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幽门螺杆菌感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究中文- 要 幽门螺杆菌感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究 博士研究生：李国庆 导师：陈曼湖教授 摘要 第一部分环氧合酶在幽门螺杆菌相关性慢性胃炎中作用的 动物实验研究 研究背景和目的 幽门螺杆菌( h e f i c o b a c t e r p y l o r i ，h p ) 是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的 重要病因，并与胃腺癌和胃粘膜相关淋巴组织( m a l t ) 淋巴瘤的发病密切相 关。环氧合酶( c o x ) 是合成前列腺素( p g s ) 的关键限速酶，也是非甾体抗 炎药( n s a i d s ) 的作用靶。它至少有2 种亚型，即c o x 1 ( 组织型酶) 和c o x 一2 ( 诱导型酶) 。h 口感染可诱导人和其它哺乳动物胃上皮细胞c o x 2 的表达， 但c o x 一2 高表达的具体作用尚不清楚；c o x 在h p 相关性胃炎中作用的研究 结果也很不一致。 正常胃粘膜的结构和功能依赖于粘膜上皮细胞凋亡和增殖之问的动态平 衡。这种动态平衡的改变可导致溃疡的形成和肿瘤的发生。h p 感染可诱导胃 粘膜上皮细胞的凋亡和增殖：根除h p 感染后，异常的凋亡和增殖可恢复正常。 n s a i d s 能促进细胞的凋亡，并具有抗肿瘤的作用，且这种作用可能是n s a i d s 对c o x 一2 的抑制所致。但c o x 2 在h p 感染对胃上皮细胞动力学影响中的具 体作用尚不清楚。 h p 感染导致t h l 型免疫应答，表现为i f n 吖和i l 1 2 等细胞因子生成增 加；h p 感染也可增加促炎因子t n f b 的生成。这些细胞因子生成的增加在促 使胃粘膜炎症的形成中发挥重要作用。c o x 一1 和c o x 一2 均可促进p g e 2 的生 成：p g e 2 通过抑制h p 感染所致的t n f 表达，而减轻胃粘膜的炎症反应和 维护粘膜正常的结构和功能。p o s 在维持胃粘膜正常的结构和功能中发挥重要 作用。然而，在冒粘膜中c o x 1 和c o x 一2 对p o s 生成和生物活性的具体作用 还有待进一步阐明。此外，h p 感染时，c o x 1 或c o x 一2 基因敲除是否会影响 幽门螺杆菌感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究中文奠要 白三烯( l t s ) 的生成还有待进一步研究。 目前，探讨c o x 在胃粘膜炎症中的作用主要是通过对n s a i d s 的研究实 现的。因此。本研究利用h p 感染的野生型和c o x 基因敲除小鼠模型，在h p 诱导馒注胃炎过程中c o x - i 和c o x 2 对雷粘膜的炎症程度、胃上皮细胞豹凋 亡和增殖、细胞因予的表达以及p g e 2 、l t b 4 和l t c 。生成等方面的作用进行 了较为系统的探索。 材料和方法 一幽门螺杆菌感染环氧合酶基因敲除小鼠模型的建立及评价 1 实验动物及其基因鉴定 本研究所采用的c o x 基因敲除小鼠是c o x 1 基因敲除小鼠的杂合子 ( c o x 1 + ) 、纯合子( c 0 x 1 一) 和c o x 2 基因敲除小鼠的杂合子 ( c o x 2 + ) 、纯合子( c o x 2 ) 以及相同种属的野生型( w t ) 小鼠。通 过提取尾组织d n a ，用p c r 方法进行基因表型的鉴定。 2 实验动物分组及处理 经鉴定后的小鼠随机分为h p 感染的w t 组、c o x 一1 + 一组、c o x 一1 一- 组、 c o x 2 + 一组和c o x 2 - 组以及相应的对照组。用h pt n 2 菌株灌胃动物；对照 组给予相同量的布氏肉汤。在h p 接种2 4 周后处死动物，取胃组织进行各指标的 检测。 3 定量细菌培养 鼠胃称重后匀浆。匀浆液经l o 和1 0 0 倍稀释后，分别取1 0 0r t l 接种于改 良s k i r r o w 选择性琼脂平板上，于3 7 。c 微需氧条件下培养5 7 天，计数h p 菌落数。h p 定植密度( c f u s g 组织) = h p 菌落数x 稀释度，胃重量。 4 胃组织c o x 蛋白表达的检测( 免疫印迹法) 小鼠臀组织经匀浆后离心。取上清，测定其蛋白浓度。将含蛋白5 0 岭的 每个样品进行s d s p a g e 电泳。分离凝胶，用转移缓冲液浸泡后，与p v d f 膜 对齐、贴紧，在电转移仪中9 2m a 电转3h r 。取出硝酸纤维素膜，用含5 脱 脂牛奶的t b s t 室温下封闭1h r 后，加入一抗( 1 ：1 0 0 ) 室温下孵育lh r 。经 t b s t 洗涤后，再加二抗( 1 ：3 0 0 0 ) ，室温下孵育1h r ，膜再经t b s t 洗涤后， 幽门螺扦菌感染的致病机制及葵免疫防治的动物实验研究中文麓翼 用e c l 化学发光检测系统检测。 5 组织学检查 将胃组织以1 0 的中性福尔马林固定及石蜡包埋后切片，做常规h & e 和改 良g i e m s a 染色。按新悉尼系统标准中的淋巴细胞和粒单细胞的浸润程度对胃炎 做分级评分。通过改i 皂g i e m s a 染色观察h p 的定植情况。 二环氧合酶基因敲除对幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞凋亡和增殖 及炎症介质生成的影响 1 胃牯膜上皮细胞凋亡和增殖的检测 根据试剂盒的说明，用原位末端转移酶标记( t u n e l ) 法检测胃上皮细胞 的凋亡。用免疫组织化学法检测k i 6 7 的表达来观察胃上皮细胞的增殖情况。 2 胃组织细胞因子的半定量r t - p c r 检测 提取胃粘膜组织总k n a ，然后将r n a 反转录成c d n a 。取2g lc d n a 进 行p c r 扩增。p c r 产物进行琼脂糖凝胶电泳，并拍照和分析结果。采用d - a c t i n 作为半定量内参照，计算各细胞因子m r n a 的相对表达水平。 3 胃粘膜组织p g e 2 、l t b 4 和l t c 4 水平的e l i s a 检测 胃组织经称重后，放入组织裂解液中进行匀浆，将匀浆液在冰浴下进行超 声粉碎，再低温离心，留上清，根据试剂盒的要求进行操作。 结果 一幽门螺杆菌感染环氧合酶基因敲除小鼠模型的建立及评价 1 定量细菌培养结果 h p 感染的各c o x 基因敲除组和w t 组小鼠胃粘膜h p 的定植水平无明显 差别( p 00 5 ) ：各对照组均未发现h p 的定植。 2 胃组织c o x 蛋白的表达 在w t 小鼠的胃组织中可见c o x 1 蛋白表达，但h p 感染对其表达无明显 影响，且c o x 1 小鼠未见c o x 1 蛋白的表达：c o x 一1 一，一小鼠和w t 小鼠均 可见c o x 2 蛋白表达，且h p 感染不同程度侵c o x 2 蛋白表达增高；h p 感染 组和对照组的w t 及c o x 2 小鼠的胃组织中均可见c o x l 的表达，且各组 蛋白的表达量无显著差别；在w t 小鼠中，其h p 感染组胃组织的c o x 一2 蛋白 n i t - 螺杆菌感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究中文囊耍 表达明显增加，且对照组可见少量c o x 虽白表达，但c o x - 2 小鼠的胃组织 中末见c o x 一2 的表达：在h p 感染组和对照组的c o x 1 和c o x 2 小鼠中， 其胃组织中的蛋白表达均未见代偿现象，即c o x 1 基因敲除小鼠未见c o x 2 蛋白表达明显增高，反之亦然。 3 组织学分析结果 与对照组相比，各h p 感染组的中性粒细胞浸润记分明显增高( p 0 0 5 ) 。 各对照组的中性粒细胞浸润记分无明显差别；与h p 感染的w t 小鼠相比。h p 感染的c o x 1 组、c o x 2 + 组和c o x 2 组的中性粒细胞浸润记分均明显 增高( p o0 5 ) 。c o x - 1 + 感染组与w t 感染组的小鼠相比，中性粒细胞浸润 记分也增高，但无显著差异( p = 0 1 3 4 ) 。单核细胞浸润记分的结果与前者相似。 二环氧合酶基因敲除对幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞凋亡和增殖 及炎症介质生成的影响 1 胃上皮细胞凋亡和增殖结果 h d 感染使w t 和c o x 基因敲除小鼠胃上皮细胞的凋亡指数( a i ) 均明显 增加( p 00 t ) ；与w t 和c o x 1 基因敲除小鼠相比，c o x 2 基因敲除小鼠 对照组和感染组的a i 均有所增加，但无统计学差异。 h p 感染使w t 和c o x l 基因敲除小鼠胃上皮细胞的增殖指数( p i ) 明显 增加( p o0 1 ) ，但对c o x 2 基因敲除小鼠无明显影响；与h p 感染组的w t 和c o x 1 基因敲除小鼠相比，c o x 2 基因敲除小鼠的h p 感染组和对照组的 p i 均明显降低( p 00 5 ) ；各h p 感染组和对照组之间两两分别相比，i l 一4 和i l 一1 0 i v 幽门螺杆菌感染的致病机制及奠免疫防治的动物实验研究中文要 m r n a 的表达均无显著差异( p 0 0 5 ) 。 3 胃组织p g e 2 、l t b 和l t c 4 的表达 在h p 感染组和对照组的c o x 1 一小鼠的胃组织中，p g e 2 的水平均很低， 且二者之间差异无显著性；与h p 感染组和对照组的c o x 一2 + 、c o x 一2 - 和 w t 小鼠相比，c o x l 一小鼠的胃组织中p g e 2 的水平明显减少( p o 0 0 1 ) ； c o x 2 + 一、c o x 2 一和w t 小鼠的h p 感染组和对照组两两之间分别相比，差 异均无显著性；在h p 感染组私对照组的c o x - l + 小鼠的胃组织中，p g e 2 的 水平均较低，且= 者之间差异无显著性：与h p 感染组和对照组的c o x 2 + 、 c o x 2 和w t 小鼠相比。c o x 1 + 小鼠的胃组织中p g e 2 的水平明显减少( p o 0 1 ) ：h p 感染使w t 、c o x 2 + ，彳口c o x 2 - 小鼠胃组织中p g e 2 水平均明 显增加( p 00 5 ) ，与对照组相比分别增加1 6 倍、1 3 倍和l4 倍。 h d 感染使w t 和c o x 基因敲除小鼠胃组织的l t b t 和l t c 4 水平均明显 增加( p o 0 5 ) ；与w t 感染组相比，c o x 基因敲除小鼠胃组织的l t b 4 和l t c 4 水平来进一步增加。 结论 1 c o x 1 和c o x 2 基因敲除对h p 在小鼠胃粘膜的定植水平无明显影响。 2 c o x 1 和c o x 2 基因敲除都加重了小鼠h p 相关性胃炎炎症的程度，这种 作用可能主要是通过上调促炎细胞因子i f n 吖、i l 1 2 和t n f n 的表达实现 的。 3 c o x 一2 基因敲除可使h p 感染所致的小鼠胃上皮细胞的增殖减少，而对凋 亡无明显影响，表明c o x 2 基因敲除提高了h p 感染引起的凋亡与增殖之 间的比率，这种作用可能在减少h p 诱导冒癌的形成中起一定的作用。 4 无论有无h p 感染，c o x 1 基因敲除使小鼠胃粘膜p g e 2 生成明显减少，且 在无h p 感染时未引起明显的胃粘膜病变，提示在无损害因素的前提下， 单一的缺少p g e 2 不会对胃粘膜的正常结构造成损害。 5 h p 感染使野生型和c o x 基因敲除小鼠胃组织l t b 4 和l t c a 的生成都明显 增加，但在后者未见进一步增加，表明l t b 4 和l t c 4 虽参与了h p 相关性 胃炎的形成，但与c o x 基因敲除小鼠胃炎的加重无关。 一v 一 刿 螺堑堕感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究中文囊要 【关键词】 幽门螺杆菌，环氧合酶，基因敲除，凋亡，细胞增殖，细胞因子 第2 部分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染防治的 动物实验研究 研究背景和目的 幽门螺杆菌的致病是个复杂的多步骤多因素过程。h p 诱导的特异性抗体和 细胞免疫不能有效地清除细菌，反而可导致胃粘膜免疫病理损害。有效的预防 和治疗h p 感染的方法将有可能大幅度降低上述消化道疾病的发病率。目前常 用的联合化学药物治疗虽然有高达9 0 的h p 根除率，但有一定的副反应、价 格昂贵、抗生素耐药率逐年增高及病人的依从性差等缺点。采用人体可很好耐 受、效高价廉的h p 疫苗预防和治疗h p 感染是一个较为理想的方法，具有很好 的社会和经济效益。 目前认为，由于h p 抗原单组分疫苗只能降低h p 在宿主胃粘膜的定植水 平，预测未来的h p 疫苗是多个抗原组分组成的疫苗。因此。本研究以h p 感 染的小鼠模型研究多组分重组减毒沙门疫苗菌对h p 感染的免疫保护作用：本 研究还观察了重组减毒沙门疫苗菌对h p 感染的治疗作用。 方法 1 重组减毒沙门疫苗菌的免疫和治疗 免疫方法：将i i 级c 5 7 b l 6 小鼠随机分生理盐水组、p b s 组、减毒鼠伤 寒沙门菌s l 3 2 6 1 组、重组减毒鼠伤寒沙门菌p t r c 9 9 a u r e b + p g s t a g - k a t a 组、 重组减毒鼠伤寒沙门菌p t r c 9 9 a - u r e b + p t r c 9 9 a - h p a a 组及重组减毒鼠伤寒沙 门菌p t r c 9 9 a u r e b + p g s t a g k a t a + p t r e 9 9 a - h p a a 组，共6 组，每组1 0 1 2 只。通过灌胃方法进行口服免疫。免疫4 周后，再通过灌胃方法每只小鼠( 生 理盐水组除外) 均用活力良好的h p 菌株攻击2 次( 1 1 0 7 c f u 只) ，每日1 次。 再4 周后处死所有小鼠。治疗方法：将i i 级c 5 7 b l 6 小鼠随机分为重组减毒 沙门菌尿素酶b 亚单位疫苗组、过氧化氢酶疫苗组和生理盐水组3 组，每组 l o 只。通过灌胃方法每只小鼠均用活力良好的h p 菌株攻击2 次( 1 x 1 07 c f u v i 些门爨圩堕壁鎏的致病机制及其免瘦防治的动物实验研究中文纂蔓 只) ，隔目1 次。在攻击后的4 周，相应组分别给予予重组减毒沙门菌尿素酶 b 亚单位疫苗( 1 1 0 7 c f u 只) 、重组减毒沙门菌过氧化氢酶疫苗( 1 1 0 7 c f u 只) 灌冒治疗及生理盐水灌霹( 对照组) 。治疗后4 周处死所有小鼠。 2 鼠胃幽门螺杆菌检查 小鼠经处死后，取出胃纵行切为两半。其中一半作定量细菌培养；另一半 再纵行一分为二，一半用于抉遮尿素酶试验，另一半用中性福尔马林固定，用 石蜡包埋后切片行改良g i e m s a 染色和h & e 染色，分别用于观察h p 定植和粘 膜炎症情况。 3 定量培养细落 将一半鼠胃称重后匀浆，再将匀浆作1 ：1 0 、1 ：1 0 0 、1 ：1 0 0 0 系列倍比 稀释，取每一稀释度匀浆1 0 0 l 接种于改良s k i r r o w 选择性琼脂平板上，于3 7 微需氧条件下培养3 天，计数h p 菌落数。 4 抗原特异性淋巴细胞增殖反应的测定 处死小鼠后，取脾制备细胞悬液。调整细胞浓度，并按四甲基偶氮唑盐 ( m t t ) 法完成相关步骤。增殖指数= 实验组o d 凭对照组o d 值。 结果 1 多组分重组减毒沙门疫苗菌对h p 感染的免疫保护作用 生理盐水组、p b s 组、s l 3 2 6 1 组、p t r c 9 9 a u r e b 十p g s t a g k a t a 组、 p t r c 9 9 a u r e b+ p t r c 9 9 a h p a a 组及p t r c 9 9 a u r e b+ p g s t a g k a t a 十 p t r c 9 9 a h p a a 组胃粘膜h p 的定植密度分别为：0 、94 9 1 0 6 c f u g 、l4 2 1 0 6 c f u g 、29 2 1 0 5 c f u g 、55 1 1 0 5 c f u g 及2 1 6 1 0 5 c f u g 。与对照缉 ( p b s 组) 相比，各免疫组h p 的定植密度均明显降低。各对照组和免疫组小 鼠的胃粘膜均未见明显的炎症反应。各免疫组的淋巴细胞增殖反应阳性。 2 重组减毒沙门疫苗菌对珏p 感染的治疗作用 p t r c 9 9 a u r e b 组、p g s t a g k a t a 组及生理盐水组胃粘膜h p 的定植密度分 别为：l5 8 1 0 5c f u g 、48 8 1 0 5c f u g 及19 2 1 0 6c f u g 。治疗组与生理 盐水对照组相比，h p 的定植密度均明显降低。对照缀和治疗组小鼠的罾粘膜 均未见明显的炎症反应。治疗组的淋巴细胞增殖反应阳性。 一v i i 幽门螺杆菌感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究中文麓妻 结论 1 口服表达h p u r e b 、k a t a 和h p a a 的多组分重组减毒沙门疫苗菌对小鼠h p 感染具有一定免疫保护作用，但不能完全预防感染，需进一步筛选更为有 效的抗原，构建更为合理的多组分重组减毒沙门疫苗菌。 2 口服表达h p u r e b 和k a t a 的重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株对h p 感染的小 鼠均有较好治疗作用，可明显减少其胃内h p 的定植水平。 【关键词】 幽门螺杆菌，疫苗，尿素酶，过氧化氢酶，粘附素，减毒鼠伤寒沙门菌 v i i i 幽门螺杆菌感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究英文t t 要 s t u d i e so n p a t h o g e n e s i s o fa n dv a c c i n a t i o n a g a i n s t h e l i c o b a c t e r 础l o “i n f e c t i o ni nm i c e m a j o r ：m e d i c i n e p h dc a n d i d a t e ：l ig u o q i n g s u p e r v i s o r ：p r o f c h e nm i n h u a b s t r a c t p a r t1 e f f e c t so f c y c l o o x y g e n a s e o n h e l i c o b a c t e r p y l o r i - i n d u c e d g a s t r i t i si nc y c l o o x y g e n a s e d e f i c i e n tm i c e b a c k g r o u n d a n da i m s h e 打c o b a c w rp r i o r i “fp y l o r i ) i st h em o s tc o m m o nc a u s eo fc h r o n i cg a s t r i t i s a n dp e p t i cu l c e r a t i o n ，a n di sa ne a r l yr i s kf a c t o rf o rg a s t r i cc a n c e rc y c l o o x y g e n a s e ( c o x ) i s t h e r a t e l i m i t i n ge n z y m e i nt h e p r o d u c t i o n o f p r o s t a n o i d s f r o m a r a c h i d o n i ca c i d ，a n di ti sa l s ot h e p h a r m a c o l o g i c a lt a r g e t o fn o n s t e r i o d a l a n t i - i n f l a m m a t o r yd r u g sf n s a i d s ) t h e r ea r e t w oi s o f o r m so fc o x ；c o x 1i s c o n s t i t u t i v ef o r ma n dc o x 一2i st h ei n d u c i b l ef o r m a 1 t h o u g hc o x 一2i si n d u c e di n t h eh u m a na n dr o d e n tg a s t r i ce p i t h e l i u mb yh p y l o r ii n f e c t i o n i t sd e t a i l e dr o l e s h a v en o tb e e ne l u c i d a t e ds t u d i e so fh p y l o r i - i n d u c e dg a s t r i t i s h a v e y i e l d e d c o n f l i c t i n gr e s u l t sr e l a t e dt ot h ep o t e n t i a le f f e c t so f c o x e x p r e s s i o n d y n a m i c b a l a n c eb e t w e e ne p i t h e l i a lc e l l p r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i si s e s s e n t i a l f o rm a i n t a i n i n gn o r m a lg a s t r i cm u c o s a li n t e g r i t y a l t e r a t i o no ft h eb a l a n c ec o u l d r e s u l ti nu l c e r o g e n e s i so rc a r c i n o g e n e s i so ft h es t o m a c h h p y l o r ii s a s s o c i a t e d w i t hb o t hi n c r e a s e da p o p t o s i sa n dp r o l i f e r a t i o no f g a s t r i ce p i t h e l i a lc e l l s ，a n dt h e i n c r e a s e dn u m b e ro fa p o p t o t i ca n dp r o l i f e r a t i v ec e l l sr e t u r n t on o r m a la f t e r e r a d i c a t i o no fh p y l o r i i n f e c t i o ni ti sw e l lk n o w nt h a tn s a i d si n d u c ee e l l a p o p t o s i sa n dh a v ea n t i n e o p l a s t i ce f f e c t s ，w h i c ha r et h o u g h tt ob ed u et oi n h i b i t i o n o fc o x - 2h o w e v e r ，t h ee x a c tr o l eo fc o x 一2i ng a s t r i ce p i t h e l i a lc e l lt u r n o v e ri n t h es e t t i n go f h p y l o r ii n f e c t i o ni su n c l e a r m a n y s t u d i e sh a v ei n d i c a t e dt h a th p y l o r i i n d u c e di m m u n er e s p o n s ei ss k e w e d t o w a r dat h lp h e n o t y p ei n d i c a t e db yp r e d o m i n a n c eo f an u m b e ro fc y t o k i n e ss u c h a s1 f n 吖，i l 1 2a n dt n f - 旺，w h i c hc o n t r i b u t et ot h ep e r s i s t e n c eo f i n f l a m m a t i o ni n i x 幽门螺杆菌感染的致病机制及其免疫防治的动物实验研究英文董要 a d d i t i o n ，p g e 2d e r i v e df r o me i t h e rc o x 一1o rc o x 2i si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o n o fg a s t r i cm u c o s a li n f l a m m a t i o n ，a n dc o n t r i b u t e st om a i n t e n a n c eo fm u c o s a l i n t e g r i t yd u r i n gh p y l o r ii n f e c t i o nv i ai n h i b i t i o no ft n f 吐e x p r e s s i o np g sp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nm a i n t e n a n c eo fg a s t r i cm u c o s a li n t e g r i t y h o w e v e r ，t h ee f f e c t so f c o x 1a n dc o x - 2i s o f o r m so nt h ep r o d u c t i o na n d b i o l o g i ca c t i v i t i e so fp g s i nt h e g a s t r o i n t e s t i n a l m u c o s aa r el e s sc l e a r a d d i t i o n a l l y ，i nt h es e t t i n g o fh p y l o r i i n f e c t i o n ，w h e t h e rd i s r u p t i o n o fc o x 1o rc o x 一2a f f e c t st h e p r o d u c t i o n o f i e u k o t r i e n e s ( l t s ) n e e d st ob e f u r t h e ri n v e s t i g a t e d s of a r ，m u c ho fo u rc u r r e n tk n o w l e d g ea b o u tt h ep h y s i o l o g i c a lr o l e so ft h e c o x si n g a s t r i c i n f l a m m a t i o nh a sb e e no b t a i n e df r o ms t u d i e sw i t hn s a i d s t h e r e f o r e ，t h ea i mo f t h i ss t u d yw a st od e t e r m i n et h er o l e so f c o x 一1a n dc o x 一2 i s o f o r m si nh p y l o r i i n d u c e di n f l a m m a t i o n ，a p o p t o s i s ，p r o l i f e r a t i o n ，c y t o k i n e e x p r e s s i o n ，t h el e v e l so fp g e 2 ，l t b 4 ，a n dl t c 4i nl o n g - t e r mhp y l o r ii n f e c t e d w i l d t y p ea n dc o x d e f i c i e n tm i c e m a t e r i a l sa n dm e t h o d s a n i m a l sa n dg e n o t y p i n g c o x 1 一d e f i c i e n t ( c o x 一1 + 一h e t e r o z y g o u s ，c o x - 1 - - h o m o z y g o u s ) ， c o x 一2 一d e f i c i e n t ( c o x 一2 + h e t e r o z y g o u s c o x 一2 一一h o m o z y g o u s ) m i c ew e r e u s e d i nt h es t u d y t h eg e n o t y p eo fe a c ha n i m a lw a sd e t e r m i n e db yt h ep o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o nf p c r ) m e t h o d d n af r o mt a i l sw a se x t r a c t e db yu s i n gt h ed n e a s yt i s s u e s k i ta c c o r d i n gt ot h em a n u f a c t u r e r sp r o t o c o l e x p e r i m e n t a ld e s i g n s i xw e e ko l dm i c ew e r eu s e df o rt h ee x p e r i m e n t sa nh p y l o r is t r a i nf t n 2 ) w a su s e di nt h es t u d ym i c ef a s t e do v e r n i g h tw e r ei n o c u l a t e dt h r e et i m e sb yg a v a g e w i t h3 0 0u lo fh p y l o r io r g a n i s m sw i t ho n e d a yi n t e r v a l a g e m a t c h e d c o n t r o l a n i m a l sw e r em o c k i n o c u l a t e dw i t h3 0 0u 1m e d i u m ( b r u c e l l ab r o t h ) a n i m a l sw e r e s a c r i f i c e d b y c e r v i c a l d i s l o c a t i o n ，a n d t h es t o m a c hw a sr e m o v e d f o re a c h e x a m i n a t i o n q u a n t i t a t i v ec u l t u r eo f h p y l o r i f o r q u a n t i t a t i v ea s s e s s m e n to f 且p y l o r ic o l o n i z a t i o n o n ep i e c eo fw e i g h e d s t o m a c ht i s s u ew a sh o m o g e n i z e d ，a n dt h eh o m o g e n a t e w a sd i l u t e d1 0 一a n d x 些旦堡堡重壁銎塑墼壅垫型星基叁壅堕塑塑塾塑塞堕塑塞薹塞篓墨 10 0 f o l di nb ，u c e l l ab r o t ho n e10 0u lo fe a c hd i l u t i o nw e r ep l a t e do i l s e l e c t i v e m e d i u m p l a t e sw e r ei n c u b a t e df o r5 7d a y s t h eh p y l o r ic o l o n i e sw e r ec o u n t e d t od e t e r m i n et h en u m b e ro fc o l o n y f o r m i n gu n i t s ( c f u s ) p e rg r a mo fs t o m a c h t i s s u e w e s t e r nb l o ta n a l y s i sf o rt h em e a s u r e m e n to f g a s t r i cc o xp r o t e i ne x p r e s s i o n f o ra n a l y s iso fg a s t r i cc o x p r o t e i ne x p r e s s i o n ，g a s t r i ct i s s u e so fm i c ew e r e h o m o g e n i z e d a n dl y s e di nb u f f e r t h el y s a t ew e r ei n c u b a t e da n d c e n t r i f u g e d a f t e r d e n a t u r a t i o n5 0 - a ga l i q u o t so fe x t r a c t e dp r o t e i n sw e r e e l e c t r o p h o r e s e do f fs o d i u m d o d e c y ls u l f a t e 一1 0 p o l y a c r y l a m i d eg e l s a n dt r a n s f e r r e dt oa p o l y v i n y l i d e n e f l u o r i d e ( p v d f ) m e m b r a n et h ep v d fm e m b r a n e sw e r eb l o c k e dw i t h5 n o n f a t m i l ki nt b s tf o r1h o u ra n dt h e ni n c u b a t e do v e r n i g h tw i t h1 ：10 0 一d i l u t e d g o a t a n t i c o x - 1a n da n t i - c o x - 2p o l y c l o n a li m m u n o g l o b u l i ni gg ，r e s p e c t i v e l yt h e m e m b r a n e sw e r et h e nw a s h e di nt b s tb e f o r e1h o u ri n c u b a t i o nw i t hd o n k e y a n t i g o a th o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e c o n j u g a t e ds e c o n d a r ya n t i b o d y t h em e m b r a n e s w e r ew a s h e di nt b s ta g a i na n dd e v e l o p e db yt h ee e l p l u sc h e m i l u m i n e s c e n c e d e t e c t i o ns y s t e ma n de x p o s e dt oh y p e r f i l m h i s t o l o g i c a le x a m i n a t i o n g a s t r i cs p e c i m e n sw e r ee m b e d d e di np a r a f f i na n dc u ti n t os e c t i o n s4 - a mt h i c k t h es e c t i o n sw e r es t a i n e dw i t h h e m a t o x y l i n e o s i n ( h & e ) a n dg i e m s a ，a n d e x a m i n e df o rs e m i q u a n t i t a t i v ee s t i m a t e s ，a c t i v i t y ( i n f i l t r a t i o no fn e u t r o p h i ls c o r e ) a n ds e v e r i t y ( i n f i l t r a t i o no fm o n o n u c l e a rc e l ls c o r e ) o fc h r o n i ci n f i a m m a t i o nw e r e g r a d e da c c o r d i n gt ot h eu p d a t e ds y d n e ys y s t e m t h e p r e s e n c eo fs p i r a lo r g a n i s m s w a se x a m i n e di ng j e m s a s t a i n e ds e c t i o n s d e t e r m i n a t i o no fa p o p t o s i sa n d p r o l i f e r a t i o n e p i t h e l i a lc e l la p o p t o s i sw a sd e t e r m i n e df 雅s i t uf r o mp a r a f f i n e m b e d d e dt i s s u e s e c t i o n s b y t h et e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d u t pn i c k e n d - l a b e l i n g ( t u n e l ) t e c h n i q u ea sd e s c r i b e db yt h em a n u f a c t u r e re p i t h e l i a lc e l l p r o l i f e r a t i o nw a s d e t e r m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gf o rk i - 6 7 ， r e v e r s e - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o na n a l y s i s t o t a lr n aw a si s o l a t e da n dr e v e r s e t r a n s c r i b e dt h er e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p r o d u c tw a sa m p l i f i e db y p c rp c rp r o d u c t sw e r ee i e c t r o p h o r e s e do n1 5 a g a r o s eg e l s ，a n d s t a i n e db a n d sw e r ep h o t o g r a p h e d ，a n dd i g i t i z e dw i t ha nb i o x i 些! 堡堑堕壁銎塑墼堕垫型星墨鱼壅堕渔塑垫塑塞墅堕窭 苎塞苎薹 i m a g i n ed e t e c t i o ns y s t e m ，a n db a n di n t e n s i t yw a sq u a n t i t a t e do nam a c i n t o s h c o m p u t