（作物遗传育种专业论文）海洋红酵母耐盐基因cdna文库的构建与序列分析.pdf

海洋红酵母耐盐基因c d n a 文库的构建与序列分析 摘要 海洋红酵母为单细胞真核生物，不能运动，细胞一般呈圆柱形、椭圆形或圆形， 细胞长约3 1 0 u m ，宽约1 5 5 5 u m ，其形态和大小受培养条件和培养时间的影响常 常会发生改变，其菌落为粉红色。繁殖方式主要为芽殖，少数为裂殖，条件适宜时有 些种类可进行有性繁殖。红酵母属中有许多海洋红酵母种能寄附于鱼虾蟹体表，与其 共生，而且可以在高盐条件下良好生长。 二十世纪以来，分子生物学与生物技术得到了迅猛发展，在农业和医药业都得到 了飞速发展，尤其是人类基因组计划的成功实施，使人们更多的从事着生物技术行业， 但是生物技术研究的范围很广，所以对于海洋红酵母的研究还处于刚刚起步阶段，士 世纪8 0 年代日本最早分离到海洋红酵母，然后发酵培养，用做鱼虾的营养饲料。目 前对海洋红酵母的功能基因的报道还较少，本论文从寄附于鱼虾蟹体中的海洋红酵母 中利用s s h 技术构建了高效盐诱导基因c d n a 文库，并取得了部分研究成果： 利用消减杂交技术构建了海洋红酵母盐诱导c d n a 抑制差减文库，一共获得了2 7 0 个阳性克隆。通过挑取2 5 个克隆，然后进行测序，在n c b i 中进行b l a s t 序列比较， 结果有一个初步认为与耐盐基因相关，1 2 个与红酵母的r r n a 有较高的同源性，1 0 个属于无效序列，还有2 个在b 1 a s t 中比较时无任何序列线索。由此结果可以得出， 可能有一些未知基因与海洋红酵母的耐盐性有关。由于海洋红酵母的功能基因报道的 很少，在n c b i 中只有2 0 多个，所以本实验获得的三个基因片段很可能是耐盐相关基 因，具有一定的研究价值。 关键词：海洋红酵母耐盐基因s s h 序列分析 a b s t r a c t o c e a ni m o d o t o m i ai sas i n g l ec e l le u l ( a r ) r o nb i o l o g y ，觚dc a i l i l o tt 1 1 em o v e m e n t ， c o m m o i d yn l ec e u 弱s u m et l l ec y l i n d e r ，t h ee 1 1 i p s eo rn l ec i r c u l a rg e n e r a l l y ，m ec e l ll o n g a p p r o x i m 砒e l y3 1 0 u m ，诹d ea p p r o x 妣l y15 5 5 u m ，i t ss h 印ea n dm es i z ea r er a i s e d t l l ec u l t i v a t ec o n d i t i o na n dm er a i s et i m ew i l li n n u e n c eo c c u r 舶q u e m l yt h ec h a n g e ，i t s c o l o i l yi s t 1 1 ep i n k t h er e p r o d u c t i o nw a yi sm a j n l yt l l eb u d d i n g ，m i n o r i t yb r e e d sf o rt l l e c r a c k ，w h e nc o n d i t i o nb e i n gs u i t a b l es o m e 咖e sm a yc a r 叮o nt l l es e x u a lr e p r o d u c t i o n a l o to f o c e a l l d o t 0 “a so f m e d o t o r u l a u sc a t e g o r yp a r a s i t i 捌i nt h ef i s ha n ds m m p c r a bb o d ys u r f k e ，w i t hi t sn e r 伊o w t l l i tc a ng r o wa l lr i g h ti nh i 曲s a l t s i n c e t v 旧n t yc e n t u 叮， m o l e c u l a r b i o l o g y锄db i o t e c h n o l o g yh a v eal a 唱e d e v e l o p m e n t ，a 鲥c u l t u r ea n dp h y s i ch a v eb e e ns p e e d i l yd e v e l o p m e n tt o o ，e s p e c 谢l ya f i e r t h ep l a no fh u m a i lg e n o m ew a ss u c c e s s m l l yi m p l e m e n t e d ，m o r ep e o p l ee n g a g e di i l b i o t e c h n o l o g ) ri l l d u s n ) ，b u tt h ea r e ao ft l l eb i o - t e c l l l l o l o g ys t u d yw a sv e 巧e x t e n s i v e ， o c e a i lr h o d o t o r u l a sh a v eb e e ns t u d i e db yp e o p l ea tb e g i l l l l i n g ，0 nt h ee n do fl9 8 0 s ， o c e a n 删o t o m l a ss e p a r a t i o nf 如ms e aa n dj a p a n 、v a st h ef i r s ts u c c e e di i lc u l t i v a t i o nb y z 弘n o l y s i s ，t l l eo c e a i li d o t o r u l ao fc u l t i v a t i o n 、a su s e df o rag o o dn u t r i i n e n ：t a lt 0f 如d f o rf i s ha n ds n l p a tp r e s e n t ，m e 如n c t i o ng e n eo fo c e a i lr h o d o t o r u l 懿w a sl e s sr e p o r t e d i h i se x p e d m e n tf i r s t l yc o n s t m c t e dc d n al i b r a r ) ro fs 仃e s ss a l tf 硒mo c e a i lr h o d o t o r u l a ， a n d ( 1 a _ t aa n dl - e s u l t s 、v e r ei e p o r r t e di nt h j sm e s i s ： c o n 咖u c t i o no fc d n al i b r a r y0 fs a l ts t r e s s 舶mo c e a i lr h o d o t o m l ab ys u p p r e s s i o n s u b 仃a c t i o n 、ep i c k e du pt w oh l m d r e ds e v e n t yc l o n e s ，a 1 1 dr a n d o m l ys e l e c t e dt 1 1 e 押e n t y f i v ec l o n e sf o rs e q u e n c e ，a 1 1 dt h er e s u l t so fs e q u e n c ew e r ca l l a l y s i so nb l a s ti i ln c b i t h e a 1 1 a l y s i sr e s u l ts h o w e dt 1 1 a to n ec l o n ew a sr e l a t e dp o s s i b l yw i t hr e p o r t e dg e n eo f s a l tg t r e s s ； t w e l v ec l o n e sh a v eak 曲l yh o m 0 1 0 9 0 u s 讯mr r n ao fr h o d o t o m l a s ；似oc l o n e s w e r e 墩o w ng e n eo rc o d i n gp r o t e i nu 1 1 l ( o w na m c t i o n ；t e nc l o n e sw e r eu s e l e s si nb l a s to f n c b i w ek n o w n 矗o mt 1 1 er e s u l t ：s o m eu f l l m o w ng e n e s 、e r er e l a t e dw i ms a l ts t r c s so f o c e a i lr h o d o t o r u l a b e c a u s em e 劬c t i o ng e n e so fo c e a i lr h o d o t o r u l a 、e r e l e s s l y r e p o 毗d ，o n j y 似e n t y 缸l c t i o ng e n e so fo c e a l lr h o ( 1 0 t o m l aw e r er e p o 毗di nn c b i ， t h e r e f o r e “se ) | r p e r i m e mo b t a i n st h r e eg e n e 触g m e n t sw e r er e l a t e dw i t i lg e n eo fs 甜ts r e s s a n dh a v ec e i r t a i l lr e s e a r c hv a l u e k e yw o r d s ：o c e 锄r h o d o t o r u l a g e n e sr e s p o n s e st os a l ts t r e s s s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n s e q u e n c ea n a l y s i s i i 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重卢明：所星交的学位论文，是本人在导师的撸导卜。独立进行研究1 ：作所取得的 成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的 法律结果由本人承担。 论文作者签名：谢2 芡僧 日期：洲萨6 月5 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部fj 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权海南人学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印：。缩印或疆描筹复 制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权! j 1 属海南人学。 保密论文在解密后遵守此规定。 导 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文 提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权懿 回壹途塞逞套丘澄卮i 旦兰生j 旦三生i 旦三玺蕉查。 论文作者签名划淡憎 导师签名： 日期：如话莎月 口塑i 窆盟! 塾! ! ! ! l r h o d o t o r u l ag l u t i n i 55 0 l 曲l en y l g l 弘e r o l y l c r 觚s e r el d g m l m r n ，p a r ci a lc d 8 l e n 们h = 8 9 4 s c o r ei6 q 3b i 8( 3 4 8 ，e x p e c c 0 0 i d e n c i c i e s 墨3 5 2 3 5 qc 9 9 j ，g a p s - 0 3 s 哇 f 0 每l s c r a n d = pl u s pl u 8 钮坨r y 1 s b j c 乞 s 哼l q 证r y6 1 翮j c c 6 0 1 q u e r y1 2 l s b j c c 6 6 l q u 芒r y 1 8 1 肋j c c7 z l q u e r y 2 q l s b j c c 7 8 王 q i 肥r y3 0 1 s b j c 乞 8 哇l g g t c g g g c j l c g j l a c g c a g i g c g 6 5 c t c g t g c g t t c t t c a c c cg i ：t g g t 6 c c g c c g i ii l | ii i | | i il ii li i | ii ii i | | i | i ii | f | li i | ii l i il li i | il | ii ji li l g g t c g g g c 知c g 五a c g 童ca g g c g g g c 了c g 土t g c g t t c t r c c c c g c t g g t g c c g c c g c g g g t g t g a g g t c c t t c t g c c c o c c c g a t c l - r t c c c t t c c c g t c g 舂 c c g c g c i li il li i i iii i i ii i l li il ii ii li l | il il i | li li ll li | l ii li l i i i | ll i c g g g 1 r g t g a 且g g j l j l t c c t t c t g c c c g c c c g a j l t ct r t c c c t t 置c c c g t c g j l a c c g c g c g 置t t a a t g g a g g 基g 乞t c g g g 囊9 9 8 9 9 a g g a e g c c g a g g g a g c t g g g g a g g c g g a g g 基o g ii ili ll l i ll lll l i li li ll ii ill ll l l ll li lli lllli ll ill ll l1l l g t t a t g g 工g g 且g t t g g 0 3 g g g g 0 g 盖c g t c g 0 5 g 且g c t g g g g g g c g g g g a c g t c g 氐g g a g g a g c 乞g g g g a g g a g g a g g a c c 乞c 9 8 9 9 9 a g c 乞g g g g a g g c g g a g g a e g c c g a l l l ll | ll il i i l l ll l i ll l lf i i ll i i ii i i li l l il ill i l t c g g g a g g a g t t g g g g g g g g a g g j l c g t c g g g g 且g c t g i g g g g c g g a g g a c g t c g g g a g g a g 匕c g g g g a g g 氨g t t 七g 七c g a 9 9 8 9 9 a g g a g l 直g g g t t t c t c c t c g c c t g t 置g 【t i il | f fl ll l l l i li ll li f | | l ll l | | | fl ll | | li ll ll l i ll ll | l il il | l l i g g g g 直g 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) ，5 0 0 i i l mn a c l ，3 s d s ，最后用冰乙酸调p h 值到5 5 。 2 0 1 d e p c 处理水 在9 9 9 9 m 1 的d d h 。0 中加入1 m 1 d e p c ( 在通风橱中进行) ，用磁力搅拌器搅拌过夜， 然后1 2 l o c 湿热灭菌4 0 m i n ，整个过程需带上手套和口罩。 3 3 mn a a c 、4 ml i c l 和酚：氯仿：异戊醇 n a a c 溶解后需用5 的盐酸调p h 值到5 2 ；l i c l 不用调p h 值；酚：氯仿：异戊 醇比例为2 5 ：2 4 ：l 注意：以上溶液均用o 1 d e p c 处理过的水配制。 4 1 4 器皿的使用和消毒 所用的溶剂瓶等一些玻璃器皿、研钵和铁勺均需经过2 0 0 0 c 高温哄烤8 h 以上， 枪头和离心管等塑料制品用0 1 d e p c 溶液浸泡过夜后高压灭菌3 0 m i n 3 2 4 2 海洋红酵母总r n a 提取的方法和步骤 1 从一7 0 冰箱中取出收集好的菌体，先加入5 0 0 u 1 r n a 提取缓冲液，快速溶解 菌体，然后置于研钵中在液氮下研成粉末。 2 将粉末转移至1 0 m 1 的离心管中，加入5 m 1 的r n a 提取缓冲液，混匀。 3 随后加入5 m 1 的p c i ( 苯酚：氯仿：异戊醇= 2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分混匀，冰浴1 5 m i n 每隔5 m i n 混匀一次。 4 1 2 0 0 0 r p m ，4 0 c 离心l o m i n ，取上清于另一离心管中，加等体积的p c l ，重抽一 次。 5 将上清转移至另一离心管中，加入1 1 0 体积预冷的3 mn a a c ( p h 5 2 ) ，等体 积预冷的异丙醇，一2 0 0 c 放置3 0m i n 6 1 2 0 0 0 r p m ，4 0 c ，离心l o m i n ，除去上清，加入1 5 m l 无r n a s e 水，溶解沉淀， 再加入等体积的4 ml i c l 溶液，冰浴l h 7 1 2 0 0 0 r p m ，4 0 c 离心1 0 m i n ，收集沉淀，然后沉淀用7 5 的乙醇洗涤2 次，放于 真空干燥机中哄干沉淀，溶于3 0 0 u 1 的无r n a s e 水中。 4 3r n a 的质量检浈i j 4 3 1 普通琼脂糖凝胶电泳分析 取1 u l r n a 进行1 的普通琼脂糖凝胶电泳，电压为5 v c m 。 4 3 2 紫外分光光度计分析 取1 u l 的r n a 用1 d e p c 处理过的水稀释至1 0 0 u l 后，进行紫外分光光度计检测。 4 4 结果与分析 4 4 1r n a 完整性分析 利用普通的1 琼脂糖凝胶电泳对本方法提取的r n a 进行分析，结果表明，海洋 红酵母总r n a 2 6 s ，1 8 sr r n a 条带完整清晰，没有明显降解的痕迹，而且条带很亮，具 有较好的完整性。如图1 1 所示： 图1 l 用1 的琼脂耱凝胶检测总r n a 的质量( 1 样品1 2 样品2 ) f i 9 1 la 1 l 甜y 蓟so f l a g 缸0 s ce l c c 仃o p h o r e s i s f o r t o t a l r n a ( 1s 锄p l e i ；2s 枷p l e 2 ) 4 42r n a 纯度检测及得率分析 利用自外分光光度计分析了总r n a 的o d 值( 表2 ) ，结果表明，利用本方法提 取的海洋红酵母总r n a 质量较高，平均每2 0 0 m l 菌液可获得4 0 0 u g 总r n a 。 表2 利用紫外分光光度计检测提取r m 的。d 值及得率 t a b i e3 a n a 州s o f q u a 】1 时o f 曲l r n a f f o m 】出x 5 讨论 5 1 海洋红酵母耐盐性分析 海洋红酵母是生长在海水中的一种真菌，与普通酵母相比，它具有在海水条件下 更适合生长的特性，但是通过本实验的培养研究表明：海洋红酵母更适合于在淡水条 件下生长，它在接种量、培养时间一样的条件下。淡水中生长的菌体量大约是盐水生 长的三倍。从这一结果表明，此海洋红酵母最初的生长环境并非是在海洋，而是在陆 地，由陆地的河流将其带到海洋，通过适者生存的淘汰机制和环境的改变，最终形成 了此种海洋红酵母。这也再次证明了人们认为的多数海洋中的酵母菌是陆地上的酵母 菌适应了海洋环境生存下来的种类。 5 2s s hc d n a 差减文库的构建 利用c l o n t e c h 公司生产的抑制差减杂交试剂盒( s s h 试剂盒) 构建了耐盐基因 差减文库，此方法具有操作简便、时间少、克隆率高等优点( v o ne ta 1 ，1 9 9 7 ) ，同 时该方法具有一次可以分离到几十至上百个差异表达基因，灵敏度高，富集率高，易 于在转录水平上研究生物受生物或非生物逆境胁迫后基因的差异表达，特别是对于低 丰度的差异表达基因的分离和克隆。 本实验利用此技术成功构建了海洋红酵母耐盐基因文库，一共获得了2 7 0 个阳性 克隆。通过挑取2 5 个克隆，然后进行测序，在n c b i 中进行b l a s t 序列比较，结果有 一个初步认为与耐盐相关，1 2 个与红酵母的r r n a 有较高的同源性，l o 个属于引物自 连，还有2 个在b l a s t 中比较时无任何序列线索。由此结果可以得出，可能有一些未 知耐盐相关基因与海洋红酵母的耐盐性有关，但从克隆所得到的r r n a 可以看出，在 m r n a 的纯化和消减杂交过程中，还有部分核r n a 没有除去。由于海洋红酵母的功能 基因报道的很少，在n c b i 中只有2 0 多个，所以本实验获得的两个基因片段很可能是 耐盐相关基因，具有很大的研究价值。 初步认为与耐盐基因相关的是可溶性甘油二脂酰基转移酶基因( d g t a 3 ) ，此基因 可使二酰甘油加上脂肪酸酰基辅酶a 以共价健结合形成三酰甘油，由于普通生物体也 含有该基因，所以此基因到底在耐盐条件下能够发挥什么样的作用，目前还尚未清楚， 需进行进一步的研究。从普通的酿酒酵母中寻找的耐盐基因现在已有很多的报道，例 如，g p d l ，e n a l ，h a l l 等基因，但是海洋红酵母与酿酒酵母在种属和生长环境上有 较大的差异，其耐盐基因可能存在较大的差异，本人通过对酿酒酵母的g p d l 基因进 行同源比较，然后多次设计引物，都未扩增出目的片段。从本实验获得的一个甘油二 脂酰基转移酶基因来看，其在n c b i 中进行b l a s t 比较的结果可以看出，只有一种红 酵母与其同源，而普通酵母的甘油二脂酰基转移酶基因却一个也没有。由此可知，本 实验所获得的三个基因片段，虽然不是已经报道的普通酵母的耐盐基因，但是很可能 是与海洋红酵母耐盐性相关的表达基因。 5 3 海洋红酵母总r n a 提取方法的改良 海洋红酵母是一种细胞壁很厚的单细胞生物，且离心后的菌液比较粘稠，其细胞 表面分泌很多的r n a 降解酶，极其不利于r n a 的提取。本实验通过参照傅荣昭等( 1 9 9 4 ) 实验方法的基础上，建立了一种快速的海洋红酵母总r n a 的提取方法。此方法与目前 使用的蜗牛酶法和玻璃珠法相比，具有高效、快速、质量好、不易降解、产量高等优 点。本实验与傅荣昭的方法不同之处在于傅荣昭的方法是用于水稻r n a 的提取，本实 验是用于海洋红酵母的r n a 的提取，在实验的操作步骤中，由于考虑到海洋红酵母是 一种比较粘稠的菌体，且r n a 降解酶比较多，所以在取出材料后，用5 0 0 u l r n a 提取 缓冲液将菌体打均，然后吸到研钵中，迅速到入少量液氮进行冷凝，然后用研钵棒将 其打碎，再倒入液氮将其充分研磨，此步骤既解决了菌体难于放入研钵中，又防止了 r n a 的降解。在后续的抽提过程中，省略了加入半光胺酸或b 一巯基乙醇，而在抽提 预冷时采用每5 分钟充分混匀一次，使其抽提充分，减少蛋白、d n a 的污染。这样既 减少了b 一巯基乙醇给人们身体带来的伤害，又提高了r n a 的提取质量和效率。 此方法与蜗牛酶法和玻璃珠法相比，不仅提高了产量和工作效率，而且还一定程 度的保护了人们的身体健康，用蜗牛酶的方法来提取r n a ，在降解细胞壁的过程中， 不能充分的降解，而且对r n a 有一定的破坏性，提取时间过长，而且用蜗牛酶法和玻 璃珠法提取的r n a 量明显少于本实验方法的提取量，所以本实验方法具有较强的实用 性和可靠性。 6 结论 1 利用s s h 方法成功构建了海洋红酵母耐盐c d n a 差减文库，一共得到了2 7 0 个差异 表达的阳性克隆。 2 通过海洋红酵母在盐水条件下的培养，证明海洋红酵母更适合于在淡水条件下生 长，其增长速度为盐水条件下的3 倍左右 3 通过挑取2 5 个克隆，得到了一个功能基因，两个未知功能序列，1 2 个核r n a 序列， 1 0 个无效序列。 4 建立了一种高效快速提取海洋红酵母总r n a 的方法。通过o d 值的检测，证明该方 法提取的r n a 质量较好、用时少、得率高、方便，能够完全满足分子生物学的实 验要求。 3 7 参考文献 1 张超，刘军s c p 生产菌海洋红酵母摇瓶培养研究 j 四川轻化工学院学 报，2 0 0 0 ，1 3 ( 3 ) ：7 卜7 4 2 】 t a k a l l i k on a g a h a m a ，m a k i k oh 锄锄o t o ，t a k a s l l in a l ( a l s e 砒l o d o t o l l l l ab e n t h j c a s p n o v a r l dr h o d o t o r u l ac a l y p t o g e n a es p m o v ，n o v e ly e a s ts p e c i e s 盘o m 赳l i i l l a l s c o l l e c t e df 硒mt h ed e e p s e af l o o r ，a l l dr h o d o t o m l a1 y s i n i p h i l as p n o v ，w 1 1 i c hi sr e l a t e d p h y l o g e n e t i c a l l y i n t e m a t i o n a l j o u m a lo fs y s t e m a t i ca i l d e v o l u t i o n a 巧 m i c r 0 - b i o l o g y ，2 0 0 3 ，( 5 3 ) ：8 9 7 9 0 3 3 赵述淼，韩继宏谈酵母在水产养殖上的应用 j 中国水产，2 0 0 3 ，( 7 ) ：6 8 6 9 4 熊坂清弘海洋酵母和e p a 、d h a 强化饲料 j 国外畜牧学，1 9 9 5 ，( 4 ) ：1 7 1 9 5 李红，张坤生红酵母发酵生产b 一胡萝卜素 j 食品研究与开 发，2 0 0 4 ，2 5 ( 3 ) ：5 8 6 0 6 卫军，陈春涛，章银良，等红酵母类胡萝卜素发酵研究 j 郑州轻工业学院学报 ( 自然科学版) ，2 0 0 0 ，1 5 ( 2 ) ：3 7 7 王岁楼红酵母类胡萝卜素高产菌株的筛选及其发酵生理学条件研究 j 工业 微生物，2 0 0 1 ，3 1 ( 1 ) ：1 9 2 2 8 王菊芳，梁世中红发夫酵母生产虾青素进展 j 生物工程进展，2 0 0 0 ，2 0 ( 5 ) ： 4 8 4 9 9 梁新乐，张虹，励建荣法夫酵母高密度培养及虾青素的高产研究 j 菌物系 统，2 0 0 1 ，2 0 ( 4 ) ：5 0 8 5 1 4 1 0 童应凯，韦东胜，刘婷，王玉海洋红酵母培养条件的研究 j 。食品研究与开 发，2 0 0 6 2 7 ( 8 ) ：7 5 7 9 1l 】杨秋明，蔡慧农，宋思扬，苏文金海洋红酵母产虾青素培养基优化的初步研究 微生物学杂志，2 0 0 7 ，2 7 ( 1 ) ：7 2 7 5 1 2 王业勤，李勤生天然类胡萝卜素一研究进展，生产，应用 m 北京：中国医药科 技出版社，1 9 9 7 【13 】k i 啪s h i g e ，m i n m b i t i o no fo x i d a t i v ei i l j u 巧o f b i o l o g i c a lm e m b r a n e sb ya s t a x a 训f l i n 阴p h y s i 0 1 c h e m p h y s m e d 峨1 9 9 0 ，2 2 ：2 7 3 8 【1 4 】 m a i t i ng u e 血l ，m a r ke h u l l t l e ya i l dm i g u e lo l a i z o l a h a e ma t o c o c c u sa s 觚a n t l l j n ： a p p l i c a t i o nf o rl m m a nh e a j t l l 龇l dn u t r i t i o n 【j 】t 】陋n d si i lb i o - t e c h n o i o g y ，2 0 0 3 ， 3 8 2 l ( 5 ) ：2 l o 2 1 6 【l5 】s h i i l l i d z u ，n c a r o t e n o i d sa ss i n g l e t so x y g e nq u e n c h e r si i lm a r i n e0 r g a i l i s m s 【j 】f i 妣 s c i 1 9 9 6 ，6 2 ：1 3 4 1 3 7 【16 】p a l a g y iz ，f e r e n c z ) rl a n dv a g v l o g y ic 。c a r b o ns o u r c e 硒s 洫i l a t i o np a 位e mo ft h e 嬲t a x 锄t h i n p r o d u c i n gy e a s tp h a 佑ar h o d o z y r m 阴w o r l dj o 哪a lo fm i c r o b i o l o g y a 1 1 db i o t e c l u l o l o g ) ，2 0 01 ，l7 ：9 5 9 7 1 7 李浩明，高蓝虾青素的结构功能及应用 j 精细化工，2 0 0 3 ，2 0 ( 1 ) ：3 2 3 8 【18 】j y o n o u c l l ih ，s m ls ，e ta 1 e 脏c t so fv 撕o u sc a r o t e n o i d so nc l o n e d ，e 虢c t 0 卜 曲唱e t - h e l p e r c e l l a c t i v i t ) r j 】n u t r c a l l c e r ，1 9 9 6 ，2 6 ( 3 ) ：313 3 2 4 【19 】 t 觚a l ( at ，m o r i s i l i t ay ，e ta 1 c h e m o p r e v e m i o no fm o u s eu r i n a r yb l a u d d e rb yt h e n a m r a l l yo c c u r r i n gc a r o t e n o i d2 u s t a x a n m i n 【j 】c a r c i n o g e n e s i s ，1 9 9 4 ，1 5 ( 1 ) ：1 5 1 9 【2 0 】 t s om o ，l 锄t t m e t h o do fr e t 棚i n ga 1 1 da m e l i o r a t i n g c e n t r a ln e o u ss y s t e m 觚d e y ed 锄a g e 【p 】u s p a t e n tn o 5 5 2 7 5 3 3 ，u n i t e ds t a t e so fa m e r i c a ，19 9 6 2 1 兰国宝两种海洋酵母生长繁殖与盐度关系的初步研究。 j 海洋科学，1 9 9 0 【2 2 】王兰，肖冬光，张正酶d n s 一比色法测定酵母海藻糖的研究 j 工业微生物， 2 0 0 2 ，( 6 ) ：1 8 - 2 2 2 3 程书梅，王昌禄等海藻糖对耐盐酵母的影响 j 中国酿造， 2 0 0 5 ，1 9 4 ( 8 ) ：8 1 0 【2 4 】 p r 0 rm ，s e m m or r e p r c s s o r sa n du p s 骶锄r 印r e s s i n g s e q u e n e eo f l e s 骶s s r e g u l a t e de n a ig e n ei ns a c c i l a r o m y c e sc e r e v i s i a e ：b z i pp r o t i o ms k o l p e o n f e r sh o g d e p e n d e n to s m o t i cr e g u l a t i o n m o l e c u l a ra r l dc e l l u l a rb i o l o g y ， 1 9 9 9 ：1 9 ( 1 ) ：5 3 7 - 5 4 6 【2 5 】m a r q u e zj a ，p a s c u a l a h u i ra ，p r 0 rm ，s e 仃i m or 1 1 1 es s n 6 一t u p lr e p r e s s o r c o m p l e xo fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i i si n v o l v e di nt h eo s m o t i ci n d u c t i o no f h o g - d e p e n d e n ta n d - i n d e p e n d e n tg e n e s e m b o ， 1 9 9 8 ；( 9 ) ：2 5 4 3 2 5 5 3 【2 6 】 s e r 锄m 0r ，m u l e tj m ，黜o sg ，m 咖u e zj a ，e ta 1 ag l i m p s eo f 也em e c h 枷s m so f i o nh o m c o s t a s i sd u r i n gs a hs 仃e s s e x p e 血l e n t a lb o t a n y ， 19 9 9 ；5 0 ( s p e c i a li 豁u e ) ： 1 0 2 3 1 0 3 6 2 7 】 1 w a l ( it ，h n a iy ，w a t a l l a b ey t 、0p u t a t i v em a p 虹n a s eg e n e s ：z r h o g l 觚d z r h o g 2c l o n e d 自o m 也es a l t - t o l e r a i l t y e a s tz y g o s a c c k m y c e sr o u x i i a r e 胁c t i o r 谢l yh o m o l o g o u s t 0 t l ：呛 s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eh o g l g e n e m i c r o b i o l o g y ，1 9 9 9 ：1 4 5 ：2 4 1 2 4 8 3 9 【2 8 】 m a m e o sd p ，k 沁s b l l r yt j ，a h s 锄u s ，c m “n 曲锄k w t c n l p c r z l p ，a c a l c i n e l l r i n d 印朗d e n t 衄l s c r i p t i o n f 如t o rt h a td i f - f e r e n t i a l l yr e g u l a t e sg e n e e x p r e s s i o n 遗s a c c h r o m y c e sc e r e v i a e g e n e sa n dd “e l o p m e n t ， 1 9 9 7 ；ll ：3 4 4 5 3 4 5 8 【2 9 】 h i r s e l l ik v a c u o l a rh + c a 2 + t m s p o r t ：w h 0 sd i r e c t i n gt h et r a 伍c ? 阴t r e r l di np a n t s c i e n c e ，2 0 0 1 ；6 ( 3 ) ：1 0 0 1 0 4 【3 0 】 c r e s p oj l ，d a i e h ok ，u s h i a m n lt ，h a l lm n t h eg a t a 仃a n s c r i p t i o nf l a c t o rg l n 3 a l l dg a t li i i l 王【t o rt os a l ts 骶s si ns a c c h a r o n l y c e sc e r e v i s i a e b i o lc h e m ， 2 0 0 1 ：2 7 6 ( 3 7 ) ：3 4 4 4 1 - 3 4 4 4 4 【31 】 m i l l e tj m ，l e u b em p ，k r o ns j ，r i o sg ，f i n kg r ，s e r r a i l 0r an o v e lm e c h a m s m o fi o nh o m e o s t a s i sa n ds a l tt o l e 啪c ei ny e a s t ：t h eh a l 4a i l dh a l l 5p r o t e i nk i n a s e s m o d u l a t em et r k l - 1 r k 2p o t a s s i u mt r a n s p