（内科学专业论文）骨髓内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠后肢缺血的实验性研究.pdf

目录 舢i l p p lii i1 1 1 1 1 1i l l lp i l l 17 7 9 5 7 3 中文摘要1 英文摘要 oi oooooo ooooodo o0 5 研究论文骨髓内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠后肢缺血的实验性研究 第一部分内皮祖细胞在骨髓单个核细胞治疗糖尿病下肢缺血中的作用 前言9日l j 舌“一”“”“”一”一“一”“”一一”。9 材料与方法9 结果 1 6 附图、附表l9 讨论2 5 结论 “”“一”一“”“”“”“2 9 第二部分糖尿病对骨髓来源内皮祖细胞移植在下肢缺血中促血管新生 作用的影响 前言3 1日l j 舀“”“”“”一“一“一一3 l 材料与方法3 1 结果3 4 附图、附表3 7 讨论一一”“一一”一”4 8 结论 oooo oo 5 0 全文结论5 l 参考文献0 0 0 000000 5 l 综述内皮祖细胞及其血管新生作用5 5 致谢 - 6 8 个人简历6 9 中文摘要 骨髓内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠后肢缺血的实验性研究 摘要 研究背景：众所周知，糖尿病( d m ) 是目前威胁人类生命健康的常 见病、多发病。肢体动脉闭塞导致的下肢缺血是d m 的四大血管并发症 之一，临床治疗困难，截肢率高，占非创伤性截肢的5 0 。随着干细胞移 植技术的不断发展，人们已开始将这一技术应用于糖尿病下肢缺血的研 究。内皮祖细胞( e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ，e p c s ) 最早于1 9 9 7 年在外 周血中被发现，并被证明其在出生后的血管新生( a n g i o g e n e s i s ) 中发挥 着重要作用。本研究试图通过e p c s 移植治疗糖尿病下肢缺血的动物实验， 为其进一步合理地临床应用奠定初步理论基础。 第一部分内皮祖细胞在骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病下肢缺 血中的作用 目的：通过将糖尿病大鼠骨髓密度梯度离心后所得单个核细胞 ( m o n o n u c l e a rc e l l s ，m n c s ) 直接向糖尿病大鼠下肢缺血部位进行局部注 射与从相同数量的m n c s 中培养所得的e p c s 注射后的促血管新生效果进 行比较，以及对等量骨髓m n c s 和e p c s 的促血管新生作用进行比较，了 解骨髓干细胞移植及e p c s 在其中的作用。 方法：取健康w i s t a r 大鼠9 8 只，将1 0 9 l 的链脲佐菌素( s t z ) 溶 液按6 5 m g k g 体重腹腔注射达到糖尿病标准后，将其中5 6 只分别结扎左 下肢股动脉及主要分支制作糖尿病下肢缺血模型，随机分为a 、b 、c 、d 四组( 每组1 4 只) 。m n c s 应用密度离心法从抽取的骨髓液中获得，e p c s 由m n c s 接种于含1 0 f b s 及促生长细胞因子的0 【m e m 培养基中培养7 获得，得率约为1 0 。移植方法为取细胞p b s 悬液分1 0 个位点均匀注射 于实验大鼠的缺血下肢。a 组移植细胞为4 1 0 6 个m n c s ；b 组移植细胞 为从与a 组细胞数量相等的m n c s 经体外培养获得的e p c s ( 数量约为 4 1 0 5 个) ；c 组移植细胞为与b 组e p c s 细胞数量相等的m n c s ；d 组 注射液体总量相同的p b s 液。注射后7 天，各组取6 只大鼠，分别将手 中文摘要 术部位肌肉取材称重匀浆后，e l i s a 方法测v e g f 含量。注射后第2 8 天， 各组大鼠取材免疫组化计数血管密度。 结果：a 组、b 组、c 组均较d 组在局部v e g f 含量和血管密度两 项指标上明显增高，有统计学意义；但a 组和b 组两组间无论v e g f 含 量还是血管密度均没有显著性差异；b 组与c 组间比较，b 组的v e g f 含量和微血管密度两项指标均高于c 组，结果有统计学差异。 结论： 1 采用局部注射骨髓干细胞移植方式可以促进糖尿病大鼠缺血下肢 的血管新生。 2 局部注射e p c s 量与m n c s 量相等情况下，e p c s 局部注射后缺血 下肢的血管新生优于m n c s 的局部注射。 3 将骨髓m n c s 直接注射入糖尿病下肢缺血局部与先将此数量的 m n c s 培养纯化获得内皮祖细胞后再局部注射，在促进血管新生方面二者 无明显差别，说明内皮祖细胞在骨髓单个核细胞移植后的血管新生中发挥 主导作用。 关键词：内皮祖细胞；骨髓单个核细胞；糖尿病；下肢缺血；血管新 生；血管内皮细胞生长因子；血管密度 第二部分糖尿病对骨髓来源内皮祖细胞移植在下肢缺血中促血 管新生作用的影响 目的：比较受体相同( 均为糖尿病下肢缺血大鼠或均为非糖尿病的下 肢缺血大鼠) 情况下，糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓e p c s 局部注射后的血 管新生作用有无不同。比较相同移植物( 均为糖尿病大鼠骨髓e p c s 或均 为正常大鼠骨髓e p c s ) 注射情况下，糖尿病下肢缺血大鼠和非糖尿病下 肢缺血大鼠血管新生作用有无不同。 方法：将2 4 只糖尿病大鼠与相同数量的正常大鼠，同时取骨髓m n c s 并分别进行e p c s 培养，另各取3 6 只大鼠制作糖尿病下肢缺血模型和非 糖尿病下肢缺血模型，待造模成功并稳定1 周后，将各模型组随机分为糖 尿病下肢缺血组：a 1 、b 1 、c 1 ，每组均1 2 只；非糖尿病下肢缺血组： 2 中文摘要 a 2 、b 2 、c 2 ，每组1 2 只。将上述培养7 天后的糖尿病大鼠e p c s 注射 a 1 和a 2 组各大鼠左下肢缺血局部，取同样培养天数的正常大鼠e p c s 以相同数量、方法注入b 1 和b 2 组各大鼠左下肢缺血局部，c 1 和c 2 组 左下肢缺血局部以相同方式注入等量p b s 溶液。注射7 天后各组取6 只 大鼠取材测v e g f 含量。其余2 8 天后取材，免疫组化染色计数各组大鼠 左下肢微血管密度。 结果：受体相同，各移植物组间比较：糖尿病下肢缺血各组v e g f 含量和微血管密度比较，p 值均 o 0 5 ，结果有显著性差异，其中a l 组 与b 1 组局部v e g f 含量和血管密度均较c 1 组增高有显著性差异，但a 1 组与b 1 组两组间无显著性差异。非糖尿病下肢缺血各组v e g f 含量和微 血管密度比较，p 值均 o 0 5 ，结果有显著性差异，其中a 2 组与b 2 组局 部v e g f 含量和血管密度均较c 2 组增高，差异有显著性，但a 2 组与b 2 组两组间无显著性差异。 移植物相同，各受者组间比较：移植相同骨髓e p c s 或p b s 溶液后， a 2 、b 2 组与c 2 组( 非糖尿病下肢缺血组) 无论是局部v e g f 含量和血 管密度都较相应的a 1 、b1 与c 1 组( 糖尿病下肢缺血组) 增高，p 值均 o 0 5 ，结果有统计学显著性差异。 结论： 1 局部注射糖尿病大鼠骨髓内皮祖细胞与注射正常大鼠内皮祖细胞 均有明显促进血管新生作用，但两者间差异没有显著性，说明糖尿病对移 植的“种子 一骨髓来源内皮祖细胞无明显影响。 2 注射相同骨髓来源内皮祖细胞，非糖尿病大鼠下肢缺血的血管新生 作用较糖尿病大鼠明显，说明糖尿病对移植的“土壤”一下肢缺血微环境 有明显影响。 关键词：内皮祖细胞；糖尿病；下肢缺血；血管新生：血管内皮细胞 生长因子；血管密度 全文结论 1 采用局部注射骨髓干细胞移植可以促进糖尿病大鼠缺血下肢的血 3 中文摘要 管新生。内皮祖细胞在骨髓干细胞移植促血管新生作用中起着主要的作 用。 2 在局部注射骨髓来源内皮祖细胞移植促进糖尿病大鼠缺血下肢的 血管新生的体系中，糖尿病对内皮祖细胞无明显影响，对血管新生所处的 下肢缺血微环境有明显影响。 英文摘要 e m p i r i c a ls t u d yo fb o n em a r r o w - - d e r i v e de n d o t h e l i a l p r o g e n i t o rc e l l si nt r e a t m e n to fd i a b e t i cr a t sw i t hh i n dl i m b i s c h e m i a a b s t r a c t b a c 崦r o u n d ：d i a b e t e sm e l l i t u s ( d m ) i so n eo ft h em o s tc o m m o na n d f r e q u e n t l y o c c u r r i n gd i s e a s e sa n di tt h r e a t st h eh u m a nh e a l t hs e r i o u s l y t h e l o w e rl i m bi s c h e m i ai n d u s e db ye x t r e m i t ya r t e r i a lo c c l u s i o ni so n eo ft h ef o u r m a j o rv a s c u l a rc o m p l i c a t i o n so fd m ，w h i c hg i v e sm o r ed i f f i c u l t i e st oc l i n i c a l t r e a t m e n t a c c o u n t i n gh i g ha m p u t a t i o n r a t e b y 5 0 o fn o n - t r a u m a t i c a m p u t a t i o n w i t hc o n t i n u o u sd e v e l o p m e n to ft h es t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ， m a n yd o c t o r sh a v es t a r t e dt oa p p l yt h i st e c h n o l o g yt ot r e a td i a b e t i cl o w e rl i m b i s c h e m i a t h ee n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ( e p c s ) w a sf o u n di np e r i p h e r a l b l o o da s e a r l y a s19 9 7 ，w h i c hw a sp r o v e dt o p l a y ai m p o r t a n tr o l ei n a n g i o g e n e s i s a f t e rb i r t h i nt h i s s t u d y , w ea t t e m p t e dt o u s et h ee p c s t r a n s p l a n t a t i o na sat r e a t m e n tf o rt h ed i a b e t i cl o w e rl i m bi s c h e m i ai nr a td m m o d e l ，i no r d e rt oe s t a b l i s har e a s o n a b l et h e o r e t i c a lb a s i sf o rm o r ec l i n i c a l a p p l i c a t i o n s p a r t1e f f e c to fe n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l si nt h et r e a t m e n to ft h e d i a b e t i cl o w e rl i m bl s c h e m i ab yb o n em a r r o wm o n o n u c l e a rc e l l s t r a n s p i a n t a t i o n o b j e c t i v e ：t oc o m p a r et h et r a n s p l a n t a t i o na n g i o g e n e s i s p r o m o t i n ge f f e c t o fb o n em a r r o wm o n o n u c l e a rc e l l s ( m n c s ) ，w h i c ha r eo b t a i n e df r o mt h eb o n e m a r r o w , w i t hp o s t c u l t i v a t e de p c sd e r i v e df r o mt h es a m ea m o u n to fm n c s b yi n je c t i n gd i r e c t l yt ot h es i t eo fl o w e rl i m bi s c h e m i ai nd i a b e t i cr a t s ，a n d c o m p a r et h ea n g i o g e n e s i se f f e c to ft h es a m en u m b e ro fe p c sa n dm n c s i n t h es a m e w a y i no r d e st or e s e a r c ht h e i rd if f e r e n te f f e c ti n a n g i o g e n e s i s p r o m o t i n g 5 英文摘要 一一h _ 一_ _ _ - _ _ _ - _ - - _ _ - _ - - - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ - - _ _ - - - _ _ _ _ _ - _ _ _ - - _ - _ - _ - _ l - - _ i _ _ _ _ - l _ _ - _ _ - _ - 一 m e t h o d s ：9 8h e a l t h yw i s t a rr a t sw e r eu s e dt om a k et h ed i a b e t e sm e l l i t u s m o d e lb yi n t r a p e r i t o n e a li n je c t i n gw i t h6 5 m g k gs t r e p t o z o t o c i n ( s t z ) s o l u t i o n ， t h el e f tf e m o r a la r t e r ya n di t sm a i nb r a n c ho f5 6r a t so ft h e mw e r el i g a t e d r e s p e c t i v e l y t o p r o d u c t d i a b e t i cl o w e rl i m bi s c h e m i a t h e nt h e yw e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t oa ，b ，c ，dg r o u p ( n = 14 ) m n c sw e r ea c q u i r e df r o m b o n em a r r o wb yd e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n e p c sw e r ea c q u i r e df r o m m n c sc u l t u r e dw i t h10 f b sa n dg r o w t h p r o m o t i n gc y t o k i n e si n ( x - m e m m e d i u mf o r7d a y s t r a n s p l a n t a t i o nw a so p e r a t e db ys u b 一10 一p o i n ti n j e c t i n gi n l e f th i n dl i m bo f e a c hm o u s e i ng r o u pa ，i n j e c t e dc e l l sw e r e4 x 10 0m n c s ；i n g r o u pb ，i n j e c t e dc e l l sw e r ee p c sa c q u i r e df r o m4 x 10 0m n c s ；i ng r o u pc ， i n j e c t e dc e l l sw e r em n c s a ss a m ea st h ec e l ln u m b e ro fg r o u pb ；t h eg r o u p dw a si n j e c t e dw i t ht h es a m ea m o u n to fp b ss o l u t i o n a f t e ri n j e c t i n g7d a y s ， 6r a t si ne a c hg r o u pw e r ek i l l e dt ot a k et h em u s c l e sf r o mt h es u r g i c a ls i t e ，a n d w e i g h t e d ，h o m o g e n i z e d ，a n dm e a s u r e dt h ev e g f l e v e l sw i t he l i s a i nt h e 2 8 t hd a y , v a s c u l a rd e n s i t yw a sc o u n t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yf r o mt h e r a t sr e m a i n e di ne a c hg r o u p r e s u l t s ：t h eg r o u pa ，g r o u pba n dg r o u pcw e r ea l lm o r ei n c r e a s e d t h a nt h eg r o u pdi nt h el o c a lv e g fl e v e l sa n dm i c r o v e s s e ld e n s i t y , a n dt h e d i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t b u tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n g r o u pa a n dg r o u pb c o m p a r i n gt h eg r o u pba n dg r o u pc ，i tw a sc o n c l u d e d t h a tt h eg r o u pbw a sm o r ei n c r e a s e dt h a nt h eg r o u p ci nt h el o c a lv e g f l e v e l sa n dm i c r o v e s s e ld e n s i t y ，a n dt h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t c o n c l u s i o n ： 1 s t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o nb yl o c a li n je c t i o no fb o n em a r r o ws t e mc e l l s i nd i a b e t i cr a t sc o u l d p r o m o t ea n g i o g e n e s i s i nt h e i ri s c h e m i cl o w e r e x t r e m i t i e s 2 i nt h ec o n d i t i o no ft r a n s p l a n t i n gw i t ht h es a m ea m o u n to fc e l l s ，t h e a n g i o g e n e s i sr o l eo fi n je c t i o nw i t hb o n em a r r o we p c sw a ss t r o n g e rt h a nt h e r o l eo fb o n em a r r o wm n c s 3 i nt h ec o n d i t i o no ft h es a m ea m o u n to fo r i g i n a lm n c s ，t h er o l el o c a l i n je c t i o n o fe p c sa n dt h es a m ew a yo fm n c si n t h e p r o m o t i n g o f 6 a n g i o g e n e s i si nd i a b e t i cl o w e rl i m bi s c h e m i aw a s s a m e t h er e s e a r c hs h o w e d t h a te p c sp l a y e di m p o r t a n tr o l ei na n g i o g e n e s i sa f t e rs t e mc e l lt r a n s p l a n t i o n k e yw o r d s ：e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l ；b o n em a l t o wm o n o n u c l e a rc e l l s ； d i a b e t i ch i n dl i m bi s c h e m i a ；a n g i o g e n e s i s ；v e g f ；m i c r o v e s s e ld e n s i t y p a r t2t h ee f f e c t i o no fd i a b e t e so nb o n em a r r o we p c s t r a n s p l a n t a t i o ni nt h ea n g i o g e n e s i so fh i n dl i m bi s c h e m i ai nd i a b e t i c r a t s o b j e c t i v e ：t or e s e a r c ht h ee f f e c t i o no fd i a b e t e so nb o n em a r r o we p c s a n dm i c r o e n v i r o n m e n ti nt r a n s p l a n t a t i o ni nt h ea n g i o g e n e s i so fh i n dl i m b i s c h e m i ai nd i a b e t i cr a t s m e t h o d s ：2 4d i a b e t i cr a t sa n d2 4n o r m a lr a t sw e r ek i l l e d ，t h e i rb o n e m a r r o wm n c sw e r ei n s o l a t i o na n dc u l t u r e dt oa q u i r ee n o u g ha m o u n t so f e p c s 3 6d i a b e t i ch i n dl i m bi s c h e m i ar a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t oa 1 ，bl ， c1g r o u p s ，e a c hg r o u pi n c l u d e d12r a t s 36n o n d i a b e t i ch i n dl i m bi s c h e m i a r a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t oa 2 ，b 2 ，c 2g r o u p s ，e a c hg r o u pi n c l u d e d12 r a t s a f t e rc u l t u r e df o r7d a y s ，e p c sf r o md i a b e t i cr a t sw e r ei n j e c t e di n t ot h e l e f th i n di s c h e m i cl i m bo fr a t so fa 1a n da 2 w i t ht h es a m em e t h o d sa n dt h e s a m en u m b e r ，e p c sd e r i v e df r o mt h en o r m a lr a t sw e r ei n je c t e di n t ot h er a t so f g r o u po fb 1a n db 2 c1a n dc 2r a t sw e r ei n j e c t e dw i t ht h et h ee q u i v a l e n tp b s 7d a y sa f t e ri n je c t i o n ，6r a t si ne a c hg r o u pw e r eu s e dt om e a s u r et h ev e g f l e v e l s a f t e r2 8d a y s t h er e s t w e r et ob ed r a w nt oa c c o u n to fm i c r o v e s s e i d e n s i t yi nt h el o c a lm u s c l eo fl e f th i n dl i m bt h r o u g hi m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s u l t s ：w h e nc o m p a r i n ga m o n gg r o u p so fs a m ea c c e p t o r t h e r ew e r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n g t h ea 1 ，b1 ，a n dc 1i nt h ec o n t e n t so fv e g fa n d m i c r o v e s s e ld e n s i t y t h eg r o u pa 1a n dg r o u pb1w e r ea l lh i g h e ri nl o c a l e x p r e s s i n gl e v e l so fv e g fa n dm i c r o v e s s e ld e n s i t y t h a nt h eg r o u pc 1 ，b u tt h e d i s t i n c t i o nb e t w e e nt h eg r o u pa 1a n db1w e r en o ts i g n if i c a n t w h e n 7 英文摘要 c o m p a r i n gt h eg r o u p s o fn o n d i a b e t i cl o w e rl i m b i s c h e m i a ，t h e r ew e r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n ga 2 ，b 2 ，a n dc 2i nt h ec o n t e n t so fv e g fa n d v a s c u l a rd e n s i t y t h eg r o u pa 2a n dg r o u pb 2w e r ea l s os e p a r a t e l yh i g h e rt h a n t h eg r o u pc 2o nb o t hl o c a l v e g fl e v e l sa n dm i c r o v e s s e ld e n s i t y , b u tt h e d i s t i n c t i o nb e t w e e nt h e g r o u p a 2a n db 2w e r en o t s i g n i f i c a n t w h e n c o m p a r i n ga m o n gg r o u p so f s a m et r a n s p l a n t s ，t h ev e g fa n dm i c r o v e s s e l d e n s i t yo f g r o u pa 2 ，b 2 ，c 2w e r eh i g h e rt h a ng r o u pa 1 ，b 1 ，c 1 ，p 0 0 5 c o n c l u s i o n ： 1 l o c a li n je c t i o no fe p c sf r o mt h eb o n em a r r o wo fd i a b e t i cr a t so rf r o m t h en o r m a lr a tw a ss i g n i f i c a n t l yi np r o m o t i n ga n g i o g e n e s i s ，b u tt h e r ew a sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w ow a y s t h er e s u l ts h o w e dt h a td i a b e t e s h a dn o te f e c t i o no ne p c sc u l t u r e df r o mb o n em a r r o w 2 i n j e c t i n gt h es a m ee p c s ，t h ea n g i o g e n e s i so fn o r m a lr a t sw a sb e t t e r t h a nt h ed i a b e t i co n e s t h e 。r e s u l ts h o w e dt h a td i a b e t e sh a de f e c t i o no n m i c r o e n v i r o n m e n to ft r a n s p l a n t i o n k e yw o r d s ：e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ；a n g i o g e n e s i s ；d i a b e t i ch i n dl i m b i s c h e m i a ；v e g f ；m i c r o v e s s e ld e n s i t y g e n e r a lc o n c l u s i o n s 1 b o n em e r r o ws t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o nb yl o c a li n j 。e c t i o nc o u l dp r o m o t e a n g i o g e n e s i si nd i a b e t i ch i n dl i m bi s c h e m i a e p c sp l a y e dam a j o rr o l ei nt h e p r o g r e s s 2 i np r o g r e s so fb o n em e r r o ws t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o nb yl o c a li n j e c t i o n t op r o m o t ea n g i o g e n e s i si nd i a b e t i ch i n dl i m bi s c h e m i a ，d i a b e t e sd i a b e t e sh a d n o te f e c t i o no ne p c sc u l t u r e df r o mb o n e m a r r o w , b u th a de l e c t i o n 0 1 1 m i c r o e n v i r o n m e n to ft r a n s p l a n t i o n 8 研究论文 第一部分内皮祖细胞在骨髓单个核细胞治疗糖尿病 后肢缺血中的作用 - _ - 一 刖罱 随着生活水平的提高，人们生活方式的改变，以及老龄化社会的到 来，糖尿病的患病人数持续增加，己跃居常见疾病的第三位( 心血管疾病、 癌症和糖尿病) 。其中8 0 的糖尿病患者会因并发的血管病变而死亡。糖 尿病足( d f ) 就是糖尿病的四大血管并发症之一。糖尿病足( d f ) 又称 糖尿病肢体动脉闭塞症( d m 。l a o ) 是指糖尿病合并下肢远端神经异常和 不同程度的周围血管病变相关的足部感染、溃疡和( 或) 深层组织破坏，临 床表现为静息痛、皮肤溃疡或坏疽，严重影响患者的生活质量，甚至危及 生命。由于糖尿病不仅能促进血管病变而致严重缺血性疾病，而且同时伴 有侧支血管形成能力严重受损，因此糖尿病足的病情复杂，治疗困难。 随着干细胞技术的出现及快速发展，这一技术也逐渐被应用于治疗糖 尿病下肢缺血，尤其是对于由于下肢远端动脉流出道差无法进行下肢搭桥 的患者，或者由于年老体弱或伴有其它疾病不能接受手术搭桥的患者，其 均带来了新的希望。鉴于目前临床大多采用骨髓或动员后的外周血单个核 干细胞这一混杂多种成分的干细胞进行移植，本实验通过比较单纯注 射分离纯化后的内皮祖细胞和混合状态下的单个核细胞的血管新生效果， 来探讨内皮祖细胞在单个核细胞移植中的作用。 材料与方法 1 1 试验动物封闭群健康6 周龄w i s t a r 大鼠9 8 只，体重1 6 0 1 8 0 9 ，普通 级。由河北省实验动物中心提供( 生产许可证号：s c x k ( 冀) 2 0 0 8 1 0 0 3 ) ， 合格证编号：9 0 9 1 2 0 。 1 2 主要试剂 仅一m e m 培养基美国s i g m a 公司 胎牛血清美国g i b c o 公司 纤维连接蛋白美国p e p r o t e c h 公司 9 研究论文 血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 胰岛素样生长因子一1 ( i g f 1 ) 地塞米松 维生素c 链脲佐菌素( s t z ) 兔抗c d 3 4 单克隆抗体 兔抗c d l 3 3 单克隆抗体 兔抗f l k 1 多克隆抗体 兔抗多克隆抗体 s p 一9 0 0 1 山羊抗兔免疫组化试剂盒 v e g f 测定e l i s a 试剂盒 大鼠淋巴细胞分离液 胰酶 e d t a 磷酸盐缓冲液( p b s ) 抗原修复液 青霉素 链霉素 多聚甲醛 树胶 戊巴比妥钠 1 3 主要仪器与设备： 超净工作台 c 0 2 培养箱 水平离心机 超低温冰箱 h y x 9 0 8 2 m b e 数显电热培养箱 g z x 9 0 7 0 m b e 数显鼓风干燥箱 t p c 型摊片机 c i a 一4 0 型倒置显微镜 美国p e p r o t e c h 公司 美国p e p r o t e c h 公司 以色列p e p r o t e c h 公司 天津金耀氨基酸有限公司 常州制药厂 美国s i g m a 公司 北京博奥森公司 北京博奥森公司 武汉博士德公司 武汉博士德公司 北京中杉金桥公司 美国a d l 公司 天津灏洋公司 美国g i b c o 公司 美国s i g m a 公司 实验室白配 实验室自配 华北制药厂 华北制药厂 上海试剂一厂 国药集团化学试剂公司 河北医科大学药理实验室供 苏州苏净生物 德国h e r a e u s 公司 德国h e r a e u s 公司 海尔公司 上海博迅医疗器械厂 上海博迅医疗器械厂 天津久圣医疗仪器公司 日本o l y m p u s 公司 l o 研究论文 血球计数板 血糖仪 c c d 图像摄取系统 塑料培养板 手术器械 数码相机 微量振荡器 酶标仪w e l l s c a nm k 3 电子天平b x 2 4 2 0 h 1 4 主要试剂配制： 上海精密仪器三厂 瑞士r o c h e 公司 日本o l y m p u s 公司 美国c o s t a r 公司 白求恩国际和平医院实验中心提 世 l 、 日本s o n y 公司 北京海淀电子医疗仪器厂、 芬兰d e n l e y d r a g o n 日本岛津公司 1 4 1 内皮祖细胞培养液：每1 0 m l 培养液中加入：9 m l a m e m 培养液( 按 说明配制) ，l m l 进口胎牛血清，浓度为2 m l 的v e g f1 0 0 i - t l ，浓度为 l o t g m l 的b f g f1 0 i r t l ，浓度为5 k t g m l 的i g f 11 0 1 x l ，浓度为1x 1 0 。7 m o l l 地塞米松注射液1 0 0 “l ，浓度为5 m g m l 维生素c 注射液1 0 0 i t l ，1 1 0 5 u m l 青霉素1 0 “l 及1 0 0 m g m l 链霉素l o l a l 。 1 4 2 标准磷酸盐缓冲液( p b s ) 【3 】：n a c l8 o o g ，k c l0 2 0 9 ，n a 2 h p 0 4 - h 2 0 1 5 6 9 ，k h 2 p 0 40 2 0 9 加入1 l 双蒸水中，高压蒸气灭菌，4 c 冰箱保存备 用。 1 4 3d h a n k s 液p 】：n a c l8 0 0 9 ，k c l0 4 0 9 ，n a 2 h p 0 4 。h 2 00 0 6 9 ， k h 2 p 0 40 0 6 9 ，n a h c 0 30 3 5 9 ，酚红o 0 2 9 加入1 l 双蒸水中，高压蒸气 灭菌，40 c 冰箱保存备用。 1 4 。4 其它：0 2 5 胰酶、0 0 2 e d t a 、4 多聚甲醛，分别在l o o m l p b s 中加入相应克数的物质，充分溶解后，过滤除菌，分装，4 c 保存。 1 5 方法： 1 5 1 糖尿病大鼠模型的制备：取9 8 只封闭群w i s t a r 大鼠禁食不禁水1 2 h 后，称重、测血糖。根据文献资剃2 】将链脲佐菌素( s t r e p t o z o t o c i n ，s t z ) 溶解于4 c 预冷的0 1 m m o l l 的枸橼酸钠枸橼酸缓冲液( p h 4 5 ) 中，配 成新鲜的浓度为1o g l 的s t z 溶液。按6 5 m g k g 体重将上述浓度的s t z 溶液快速腹腔注射入大鼠体内。腹腔注射时，用左手的大拇指、食指和中 指从大鼠的前肢和头部后面抓住大鼠，既要紧又要轻柔，同时用身体抵住 研究论文 大鼠的两后肢使之固定，使腹部向上伸展。右手持注射器( 用5 号针头) 在距下腹部腹中线稍左或右l c m 的位置将针头刺入皮肤。针头到达皮下 后，再向前进针3 m m - - 5 m m 后，再以4 5 0 角刺入腹腔，针尖通过腹肌后 抵抗力消失。固定针尖不动，缓缓注入药液。为避免刺破内脏，可将大鼠 头部稍低，使脏器移向头部方向。注射后2 4 h 血糖大于或等于1 6