 0 5 ) ( 6 ) t h er e s u l t so fo b s e r v i n gt h em o r p h o u so fe p c sc u l t u r e di nv i t r os h o w e dt h a t c e l l sw e r ef u s i f o r ms h a p ea n dt h ea p p e a r a n c eo f “s t o n e sp a v e dr o a d s ”w i t ht h el a s t i n g o fc u l t i v a t i o nt i m e a sw a sc o n s i s t e n tw i t ht h er e p o r tr e s u l t so fr e c o r d s ( 7 ) t h er e s u l to fi d e n t i f y i n ge p c sb yi m m u n o c y t o c h e m i c a lm e t h o ds h o w e dt h a t v e g f r 一2 、c d 3 4a n dc d13 3o fi s o l a t e dc u l t u r e dc e l l sw e r ea l lp o s i t i v e c o n e l u s i o n ： ( 1 ) h g fh a dt h eu p r e g u l a t i o ne f f e c to nt h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e lo f n o t c h la n d d 1 1 4 g e n e s i n h f a e c s ：s u g g e s t i n g t h a tt h em e c h a n i s mo fh g fp r o m o t i n g a r t e r i o g e n e s i sm i g h tb er e l a t e dw i t hn o t c hs i g n a l i n gp a t h w a y ( 2 ) b ya c t i v a t i n gd 1 1 4 - n o t c h - h e y 2s i g n a l i n gp a t h w a y , h g fi n d i r e c t l y v i i 兰州大学硕士学位论文 p r o l o n g e dc e l ls u r v i v a l ，p r o m o t e dt h ep r o l i f e r a t i o na n dm i g r a t i o na b i l i t yo fc e l l st o p r o m o t et h ef o r m a t i o no fo f f s p r i n ga r t e r yb r a n c h i n g ( 3 ) c e l l s ，w h i c hw e r ei s o l a t e d f r o mc o r db l o o db yd e n s i t yg r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o na n dc u l t u r e d ，h a dt h ec h a r a c t e ro fe p c s ，a n dm i g h tb eu s e da st h e f u r t h e rs t u d ym o d e l nv i t r o k e y w o r d s ： h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ( h g f ) ；d l l 4 - n o t c h h e y 2s i g n a l i n gp a t h w a y ；h u m a n f e m o r a la r t e r ye n d o t h e l i a lc e l l s ( h f a e c s ) ；g e n et r a n s c r i p t i o n ；e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o r c e l l s ( e p c s ) v i i i 兰州大学硕士学位论文 前言 冠心病、外周血管疾病发病率高，危害大，而且近年来由于人们膳食结构的 改变，生活节奏的加快，其发病率有逐年上升及年轻化的趋势。目前对这类疾病 主要采用手术或药物治疗的方法，虽可一定程度上改善患者的症状，但有一大部 分患者由于血管弥漫性病变或病变发生在小血管( 直径小于2m m ) ，手术无能为 力，而且部分患者即使成功进行手术，但成形术后7 1 4 天内有3 0 5 0 在6 个月 内会发生再狭窄而产生严重后果。支架植入术被认为是目前唯一治疗术后再狭窄 的方法，而支架植入术后仍有2 0 发生再狭窄。再狭窄者无法再手术，而且手 术存在再灌注损伤、危险性大、并发症多、费用昂贵、复杂等缺点，目前仅在一 些大医院进行。因此，探索一个有效、简便、可行的治疗方法是当前临床迫切需 要解决的问题。 近年来发展了局部应用促血管生成的细胞因子，促进血管新生，形成侧枝 循环的“分子搭桥术”，为缺血性心脏病及其他动脉缺血性疾病的治疗提供了新的 可能途径。目前研究较多的细胞因子是血管内皮细胞生长因子( v a s c u l a r e n d o t h e l i a lc e l lg r o w t hf a c t o r ，v e g f ) ，但其作用不如肝细胞生长因子( h e p a t o c y t e g r o w t hf a c t o r ，h g f ) 强，而且存在引起水肿、低血压等的问题。h g f 是一种多 功能的间质源性的生长因子，通过与其特异性膜受体c m e t 结合而发挥多样生物 学作用，是间质和上皮内皮细胞问相互作用的重要信息分子，对胚胎发育、组 织器官再生、伤口愈合和血管发生起重要的调节作用。已有研究证明，应用h g f 基因治疗缺血性疾病( 包括肢体缺血、脑缺血、心肌缺血及伤口愈合等) 1 - 4 j ， 结果取得了很好的疗效，说明h g f 有在局部促进缺血部位新生血管形成，重建局 部血液供应的作用，并且在促血管形成过程中形成的血管大多数是动脉。但 a d h g f 促动脉血管形成的机制还不清楚，究竟是什么机制导致h g f 在促血管形 成中形成的血管大多数是动脉呢? 众所周知，血管的形成是一个极其复杂、并受到精细调控的生物学过程【5 】。 从发生学和组织学的角度看，血管的形成从广义上可以分为2 种。其一是血管发 生( v a s c u l o g e n e s i s ) ，即发育初期中胚层来源的成血管细胞( a n g i o b l a s t s ) 或内皮祖细 胞( e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ，e p c s ) 分化成为成熟内皮细胞( e n d o t h e l i a lc e i t 螯, e c s ) 从头形成原始血管网；另一种是狭义的血管新生( a n g i o g e n e s i s ) ，即从组织中 兰州大学硕士学位论文 已存在的血管系统的内皮细胞增殖，以及游走而形成新的子代血管支。在这个过 程中，既存在细胞的增殖、分化和死亡，又存在细胞外基质的形成和降解；既存 在细胞与细胞之间的相互作用，又存在细胞与细胞外基质之间的相互调节和平 衡。此外，血管的形成还受到多种细胞因子和神经介质的精细调控。其中内皮细 胞的迁移、增殖、分化、管装化结构形成及血管稳定成熟是血管生长的一个重要 过程。由于内皮细胞在血管形成中的重要作用，所以研究h g f 对内皮细胞迁移、 增殖、分化和管状化结构形成的分子机理，对于阐明a d h g f 促动脉发生的机制 非常重要；又因为血管形成除了相邻血管成熟内皮细胞的增殖和迁移( 血管新生) 外，还包括中胚层前体细胞中内皮祖细胞的分化( 血管发生) 。近年的研究证据 表明，内皮祖细胞不仅存在于胚胎发育过程中，而且存在于成体【6 1 。还有研究表 n h g f 可动员骨髓内皮祖细胞参与成体血管的形成【_ 7 1 。故本研究将可能存在的参 与血管形成的内皮祖细胞和动脉内皮细胞作为体外细胞模型。 已有研究表叽n o t c h 及其配体在调节细胞分化及决定细胞命运方面非常关 键，在血管发育及平衡中发挥着重要作用。关于n o t c h 信号在血管发生过程中的 作用，在人、小鼠及斑马鱼已有较多的研究，如小鼠n o t c h 或其配体等的缺失会 导致血管发生的缺陷，人某些心血管疾病( 如c a d a s i l ) ，斑马鱼研究中发现 n o t c h 信号在动脉细胞发育中抑制静脉促进动脉的形成。以上研究表明n o t c h 信号 通路在血管形成、动脉静脉特化、血管重塑、血管稳定及组织特异性血管发生 中发挥着重要的作用。 由于n o t c h 信号在血管发生尤其是动脉发生中发挥着如此重要的作用，而 h g f 促动脉血管形成的机制还不清楚，所以设想h g f 是否通过对内皮细胞n o t c h 信号通路进行调控来影响e p c s 的分化和动脉内皮细胞的增殖及迁移进而促动脉 血管形成呢? 因此本课题的研究思路就是拟对h g f 对可能参与血管形成( 血管 新生；血管发生) 机制的两种内皮细胞【人股动脉内皮细胞( h u m a nf e m o r a l a r t e r y n d o t h e l i a lc e l l s ，h f a e c s ) 和e p c s 的关键信号通路d l l 4 - n o t c h - h e y 2 的影响 及产生的效应进行系统研究。 在各种n o t c h 受体及配体中，选择n o t c h l 、d 1 1 4 、h e y 2 基因的转录水平作 为检测指标，是因为n o t c h l 在出生后血瞀发生中发挥着关键作用【8 】；d i l 4 在血 管的发生中有潜在的重要性，在调节脉管动脉化发育中起重要作用，且d 1 1 4 特 2 兰州大学硕士学位论文 异的在动脉内皮细胞表达，它作为哺乳动物内皮n o t c h 的特异配体，在动脉血管 发生、成熟过程中发挥着重要作用【9 】，在动脉血管芽生形成过程中起重要作用【l o l 。 故以n o t c h l 、d l l 4 、h e y 2 、e p h b 4 、e p h r i n b 2 、c o u p t f i i 基因的转录水平作为 检测指标，通过系统研究后，最终阐明h g f 与e p c s 和h f a e c s 的n o t c h 信号 通路的关系，来揭示a d h g f 促动脉血管形成的分子机制。 本研究对局部应用a d h g f 治疗动脉缺血性疾病具有重要的理论意义和指 导应用价值。 兰州大学硕士学位论文 第一部分h g f 对人股动脉内皮细胞n o t c h l 和d i l 4 基因转录的调节作用 1 1 翮舌 在各种n o t c h 受体及配体中，我们研究d 1 1 4 和n o t c h l 基因是因为n o t c h l 在出生后血管发生中发挥着关键的作用8 1 ，d l l 4 在血管发生中有潜在的重要性， 在调节脉管动脉化发育中起重要作用，且d 1 1 4 特异地在动脉内皮细胞表达，它 作为哺乳动物内皮n o t c h 的特异配体，在动脉血管发生、成熟过程中发挥着重 要作用 9 1 ，在动脉血管芽生形成过程中起重要作用【1 0 1 。 鉴于基因治疗制剂a d h g f 治疗缺血性疾病的临床应用价值己初步得到证 实，其药理机制是a d h g f 应用于局部缺血部位，此部位组织作为一“微型药物 工厂”持续一定时间分泌表达h g f 活性蛋白，在局部促进缺血部位新生血管形 成，重建局部血液供应而达到治疗局部缺血的目的。本研究应用a d h g f 转染 h f a e c s 来探索h g f 对动脉内皮细胞的d 1 1 4 和n o t c h l 基因转录的调节作用， 为进一步探讨h g f 与动脉内皮细胞n o a h 信号通路的关系奠定基础。 材料与方法 1 材料 1 1 试剂 辣根酶标记山羊抗小鼠i g g ( h + g ) ( p e r o x i d a s e c o n j u g m e da f f i n n i p u r eg o a t a n t i m o u s ei g g ( h + g ) ) ( 中杉金桥) ，浓缩型d a b 试剂盒( 3 ，3 d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o c h l o r i d es u b s t r a t ek i t ) ( 中杉金桥) ，t a k a r ar n a i s or e a g e n t ( t o t a lr n a 提取试剂) 和t a k a r ar n ap c rk i t ( a m v ) v e r 3 0 ( 宝生物工程( 大连) 有限公 司t a k a r ab i o t e c h n o l o g y ( d a l i a n ) c o ，l t d ) ，胎牛血清( f b s ，杭州四季青) ， a d g f p ( 滴度为8 x 1 0 1 0 p f u l ) ( 携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒) 、a d h g f ( 滴度为5 x 1 0 1 0p f u l ) ( 携带人h g f 基因的重组腺病毒) ( 本实验室构建合成) ， 鼠抗人h g f 单克隆抗体及重组人h g f 蛋白纯品( r & d 公司) ，胰蛋白酶( a m r e s c o 公司) ，吐温2 0 、d m s o 、m t t ( s i g m a 公司) ，其余常规试剂均为国产分析纯 试剂。 1 2 仪器 o l y m p u s 倒置相差显微镜( 日本o l y m p u s 公司) ，层流超净工作台( 苏州净 化设备厂) ，c 0 2 恒温孵箱( r e v c o ) ，流式细胞仪( 美国b d 公司) ，离心机