（人体解剖与组织胚胎学专业论文）mesc培养体系、定向分化及其在烧伤中应用的研究.pdf

上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所里交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：弛夸恝 日期：枷年f 月艿日 卜 _ i t 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密函在土年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：船多、红 指导教师签名： 日期：州年，月艿e 1 日期：矽以年厂月巩e l 目录 中文摘要0 0 1 英文摘要0 0 3 第一章m e s c 自身饲养细胞的诱导培养和功能鉴定0 0 5 1 材料。0 0 6 2 方：法0 0 9 3 结果。0 1 4 4 讨 仑0 2 1 5 参考文献。0 2 3 第二章m e s c 诱导分化的上皮祖细胞的特性和长期培养0 2 5 1 材料0 2 7 2 方j 法。0 2 9 3 结果0 3 3 4 讨论0 4 6 囊参考文献0 4 9 第三章m e b d m i x 细胞对小鼠烧伤愈合作用的初步研究0 5 2 第一节烧伤小鼠模型0 5 2 1 材料。0 5 2 2 方法。0 5 3 3结果054 4讨论059 第二节m e b - d m i x 对小鼠烧伤愈合作用的初步研究。0 6 0 1 材料0 6 1 2 方法。0 6 3 3 结果0 6 6 4 讨论0 8 5 5 参考文献。0 8 8 结论0 9 0 综踅睦0 9 1 缩略词表 1 1 8 攻读学位期间主要研究成果 1 1 9 致 射 1 2 0 上瘁| ：盈土学博士学位论文 m e s c 培养体系、定向分化及其在烧伤中应用的研究 摘要 胚胎干细胞( e m b r y o m cs t e mc e l l s ，e s c ) 具有分化多能性( p l u r i p o t e n c y ) ，在 临床上有着广泛的应用前景。但目前关于e s c 培养和分化研究还存在不少问题和挑 战，如细胞分化途径尚不完善，分化细胞体外建系难等。本论文以小鼠胚胎干细胞 ( m e s c ) 为研究对象，对m e s c 的新培养体系、定向分化及其在烧伤中的应用进行研 究。本文共分三章： 第一章m e s c 自身饲养细胞的诱导培养和功能鉴定我们从小鼠e b 分化的三 个不同时期分离出4 8 个成纤维样细胞( m e b d f ) 系发现其中5 个成纤维细胞系( e f ) 能维持a 也s c 的多潜能和未分化特性，即当m e s c 与e f 共培养后，细胞碱性磷酸 酶染色为阳性；免疫细胞化学和r t - p c r 检测，细胞表达m e s c 特异性标记，包括 s s e a 1 ，o c t 4 ，n a n o g ；在体外可形成e b ，体内可形成畸胎瘤。 结论：本研究为m e s c 培养提供了一个新的培养体系，避免了常规用胎鼠成纤 维细胞作饲养细胞培养m e s c 所存在的缺陷。 ， 第二章m e s c 诱导分化的上皮祖细胞的特性和长期培养本研究结合特定诱 导液和基质对源自m e s c 的贴壁朗进行长期诱导，成功地获得一种上皮祖细胞 ( m e b d p e ) 。该细胞在我们已建立的m e b d f 上培养，不仅增殖速度快、生长稳 定，而且低密度细胞接种也能呈活跃的生长，有望建立一种永生化细胞系。通过倒 置相差显微镜和透射电镜观察，m e b d p e 具有典型的上皮细胞形态和结构，即呈椭 圆形或多角形，形态较规则一致，有上皮细胞间紧密连接，胞体游离面有许多微绒 毛，显示出明显的极性。细胞核型分析，r n e b d p e 染色体数在建系前后无改变。动 物体内致瘤性试验为阴性，表明该细胞系较安全。n f l e b d p e 除了表达上皮细胞共同 标志，如广谱角蛋白( p a n c y t o k e r a t i n ) 、e c a d h e r i n 外，还表达单层上皮角蛋白 上晦l ：t t 文学博士学位论文 ( c y t o k e r a t i n s 8 和c y t o k e r a t i n l8 ) 、非角化上皮上基层细胞角蛋白( c y t o k c r a t i n 4 ) 、 3 个内皮细胞相关标志( f u ( 1 、v w ，v e c a d h e r i n ) 和弱表达肝脏细胞标志( a f p 和a l b u m i n ) 。 结论：m e b d p e 是一种具有多潜能的上皮祖细胞，其应用潜能可能较为广泛。 这一实验结果为人e s c 诱导和分离类似多潜能细胞提供理论和实验依据。 第三章m e b - d m ix 细胞对小鼠烧伤愈合作用的初步研究以诱导m e b d p e 产生 的方法诱导m e s c 分化成一种包含上皮祖细胞在内的混合细胞群( m e b - d m i x 细胞) 。 为了探讨这类细胞是否对烧伤愈合的作用，我们将m e b d m i x 细胞皮下移植于m 度 烧伤小鼠，对照组注射p b s ，然后进行对比观察。结果发现细胞移植组比对照组创 口愈合早，创面修复结果较好，如瘢痕面积明显小于对照组，统计学上两者存在显 著差异。对移植细胞进行p c r 、x - g a l 染色和y 染色体原位杂交追踪检测，发现移 植细胞在烧伤部存留约两周，未发现移植细胞整合入再生的组织部位。通过炎症细 胞出现时间，以及细胞增殖周期核蛋白( k i 6 7 ) 和血管内皮细胞特异标志( v w f ) 的免疫组化检测结果表示，实验组的炎细胞出现时间比对照组约提前2 4 h ，实验组 创口完全上皮化和新生血管化都比对照组约提早3 天。 结论：移植m e b - d m i x 有利于小鼠烧伤愈合，其作用机制有待进一步研究，可 能与移植细胞的产物有关。 关键词小鼠胚胎干细胞，类胚体，饲养细胞，定向分化，细胞移植，烧伤 上海i ：匾大学博士学位论文 s t u d yo fc u l t u r es y s t e m d i r e c t i v e d i f f e r e n t i a t i o na n da p p l i c a t i o n i nb u r nh e a l i n go fm o u s e a b s t r a c t e m b r y o n i cs t e mc e l l s ( e s c ) a l ep l u r i p o t e n t i a lc e l l s t h e yh a v ee x t e n s i v e l yp r o s p e c t f o rc l i n i c a lt h e r a p y h o w e v e r , t h e r ea l es t i l lal o to f p r o b l e m sa s s o c i a t e dw i t hi nv i t r o c u l t u r ea n dd i f f e r e n t i a t i o no f e s c ，s u c ha si m m a t u r ea p p r o a c h e so fd i f f e r e n t i a t i o n , a n d d i f f e r e n t i a t e dc e l l sa l ed i 伍c u l tt ob ee s t a b l i s h e dc e l ll i n e s w eu s em o u s ee m b r y o n i cs t e mc e l l s ( m e s c ) a sm o d e lt o s t u d yt h ec u l t u r e ， d i f f e r e n t i a t i o na n da p p l i c a t i o no ft h e m t h er e s u l t sa sf o l l o w i n g ： p a r ti ：i n d u c t i o n ，c u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o no ft h ef e e d e rc e l l s d e r i v e df h m m o u s ee m b r y o n i cs t e mc e l l sw ed e r i v e d4 8f i b r o b l a s t 1 i k e c e l l ( r r 也a d f ) l i n e sf r o m t h es a m ee ba tt h r e ep h a s e s ，a n df o u n dt h a tf i v eo ft h e mn a m e de f f i c i e n tf i b r o b l a s t s ( e n w e r ec a p a b l eo fm a i n t a i n i n gm e s ci na nu n d i f f e r e n t i a t e da n dp l u r i p o t e n ts t a t u s m e s c c u l t u r e do ne ff e e d e rs y s t e me x p r e s s e da l k a l i n ep h o s p h a t a s ea n ds p e c i f i cm e s c m a r k e r s ， i n c l u d i n gs s e a - 1 ，o c t - 4 ，n a n o g ，a n df o r m e de m b r y o i db o d i e s nv i t r oa n dt e r a t o m a si n r i v e t h i ss t u d yp r o v i d e san o v e lf e e d e rs y s t e mf o rm e s c c u l t u r e ，a v o i d i n gal o to f d i s a d v a n t a g e so fc o n v e n t i o n a l l yu s e dm e f sa sf e e d e rc e l l s p a r ti i ：c h a r a c t e r i s t i c sa n dl o n g - t e r mc u l t u r eo fe p i t h e l i a lp r o g e n i t o rd e r i v e d f r o mm o u s ee m b r y o n i cs t e mc e l l s i nt h i ss t u d y , w eu s e s p e c i a lm e d i u ma n dm a t r i xt o i n d u c ee bd c r i v e df r o mm e s cd i f f e r e n t i a t e d i n t o as o r to fe p i t h e l i a l p r o g e n i t o r ( m e b - d p e ) w h e nc o c u l t u r i n gw i t hm e b d f , m e b d p eh a das t r o n gc a p a b i l i t yo f p r o l i f e r a t i o na n dc o u l dg r o ws t a b l y , e v e na tal o wp l a n t i n gd e n s i t yo fc e l l s t h e yw e r e h o p e f u lt ob e c o m ea l li m m o r t a lc e l ll i n e t h em e b - d p et o o ko nt h et y p i c a lm o r p h o l o g y a n dc o n f i g u r a t i o no f e p i t h e l i u m - - - - t h a ti s ，o v a lo rp o l y g o nc e l l sw i t hp o l a r i t y ：m i c r o v i l l i a tt h ed i s s o c i a t e df a c e t s ，a n dc e l l sw e r ec o n n e c t e db y f i g h tj u n c t i o n s t h em e b d p eg r e w b yf o r m i n gc o l o n y a f t e rp r o l o n g e dp a s s a g e s ，m e b d p em a i n t a i ni ns t a b l ea n da c t i v e - 3 - l、jr 上峪i ：t t 文学博士学位论文 p r o l i f e r a t i o ns t a t u s k a r y o t y p ea n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tm e b d p em a i n t a i nan o r m a l s e to fc h r o m o s o m e s ，e v e na f t e rp r o l o n g e dc u l t u r e o n c o g e n e s i st e s ts h o wt h a tm e b - d p e w a ss a f e i m m u n o c y t o c h e m i s t r ya n a l y s i ss h o wt h a tm e b d p en o to n l y e x p r e s s e d m a r k e r so fa l le p i t h e l i a ( e c a d h e f i na n dp a n - c y t o k e r a t i n ) a n dt h em a r k e r so fs i m p l ea n d s t r a t i f i e d e p i t h e l i u m ( c y t o k e r a t i n 5 8 ，c y t o k e r a t i n 4 ) ，b u t a l s o p a r t i a lm a r k e r so f e n d o t h e l i u m l k - 1 ，州师a n dv e c a d _ h e r i n ) a n dl i v e rc e l l s ( m pa n da l b u m i n ) t h e s e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tm e b d p ew a sas o r to fm u l t i p o t e n t i a le p i t h e l i u mp r o g e n i t o r a n dp r o v i d e dt h ep r a c t i c a la n dt h e o r e t i c a lb a s i sf o rc o o r d i n a t ed e r i v e df r o mh u m a ne s c p a r t l l l ：i n i t i a ls t u d yo fm e b - d m i xa c to nt h ew o u n dh e a l i n go fb u r nm o u s e a c c o r d i n gt ot h ea p p r o a c ho fi n d u c i n ge bd i f f e r e n t i a t i n gi n t om e b - d p e ，w ec o l l e c t e d t h ec e l l sm i g r a t e do u tf r o me b t h e s ec e l l sw e r ec a l l e dr n e b - d m i x ，a n dt r e a t e da s t r a n s p l a n tc e l l sf o rh e a l i n gs t u d yo fmd e g r e eb u mm o d e lo fm o u s e w ef o u n dt h a t w o u n dh e a l i n go fe x p e r i m e n t a lg r o u pw a sa b o u tt h r e ed a y sf a s t e rt h a nc o n t r o lg r o u p p c r ，x g a ls t a i n i n ga n di ns i t uh y b r i d i z a t o no fyc h r o m o s o m ew e r eu s e dt o t r a c e g r a f t - c e l l s w eh a v ef o u n dm e b - d m i xw e r ep r e s e n ti nt h ew o u n df o ra b o u tt w ow e e k s a f t e r i m p l a n t a t i o n , a n dd i d n o ti n t e g r a t ei n t ot h er e g e n e r a t i o ns i t e t h et i m eo f a p p e a r a n c eo fi n f l a m m a t i o nc e l l sa n dt h ei n l l t l u n o c y t o c h e m i s t r ya n a l y s i so f k i6 7a n d v w fs h o wt h a ta p p e a r a n c eo fi n f l a m m a t i o nc e l l s ，n e wb l o o dv e s s e l sa n dp r o l i f e r a t i o n c e l l sa r ee a r l i e ri ne x p e r i m e n t a lg r o u p t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tm e b d m i xh a d c a p a b i l i t yt op r o m o t et h ew o u n dh e a l i n go fb u m t h em e c h a n i s mo fe f f e c to fm e b d m i x n e e db ef u r t h e rs t u d i e d k e yw o r d s m o u s e e m b 巧o n i c s t e m c e l l ，e m b r y o i db o d y , f e e d e rc e l l s ， d i f f e r e n t i a t i o n ，c e l lt r a n s p l a n t ，b u m - 4 上喀l ：匝太学博士学位论文 第一章 m e s c 自身饲养细胞的诱导培养和功能鉴定 【摘要】目的探讨小鼠胚胎干细胞( m e s c ) 来源的饲养细胞是否具备支持自 体m e s c 未分化生长的能力。方法先诱导n 1 e s c 形成类胚体( 船) ，进一步诱导 其分化为成纤维细胞( m e b d f ) ，以用作饲养细胞。采用形态学、集落形成率、细 胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和r t - p c r 对生长在m e b d f 上的m e s c 的未分化特性进行鉴定。采用r t - p c r 和诱导r n e s c 体内外分化的方法鉴定m e s c 多分化潜能特性。结果从e b 三个发育阶段( e b 贴壁1 0 d 、1 5 d 、2 0 d ) 分离出4 8 个m e b d f 系，其中5 个( 大多来自1 5 d 的e b ) g 皂维持m e s c 未分化生长和多潜能性 达l o 代以上。生长在这种饲养层上的m e s c 与生长在m e f 上一样，其特性无明显 差异，均表达碱性磷酸酶和m e s c 的特殊标记，包括s s e a - 1 、o c t - 4 、n a n o g ， 在体外形成e b 和体内形成畸胎瘤。其它4 3 个m e b d f 系则不具有这种能力。结论 本研究结果不仅为m e s c 体外培养提供了一种新的饲养细胞，避免了m e f 作为饲 养细胞的许多不足；而且还提示m e s c 可诱导出功能不同的成纤维样细胞，其差异 的分子机制值得进一步研究。 【关键词】小鼠胚胎干细胞，类胚体，饲养细胞，分化 2 0 多年前，小鼠胚胎干细胞( m o u s ee m b r y o n i cs t e mc e l l s ，m e s c ) 的分离和维持 是以小鼠胚胎成纤维细胞( m o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s ，m e f ) 作为饲养层而获得的【l 】。 虽然此后发现白血病抑制因子( 1 e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r ，l i f ) 可代替m e f 触发 m e s c 自我更新【2 一钉，但这种自我更新能力很有限，易失去多潜能特性而向神经方 向分化【5 1 。最近，有些研究人员发现人工合成的聚酰胺也可替代m e f 支持e s c 生 长，然而他们也不能排除这些合成的基质对e s c 的负面影响【6 7 1 。因此至今许多实 验室对m e s c 的培养仍保留以m e f 为饲养层的共培养体系，因为m e f 不仅促使 e s c s 有效的对称自我更新，而且保持干细胞的广泛的分化潜能【8 】。 目前，仅有少数饲养细胞能支持m e s c 的生长，如m e f , s t o ( s 蹦m o u s e e m b r y o - d e r i v e dt h i o q u a n i n ea n do u a b a i nr e s i s t a n t ，s i m 小鼠胚胎来源的抗硫代氨基酸和哇 上辱l ：通史学博士学位论文 巴因细胞) 和幼仓鼠肾脏细胞( b a b y h a m s t e r k i d n e y c e l l s ，b h i 砬1 ) 等【9 1 1 1 ，其中m e f 最常用。m e f 能够维持m e s c 长期生长的特殊作用目前了解甚少。一般认为，m e f 提供m e s c 最佳的生长环境，如解毒，以及分泌许多特殊的蛋白参与细胞生长、胞 外基质形成和重塑，有利信号网络的相互作用等等2 1 。然而m e f 和其它饲养细胞 一样都是来源于异种或同种异体细胞，存在引入种间或种内病原体的可能性【1 3 - 1 5 】： 此外，还需不断培育胎鼠以制备m e f ，以及最佳应用期很短( 第4 代到第6 代) 等 不足【1 3 b 】。最近有研究者报导，人胚胎干细胞( h u m a ne m b r y o n i cs t e mc e l l s h e s c ) 来源的成纤维细胞可作为饲养细胞体系支持自体h e s c 生长【1 5 - 1 7 1 。在m e s c 培养中 尚未见类似报导。为试验m e s c 来源的成纤维细胞能否支持自身m e s c 生长，我们 分离了4 8 个小鼠类胚体来源的成纤维样细胞系( m o u s ee m b r y o i db o d y - d e r i v e d f i b r o b l a s t ，m e b d f ) ，发现其中5 个细胞系能够保持m e s c 未分化状态和多潜能能力， 而大多数( 4 3 4 8 ) 没有这种作用。本研究不仅m e s c 生长提供了一种新饲养细胞， 而且还提示m e s c 诱导出的成纤维样细胞具有不同的功能。文献中尚未见类似报导。 一材料 1实验试剂 1 1 细胞培养试剂 高糖d m e m ( h i g hg l u c o s ed u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m )g i b c o 胎牛血清( f e t a lb o v i n es e l a l n l ，f b s ) h y c l o n e l 谷氨酰胺( l g l u t a m i n e ) g i b c o 1 3 巯基乙醇( 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l ，1 3 - m e ) s i g m a 非必需氨基酸( m e m n o ne s s e n t i a la m i n oa c i ds o l u t i o n ) g i b c o 青霉素链霉素( p s ) g i b c o d 一磷酸缓冲液( d u l b e c c o sp h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) g i b c o 丝裂霉素c ( m i t o m y c i nc )s i g m a 明胶( g e l a t i n ) g i b c o i t s ( i n s u l i n t r a n s f e r r i n - s e l e n i u m ) g i b c o 0 2 5 胰酶( t r y p s i n - e d t a ，t e ) g i b c o o 0 5 胰酶( t r y p s i n e d t a ，t e ) g i b c o 全反式视黄酸( a 1 1 t r a n s r e t i n o i ca c i d ，r a )s i g m a 上侮文通史学博士学位论文 鸡胚提取液( c h i c ke m b r y oe x t r a c t ，c e e ) s i g m a 白血病抑制因子( 1 e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r ，l i f )s i g m a 表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r , e g f )s i g m a 二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o )s i g m a m e f 培养液( e f m ) ：h d m e m ，i o f c s ，i p s m e s c 培养液：h d m e m ，1 5 f b s ，o 1 m m2 - m e ，0 2 m m l - g l u t a m i n e ， 19 6 n e a a ，1 ，0 0 0 u m ll i f 诱导液1 ：d m e m ，1 0 f c s ，0 5 9 mr a ，1 p s 诱导液2 ：d m e m ，1 0 f c s ，1 0 h s ，1 n e a a ，1 c e e ，1 0 n g m le g f 成纤维细胞培养液：d m e m ，2 0 f c s ，1 n e a a ，i p s 细胞冻存液：d m e m ，1 0 d m s o ，1 0 f b s 1 2 免疫细胞化学试剂 1 2 1 试剂 4 多聚甲醛( p a r a f o r m a l d e h y d e ，p f a ) 的配制：4 9p f a ，加o i mp b s 至 1 0 0 m l ，加2 nn a o h 溶液1 0 0 i t l ，6 0 c 水浴加热溶解，4 c 保存备用。 o 1 mp b s ：8 9n a c l1 4 4 9n a 2 h p 0 4 1 2 h z oo 2 9k c io 2 9k h 2 p 0 4 ，加双 蒸水至1 0 0 0 m l ，溶解后备用。 1 2 2 抗体和显色系统 s s e a - 1 抗体 c h e m i c o n o c t - 4 抗体 s a n t ac r u z v i m e n t i n 抗体 b o s t e r f i t c 标记的二抗 j a c k s o n g o a ta n t i m o u s ei g g + i g ml a c k s o n d a b 显色系统 b o s t e r 1 3r t - p o r 试剂 髓z o l i n v i t r o g e n r a n d o mp r i m e r p r o m e g a 7 - 上瘁文避文学博士学位论文 m - m l vr e v e r s et r a n s c d p t a s e p r o m e g a r n a f r e ed n a s e p r o m e g a d n t p鼎国生物技术公司 r n a s ei n h i b a t o r p r o m e g a t a q 酶 似【a l a 1 4 其他试剂 多聚甲醛( p f a ) s i g m a 牛血清清蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a )s i g m a b c p 伦j _ b tr o c h e 焦碳酸二乙酯( d e p c )鼎国生物技术公司 碱性磷酸酶反应缓冲液( b u f f e ri i i )0 1 m t r i s h c i ，0 1 m n a c i ，o 0 5 mm g c l 2 p h9 5 2 实验动物 n o n o b e s ed i a b e t i c s e v e r ec o m b i n e di r n m u n o d e f i c i e n c y ( n o d s c i d ) 小鼠，4 - 5 周龄，雄性，s p f 环境下饲养。昆明白孕小鼠( 1 3 1 4 d p c ) ，清洁级。以上动物 均由中科院实验动物中心提供。 3 实验仪器 细胞培养箱h e r ac e l l 超净工作台 a i rt e c h ，苏净集团 台式高速离心机 c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 倒置相差显微镜 o l y m p u sc k 4 0 p c r 仪 t 3t h e r m o c y c l e r 电泳仪 d y - 5 0 1 凝胶成像系统 s y n g e 小甩 上喀l ：咀史学博士学位论文 二方法 1m e f 饲养层的制备 实验用孕1 3 1 4 天的昆明白小鼠，实验步骤如下： 1 ) 小鼠脱臼处死，用无菌手术器械取出胚胎，去掉胚胎头部、内脏及四肢，用无 菌生理盐水冲洗后，将组织块剪成1l 姗大小的碎片，移入5 0 m l 离心管中。 2 ) 加0 2 5 t r y p s i n - e d t a 于3 7 0 消化2 0 3 0 分钟，而后加入e f m 培养液终止，吹 打后制成单细胞悬液。 3 ) 1 0 0 0 r p m ，5 r a i n 离心后弃去含酶液体，再用1 0m le f m 培养液重悬细胞，将细 胞接种在7 5 c m 2 的培养瓶，来回晃动培养瓶，使细胞尽可能均匀地分散于整个 培养瓶中。 4 ) 待细胞生长超过9 0 融合时，用0 2 5 t r y p s i n - e d t a 消化后传代。 5 ) 传代3 - 4 次后，待细胞生长至8 0 融合时，弃除旧的培养液，加入6m l 含丝裂 霉素c ( 终浓度为1 0i _ t e d m l ) 的e f m 培养液继续培养3 - 4 个小时。 6 ) 除去含丝裂霉素c 的培养液，用p b s 洗5 7 遍，用0 2 5 t r y p s i n 。e d t a 消化， 制成单细胞悬液。培养皿预先用o 1 明胶处理l 小时。细胞按照5 0 0 0 c e l l s m l 的密度均匀地接种在培养皿中。 7 ) 铺好细胞的培养皿放在3 7 培养箱中待用。一般可放置一周。 2m e s c 培养 。 1 ) 复苏m e s c d 3 ( c r l - 1 1 6 3 2 ，a t c c ) 从液氮中取出后迅速投入3 7 ( 2 水浴中， 震荡直到细胞悬液融化，用1 0m lp b s 稀释细胞悬液，1 0 0 0 转离心5 分钟，弃 上清，用m e s c 培养液将细胞重悬后加到铺有饲养层的6 c m 培养皿中，在3 7 ( 2 ， 5 的c 0 2 培养箱中培养。 2 ) 培养每2 4 小时更换培养液一次，并在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况。 3 ) 传代细胞接种后2 - 3 天传代。集落边缘出现分化前，吸弃旧培养液，加入lm l 0 0 5 胰酶e d t a ，置3 7 c ，消化5m i n 。弃去酶，用p b s 洗去残余的酶，加入 2m l 新鲜培养液，轻轻吹打细胞集落数次，使其从培养皿的底部脱落下来，并 被吹散。将细胞悬液按照1 ：6 分到新的预铺有饲养层的培养皿中，并补足培养 液。置3 7 ，5 c 0 ：培养箱中培养。 4 ) 冻存当m e s c 扩增到需要的数目时，多余的细胞可冻存。一般在m e s c 生长了 4 8 小时后，用o 0 5 胰酶e d t a 将其消化下来，用m e s c 培养液重悬细胞集落 上喀l ：l t 大学博士学位论文 后，缓慢地加入1 0 d m s o ( 冰上操作) ，混匀后，4 c 平衡3 0 分钟，放入冻存 盒，置7 0 c 冰箱，第二天移入液氮长期保存。 3 小鼠成纤维样细胞的诱导 1 ) n l e s c d 3 按常规培养。 2 ) 为诱发类胚体( c m b r y o i db o d i e s ，e b ) 产生，将1 1 1 e s c 悬浮培养5 6 d ，培养液 为诱导液1 。 3 ) 为进一步诱导e b 分化，将形成的e b 贴壁培养于预涂o 1 明胶的培养皿中，改 用诱导液2 进行培养。 4 ) 隔日换液，培养到第1 0 d ，用o 0 5 胰酶e d t a 消化从e b 迁移出的细胞，将消 化下来的细胞接种于预先涂有明胶的培养皿中，按常规培养。 5 ) 其余贴壁e b 进一步培养，再经5 d 和1 0 d 分别重复培养消化下细胞的步骤。 6 ) 以上三个阶段被消化下来的细胞即为原代细胞，原代细胞培养5 1 0 d 达到9 0 融合时，用0 0 5 的胰酶e d t a 消化传代，传代细胞改换用e i m 进行培养，直 到形态全为成纤维样，统称为m e b d f ，共获得4 8 个m e b d f 细胞系。 4m e b - d f 作为饲养层的评估 为测试4 8 个m e b d f 细胞系是否具备支持m e s c 未分化生长的能力，将n 也b ：d f 作为饲养层与m e s c 共培养后进行评估，步骤如下： 1 ) 第5 2 0 代的n 也b d f 长到9 0 融合时，按常规制备饲养层的步骤进行，用细胞 霉素c ( 终浓度为1 0 p g m 1 ) 处理细胞后，接种于预涂有0 1 的明胶培养皿中 即为饲养层，接种密度为1 0 ，0 0 0 1 2 ，0 0 0c e l l s l c m 2 。 2 ) 将i i l e s c 接种于i 衄一d f 上进行培养，以m _ e f 饲养层为对照，每日换液。培养 2 3 天后用0 0 5 胰酶e d t a 进行消化传代，接种于预备好的饲养层上。 3 ) n l e s c 的集落形成率和分化率按以下公式计算：集落形成率= ( 集落数5x1 0 5 ) 1 0 0 ；集落分化率= ( 分化集落总的集落数) 1 0 0 。每次集落计数2 0 个视野( 1 0 0 ) ，重复3 次。碱性磷酸酶染色结果：未分化集落为全染色集落，分化集落包 括部分染色和未染色集落【1 引，结果以m e a n s + s e m 表示。 5m e s 0 的核型分析 1 1 1 e s c 与m e b d f 共培养前后，按g 带方法【1 9 】对其进行核型分析，每个细胞样 品均取2 0 个染色体中期进行计数。步骤如下： 上略| ：通大学博士学位论文 1 ) m e s c 与m e b - d f 共培养两天后，往培养液中加入秋水仙素( 终浓度为o 1i t g m 1 ) 3 7 c 孵育3 小时。 2 ) 收集单细胞悬液，1 0 0 0 r p m 离心5 分钟。 3 ) 去上清，p b s 洗一次，1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，收集细胞。 4 ) 0 0 7 5m k c l3 7 c 低渗1 5 分钟。 5 ) 1 0 0 0 转离心l o 分钟收集细胞，加入固定液( 甲醇：冰醋酸3 ：1 ) ，预固定2 5 分钟。 6 ) 8 0 0 转离心5 分钟收集细胞，加入固定液( 甲醇：冰醋酸2 ：1 ) ，固定2 5 分钟。 7 ) 8 0 0 转离心5 分钟收集细胞，加入固定液( 甲醇：冰醋酸3 ：1 ) ，4 冻存。 8 ) 冰片滴片，晾干，标本片室温老化3 6 天，6 0 c 老化3 小时。 9 ) o 1 2 5 胰酶消化处理3 0 秒。 1 0 ) g i e m s a 染色，油镜观察，拍照分析 6 免疫细胞化学 将欲进行免疫细胞化学的细胞接种于小玻片上，培养2 天后，实验步骤如下： 1 ) 取出小玻片，p b s 洗3 遍，用4 p f a 室温固定2 0 分钟 2 ) 0 1 t r i t o nx 1 0 0 p b s 室温处理1 0 m i n 。 3 ) p b s 洗后用3 b s a p b s 阻断3 0 m i n 。 4 ) 加入已稀释的一抗，置湿盒中4 孵育过夜。用b s a 代替一抗作为阴性对照。 使用的一抗包括v t m e n t i n 、o c t - 4 、s s e a - 1 ，二抗标记f i t c 或辣根过氧化物酶 ( m 冲) ( j a c k s o n ) ，后者用d a b 底物( 博士德) 显色，苏木素复染。 5 ) 结果在显微镜下观察，拍照( a x8 0 ；o l y m p u s ) 。 7 碱性磷酸酶染色 为确定培养于m e b d f 上的m e s c 是否分化，细胞预先准备同上，用碱性磷 酸酶染色进行鉴定，步骤如下： 1 ) 取出小玻片，4 p f a 室温固定2 0 分钟。 2 ) 用碱性磷酸酶缓冲液洗3 3 分钟。 3 ) 加入用碱性磷酸酶缓冲液稀释的反应底物n b t b c i p ( 1 ：5 0 ) ，室温避光显 色1 5 2 0 分，以在m e f 上培养的m e s c 细胞作为阳性对照，以饲