（作物遗传育种专业论文）小麦抗条锈病品系Taichung29ltgt6Yr5的蛋白质组学分析.pdf

捅要 摘要 蛋白质组学是生命科学研究的热点和前沿。蛋白质组学的发展是受技术限制的，也是受 技术推动的。目前小麦叶片蛋白质组研究主要采用双向电泳( 2 d e ) 分离和肽质量指纹( p m f ) 分析技术。探索新的分离、分析方法，可为更深入全面研究小麦叶片蛋白质组提供技术保证。 二维液相色谱( 2 d l c ) 与2 一d e 技术具有互补性，本文探讨了利用2 d l c 和纳升级液相色谱串 联质谱( n a n ol c m s m s ) 技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。小麦叶片蛋白经提取、 脱盐后，进行第一维阴离子交换分离：收集洗脱组分进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳( s d s p a g e ) 分析，并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离；随机选择含较 低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行n a n ol c m s m s 分析；将串联质谱数据通过 m a s c o t 搜索n c b i n r 和e s t 数据库，并对二级质谱获得的蛋白序列进行m sb l a s t 分析。结 果表明，经第一维阴离子交换色谱分离，收集得到1 5 个组分，其中第1 5 组分包含小麦叶片丰 度最高的蛋白1 ，5 二磷酸核酮糖羧化酶力口氧酶( r u b i s c o ) ；其余1 4 个组分经反相液相色 谱分离，共收集1 5 5 1 个组分，获得1 8 6 7 个色谱峰；随机对其中6 个含较低吸收峰的收集组分酶 解和n a n ol c m s m s 检测，9 种蛋白得到鉴定。 小麦条锈病( p u c c i n i as t r i i f o r m i sf s p t r i t i c i ) 一直是我国小麦的主要病害，成灾频率高、 流行范围广。利用抗病品种是防治小麦条锈病最有效、经济和安全的途径，选育和推广抗病 品种成为控制病害流行的首选措施。但由于病原菌生理小种变异快，品种抗性频繁丧失，抗 病育种始终处于被动应付状态。本文从蛋白质组学角度出发深入研究小麦对条锈病抗性的分 子机理，揭示寄主小麦与病菌之间的互作机制，在小麦抗病品种的培育和利用上具有重要理 论和实际意义。由中国农科院植保所培育的小麦抗条锈病品系t a i c h u n 9 2 9 6 y r 5 目前在我国尚 未发现对其致病的条锈菌生理小种。本试验联合应用双向电泳、二维液相色谱和质谱技术， 以接种当前条锈菌主要流行小种条中3 2 号( c y 3 2 ) 的小麦抗条锈病品系t a i c h u n 9 2 9 6 y r 5 为材 料，研究其叶片差异表达蛋白质组，以期发现特异的抗病相关蛋白。经双向电泳分析，初步 确定1 9 个差异表达蛋白质点。其中，接种后诱导表达的蛋白质点有8 个：上调表达的蛋白质点 有1 0 个；下调表达的蛋白质点有1 个：未发现表达被抑制的蛋白质点。经二维液相色谱分析， 初步确定1 7 个差异色谱峰。其中，接种后新出现的色谱峰有1 个：峰面积增加的色谱峰有6 个； 峰面积减少的色谱峰有9 个；缺失的色谱峰有1 个。所有差异蛋白组分均进行了质谱分析与数 据库检索，1 1 个蛋白质获得鉴定结果，包含8 个与植物源蛋白相匹配的蛋白、2 个与真菌蛋白 高度同源的蛋白和1 个与假设蛋白高度同源的蛋白。鉴定蚩白的功能主要涉及植物防卫和植物 光合作用。 试验结果表明利用2 d l c 和n a n ol c m s m s 技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质 组；同时采用双向电泳和二维液相色谱技术分析小麦抗条锈病品系t a i c h u n 9 2 9 6 y r 5 接种条 锈菌c y 3 2 的差异表达蛋白质组，能够更全面的获取差异表达蛋白质信息；本文利用小麦抗 条锈病品系t a i c h u n 9 2 9 6 y r 5 开展的比较蛋白质组研究工作，为深入理解小麦与条锈病菌的 互作机制提供了重要的基础。 关键词：蛋白质组学；小麦叶片；条锈病；二维液相色谱；纳升级液相色谱串联质谱；双向 电泳；肽质量指纹图谱 v i i 东北农业人学农学博卜学位论文 _i p r o t e o m e a n a l y s i so ft a i c h u n 9 2 9 央6 y r 5r e s i s t a n tt o w h e a t s t r i p er u s t a b s t r a c t p r o t e o m i c si so n eo f t h eh o ts p o t si nl i f es c i e n c ea n dp r o t e o m i c st e c h n o l o g i e sh a v eb e e na p p l i e d i na l m o s ta l lb i o l o g yr e s e a r c h t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ( 2 d e ) a n dp e p t i d em a s s f i n g e r p r i n t i n g ( p m f ) h a v eb e e n t h em a i n t e c h n i q u e sf o rt h ew h e a t l e a fp r o t e o m ea n a l y s i s t w o - d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( 2 d - l c ) c a l lb eu s e da sac o m p l e m e n t a r ya p p r o a c ht o p r o t e i ns e p a r a t i o nw i t h2 - d e t h ep u r p o s eo ft h es t u d yi st oe s t a b l i s hap r o t o c o lt os e p a r a t ea n d i d e n t i f yw h e a tl e a fp r o t e o m eb yc o m b i n a t i o no f2 d l c a n dn a n o f l o wl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( n a n ol c m s m s ) t h es o l u b l ep r o t e i ne x t r a c t e df r o mw h e a tl e a fw e n d e s a l t e db yg e lf i l t e rc h r o m a t o g r a p h ya n ds e p a r a t e db ys t r o n ga n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( s a x ) i nt h ef i r s td i m e n s i o n t h ee l u t i o nf r a c t i o n sw e r es u b j e c t e dt os o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) a n dt h ef r a c t i o n s w i t h o u tt h em o s ta b u n d a n t p r o t e i n ( s ) w e r ef u r t h e rs e p a r a t e db yr e v e r s e dp h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) i nt h es e c o n d d i m e n s i o n t ot e s tt h ee f f e c t i v e n e s so ft h es e p a r a t i o nm e t h o d , s o m eo f 2 d l cf r a c t i o n si n c l u d i n g l o w e ri n t e n s i t yp e a k sw e r ed i g e s t e da n da n a l y z e db yn a n ol c m s m s t h em s m sd a t aw a su s e d t os e a r c ha g a i n s tn c b i n ra n de s td a t a b a s eu s i n gm a s c o ts e a r c he n g i n e m e a n w h i l e ，d en o v o s e q u e n c i n gw a sp e r f o r m e dm a n u a l l ya n dt h ed a t aw a su s e dt os e a r c ha g a i n s tn r d b 9 5d a t a b a s eu s i n g m sb l a s ts e a r c he n g i n e at o t a lo f15c o l l e c t i o n sw e r eo b t a i n e dt h r o u g ht h ef i r s td i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n a n dt h em o s ta b u n d a n t p r o t e i n , r i b u l o s e - 1 5 b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ( r u b i s c o ) i np l a n tl e a f , c o u l do n l yb eo b s e r v e di nt h e15 t hc o l l e c t i o n a f t e rt h es e c o n dd i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n , 15 51 c o l l e c t i o n sw e r ec o l l e c t e dw i t h18 6 7r e s o l v e dp r o t e i np e a k sf r o mt h eo t h e r14 f r a c t i o n sw i t h o u tr u b i s c o n i n ep r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e df r o ms i x2 d l cc o l l e c t i o n sw i t hl o w e r i n t e n s i t yp e a k ss e l e c t e dr a n d o m l y w h e a ts t r i p er u s t ( p u c c i n i as t r i i f o r m i sf s p t r i t & 0i so n eo ft h em o s td e s t r u c t i v ed i s e a s e st o w h e a ti nc h i n a u s eo f r e s i s t a n tc u l t i v a r sh a sb e c o m et h em a j o rm e a n so f c o n t r o l l i n gs t r i p er u s ta n d r e s i s t a n tc u l t i v a r su t i l i z a t i o ni st h em o s te f f e c t i v e ，e c o n o m i c a la n ds a f ew a y b e c a u s eo fd e v e l o p m e n t o ft h en e wp h y s i o l o g i cr a c e s ，w h e a ts t r i p er u s tr e s i s t a n c eg e n e sf r e q u e n t l yb e c a m es u s c e p t i b l ea n d t h u sb r e e d i n gf o rd i s e a s e - r e s i s t a n c ei sp a s s i v eu s u a l l yt a i c h u n 9 2 9 幸6 y r 5r e s i s t a n tt ow h e a ts t r i p e r u s tw a se s t a b l i s h e db yi n s t i t u t eo fp l a n tp r o t e c t i o no f c h i n e s ea c a d e m yo fa 舒c u l t u r a ls c i e n c e s a n dn op a t h o g e n i cr a c e sa r ef o u n du pt ot h ep r e s e n ti no u rc o u n t r y s o ，w ec h o s et a i c h u n 9 2 9 + 6 y r 5 a st h e e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h r o u g hp r o t e o m i ca n a l y s i s o ft h e c h a n g e s o fp r o t e i n si n t a i c h u n 9 2 9 幸6 y r 5 i n o c u l a t e db yt h ee p i d e m i cl a c ec y 3 2 ，w ew a n t e dt of i n ds o m es p e c i f i c r e s i s t a n c e r e l a t e dp r o t e i n s a sar e s u l t , 19p r o t e i ns p o t sr e s o l v e do nt w o d i m e n s i o n a lg e l sw e r e f o u n dt ob ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e da f t e ra n a l y z i n gc o o m a s s i e - b l u es t a i n e dg e l so ft h es o l u b l e v 1 i i a b s t r a c t i p r o t e i ns a m p l e sf r o mt h ec o n t r o la n dd i s e a s el e a v e s8d a y sp o s ti n o c u l a t i o n 8o ft h o s e w e r e i n d u c e d ，10 o ft h o s ew e r eu p - r e g u l a t e d ，1o ft h o s ew a sd o w n r e g u l a t e da n dn op r o t e i nw a sr e p r e s s e d 17p r o t e i np e a k sr e s o l v e db yt h e2 d l cw e r ef o u n dt ob ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e da f t e ra n a l y z i n g t w od i m e n s i o n a ic h r o m a t o g r a m so ft h es o l u b l ep r o t e i ns a m p l e sf r o mt h ec o n t r o la n dd i s e a s el e a v e s 8d a y sp o s ti n o c u l a t i o n 1o ft h o s ew a si n d u c e d ，6o ft h o s ew e r eu p - r e g u l a t e d ，9o ft h o s ew e r e d o w n - r e g u l a t e da n d1p r o t e i np e a kw a sr e p r e s s e d 11p r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e da tl a s tb ym s o r m s m sa n a l y s i sa n dd a t as e a r c h i n g o ft h e s e ，8m a t c h e dp l a n tp r o t e i n s ，2w e r eh i g h l yh o m o l o g o u s w i t hf u n g a lp r o t e i n sa n diw a sh i i g h l yh o m o l o g o u sw i t hh y p o t h e t i c a lp r o t e i nf r o mo r y z as a t i v a i n d i c ag r o u p f u n c t i o n so fi d e n t i f i e dp r o t e i n sw e r em a i n l yi n v o l v e di np l a n td e f e n s er e s p o n s e sa n d p l a n tp h o t o s y n t h e s i s b a s e do nt h ee x p e r i m e n ts e t u pa n dr e s u l t s ，w et e n t a t i v e l yc o n c l u d e dt h a tt h ec o m b i n a t i o no f 2 d l ca n dn a n ol c m s m sc o u l db ea ne f f e c t i v em e t h o di nf u t u r ew h e a tl e a fp r o t e o m i c sa n a l y s i s ； u t i l i z a t i o no fb o t h2 - d ea n d2 d l cc o u l da c q u i r em o r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n s ；d i f f e r e n t i a l p r o t e o m i ca n a l y s i so f t a i c h u n 9 2 9 + 6 y r 5h e l p e du st oe l u c i d a t et h er e s i s t a n tm e c h a n i s m sa n dp r o v i d e t h e o r e t i c a lp r i n c i p l ea n dr e s o u r c e sf o rm o l e c u l a rb r e e d i n go fw h e a tr e s i s t a n c et op u c c i n i as t r i i f o r m i s k e yw o r d s ：p r o t e o m i c s ：w h e a tl e a f ；w h e a ts t r i p er u s t ；2 d l c ；n a n ol c - m s m s ；2 一d e ；p m f i x c a n d i d a t e ：l i uj i n g s p e c i a l i t y ：c r o pg e n e t i c s & b r e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o f z h a ok u u u n 研究生学位论文独刨声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 逵! 翅遗查基丝盂墓挂别直明丝：奎拦亘窒或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：夕- 行 日期：刀矿髟年多月5e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：夕- 导师签名： 日期：z o 眇g 年石月s m 日期：腑年多月日 前言 1 前言 1 1 文献综述 1 1 1 小麦条锈病的危害与发生 小麦是世界第一大粮食作物，在我国是仅次于水稻的第二大粮食作物。在我国作为口粮 消费的小麦，年消费量在1 亿吨以上，其他消费如用于加工食品、种子以及损耗等大约在1 2 0 0 万吨左右。受人口增长的影响，中国小麦消费的年均增长速度大约在1 - 2 之间。因此，保持 小麦生产持续稳定的发展，对维护我国乃至世界粮食安全意义重大。在影响小麦产量的诸多 因素中，病虫害造成的产量损失是巨大的。世界上能危害小麦的病虫害种类近百种，其中小 麦条锈病是最重要的病害之一。 小麦条锈病一直是威胁我国西北、西南、华北和淮北等冬麦区和西北春麦区的最重要病 害之一。2 0 世纪5 0 年代至今，在我国该病害曾多次流行成灾，先后有7 批品种丧失了抗锈 性，失去了生产上应用价值( 李振岐，1 9 9 8 ) 。1 9 5 0 ，1 9 6 4 ，1 9 7 5 ，1 9 8 3 ，1 9 8 5 ，1 9 9 0 和2 0 0 2 年中国小麦条锈病大流行，分别使小麦减产6 0 亿千克，3 2 亿千克，1 0 亿千克，l o 7 亿千克， 8 5 亿千克，2 5 亿千克和l o 亿千克，并且随着世界气候条件的变化、新毒性小种的不断出现 以及抗病品种的断层，致使我国小麦条锈病出现了发生早、发展快和发生重等特点( 李振岐， 1 9 9 8 ：李振岐等，2 0 0 2 ；万安民等，2 0 0 3 ；芦晓飞，2 0 0 5 ) 。2 0 0 7 年， 据农业部统计，截 至4 月5 日，全国已有3 7 1 个县( 市、区) 发生小麦条锈病，春季发生面积达1 8 4 0 万亩( 农 业部中国农业信息网，2 0 0 7 ) 。 小麦条锈病在西欧被认为是2 0 世纪中期发生和危害最大的作物病害之一。由于成功地 利用小麦的成株抗性、持久抗性和高效药剂，近几十年来，在国外小麦条锈病己不再是生产 上的主要问题。但自1 9 9 1 年以来，伊朗条锈病发生流行比较频繁，特别是由于气候条件适宜 造成了1 9 9 3 年和1 9 9 5 年两次大流行；在土耳其的安纳托利亚高原东部冷凉地区，此病害是 最严重的病害；小麦条锈病于1 9 7 9 年和1 9 8 0 年在澳大利亚和新两兰被发现后，现已成为危 害小麦生产的重要病害；1 9 9 6 年在南非的w e s t e m a p e 发现此病害后，现已扩散到南非几乎所 有重要小麦产区，并于1 9 9 8 年在e a s t e r nf r e es t a t e 大流行( 万安民，2 0 0 0 ) 。小麦条锈病表 现出流行频率高、暴发性强、发生范围广的特点。 小麦条锈病是由小麦条锈病菌( p u c c i n i as t r i i f o r m i sf s p t r i t i c i ) 引起的小麦叶部病害，严 重时也危害穗部。小麦条锈病危害后，由于病斑的增加使得实际光合面积减少、水分代谢受 到破坏和叶绿素含量降低，在生理上表现为光呼吸和暗呼吸升高，净光合速率下降。在产量 形成因素中，千粒重、穗粒数和有效穗数减少。发病越早危害越重，如拔节前病害严重，会 造成穗粒数和有效穗数减少，甚至不能抽穗。拔节期的病害会减少穗粒数，而扬花剑灌浆期 的病害则主要影响干粒重。 s t a k l u a n 早在1 9 1 5 年就对小麦秆锈菌的侵染过程进行了观察研究，h mh i l u ( 1 9 6 5 ) 对 玉米锈菌，d wc a r t w r i g h t ( 1 9 8 1 ) 等对小麦条锈菌的侵染研究表明，在一定的环境条件下， 锈菌的夏饱子在寄主组织上萌发产生芽管，芽管沿着寄主组织表面生长，在遇到气孔后则在 东北农业大学农学博i ：学位论文 气孔上方形成附着胞，然后自附着胞上产生侵入丝，进入气孔并形成气孑l 下囊。气孔下囊产 生初生侵染菌丝，向气孔腔周围的植物细胞生长。经过一定时间的生长，初生侵染菌丝分化 形成初生吸器母细胞，并从吸器母细胞上产生入侵栓侵入寄主细胞形成吸器。侵染菌丝在细 胞间隙不断分枝、生长而形成次生菌丝，同时不断产生吸器母细胞和吸器，从寄主细胞内吸 收营养。当菌落发展到一定阶段后则形成孢子床，然后产生孢子堆。当环境条件不适宜夏孢 子产生时，夏孢子堆转化为冬孢子堆，夏孢子产孢细胞变为冬孢子产孢细胞，产生冬孢子， 形成冬孢子堆。l jl i t t l e f i e l d ( 1 9 8 2 ) 对单核锈菌和双核锈菌的侵染过程进行了比较，发现单 核锈菌分化出附着胞后可直接通过表皮细胞或从表皮细胞之间入侵，吸器由胞内菌丝的分枝 形成，在被侵细胞内呈现类似于菌丝的形态；有时再次从细胞内长出，形成胞间菌丝或入侵 到相邻的寄主细胞中。而双核锈病的吸器则一般是末端结构，不能从细胞内氏出。 条锈病能够在野生或大田栽培条件下自然发生，并经试验室接种试验证明其上的条锈菌 能够侵染普通小麦并产生夏孢子堆的寄主有l o 种( 含变种) 。普通小麦上条锈病是普遍发生 的，大麦和青稞上除了小麦条锈菌外也包括大麦条锈菌。其他7 种寄主植物均为野生禾草， 在自然条件下虽能被小麦条锈菌正常侵染，但尚朱发现有大片的发病菌落，在小麦条锈病流 行中的作用也不足重视。 1 1 2 小麦条锈病的防治 小麦条锈病的防治主要有农业防治、化学防治和种植抗病品种三种。 国际有害生物综合治理( i p m ) 发展计划提出的技术发展策略是：围绕以种植一个健康 的作物为中心，以特定区域为整体系统的、以自然防治为主的农业技术优化组合，提倡清洁 生产。在实施过程中特别强调以农民为中心、充分利用本地自然资源。通过研究人员以特定 地域整体管理系统的研究，发展出套适用的i p m 技术：并建立农民田间学校( f a r m e rf i e l d s c h 0 0 1 ) ，由研究人员、技术推广人员及农民技术员培训农民，使他们成为i p m 专家。我国科 研工作者提山种植抗病品种是在病害常发区所采片j 的最经济、最有效的农业防治措施，同时 提倡坚持“以抗锈良种为主，以药剂和栽培措施为辅，土洋结合，综合防治”的防锈方针。 经过5 0 多年的研究与防治实践，在小麦条锈病防治研究方面我国科研人员已积累了如下经 验：建立控制条锈病的预警系统和异地监测网，加强病菌生理小种和品种抗性变异的研究 与监测；坚持选育和推广抗锈良种，实行抗病基因合理布局：科学应用粉锈宁等药剂防 治小麦锈病；加强栽培管理，适期播种，不早播，以减少冬前发病：配方施肥，勿偏施或 过量施用氮肥：提倡深耕细耙，消灭自生麦苗，减少越夏寄主：控制以陇南为主的越夏易 变区，减少越夏菌源和新小种产生几率。近年来还通过基因布局、作物结构调整等措施开始 了陇南易变区持久控制措施的探索，取得了很大进展( 李振岐等，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 1 农业防治 耕作制度及栽培措施的改革是提高作物产量的重要措施之一，但必须考虑到由丁农田生 态系统的改变，导致田间有害生物类群及数量的变化，可能会造成新的病害或原先的次要病 害上升为主要病害。适时晚播是利用作物生育期与病害发生规律的特点，使作物敏感阶段避 开病害的侵染期。提倡精量播种，使小麦群体降低、个体健壮。合理灌溉以及配方施肥，不 仅有利于作物的健壮生长和增强抗病性，还可以调节农田小气候，造成不利于锈菌活动的生 2 前言 态条件，以减轻病害的发生程度。 1 1 2 2 化学防治 化学防治是小麦锈病综合防治体系中的重要措施。高效内吸性杀菌剂的普遍应用，显著 增强了药剂控制锈病流行的效能，大大提高了化学防治水平和经济效益。在抗病品种尚未普 及的地区或在原有抗病品种“丧失”抗病性的地区，化学防治是控制锈病流行的主要手段， 即使在已经实施抗病良种合理布局的地区。化学防治仍为必不可少的辅助措施。 1 1 2 3 种植抗病品种 孟德尔的遗传定律和b i f f e n 发现抗条锈病隐性单基因是植物抗病育种领域中重要的里程 碑，殷学贵( 2 0 0 5 ) 在他的论文中重述到，b i f f e n 之后，许多国家都开始了抗病育种工作， 并培育出大量的抗性品种( dr u b i a l e s 等，2 0 0 0 ) 。z a d o k s 在1 9 9 2 年所做的题为部分的过 去论文中，以此为根据，将抗病育种史划分为前孟德尔时期、r 基因( 单基因抗性) 时期 和近期三个时期。 在前孟德尔时期，农民和早期的植物育种家主要通过经验对抗病的植株进行选择，一般 性灾害如干旱、蝗虫等是农业生产的主要威胁，与现代农业截然不同。 r 基因是指符合孟德尔遗传规律的主效抗病基因。从1 9 0 5 年b i f f e n 的发现和l9 2 6 年抗 秆锈显性单基因品种c e r e s 育成并大面积在北美推广开始，r 基因时期一直持续到今天。在 此期间由于r 基因能够有效控制病害，而且很容易根据表型在早代进行选择，深受育种家的 喜爱，大量携带r 基因的抗病品种被投入到生产中。但是随着携带r 基因的抗病品种的推广 应用，出现抗病品种抗性丧失现象，从而暴露出r 基因抗性的缺点：抗性不持久。如1 9 3 4 年和1 9 3 7 年，小麦秆锈在北美地区大流行，主要原因就是以前育成的单基因抗病品种抗性丧 失，这可能是抗性品种“兴衰”大循环的序幕。英国的小麦抗条锈品种也存在品种抗性丧失 的问题( rj o h n s o n ，1 9 9 2 ) 。f l o r 的“基因对基因假说”从基因水平解释了r 基因抗性不稳 定的原因。该假说主要认为寄主的抗病基因和病原物的致病基因之间存在对应关系，即对应 寄主的抗病基因，病原物存在致病基因，随着携带特定抗病基因的抗病品种大面积连续种植 后，出现携带相应致病基冈的病原菌毒性生理小种，能够克服品种原有的抗性，使品种由抗 病转为感病，表现出抗性丧失现象。为了保持作物的抗性，育种家不得不断地更新抗性品种。 以我国建国以来至2 0 0 0 年期间为例，我国小麦品种因抗条锈性的丧失就有7 次大规模的更替， 见表1 1( 万安民，2 0 0 0 ) 。抗性品种的“兴衰”更替现象严重威胁着现代农业生产的稳定 性。研究表明使用r 基因的抗病品种一般在生产上推广后，慢则4 5 年，快则2 3 年就丧失 了抗病的能力( 李振岐，1 9 8 0 ；万安民，2 0 0 0 ；dr u b i a l e s 等，2 0 0 0 ) 。1 9 9 2 年就有两欧小麦 抗病育种学者提出，普通小麦中，在主效基因方面，西欧的白粉抗源已近用完，条锈抗源只 剩下几个，叶锈抗源还有几个基因未被利用：上世纪7 0 年代洛类抗源( 前苏联用小麦与黑麦 杂交得到的l b l 1 r s 易位系衍生物) 引入我国。由于它带有y r 9 ，l r 2 6 ，p m 8 和跏3 ，等4 个抗病基因，兼抗4 种重要病害，更由于其很好的丰产性而深受育种家喜爱，致使上世纪8 0 年代末生产上使用的品种9 0 的亲本含有该抗源。过度广泛地使用又一次造成抗源单一化( 虽 然这一次不是品种单一化) ，条中2 8 、2 9 号的出现，导致其抗性丧失。繁6 及绵阳系品种因 聚合了多种抗源而抗谱较宽较持久，整个2 0 世纪7 0 年代和8 0 年代抗性经久不衰，条中3 0 、 3 l 号的出现，导致其抗性丧失。2 0 0 3 年新条锈小种条中3 2 号致病范围更为广泛，对y r 9 和 3 东北农业大学农学博l j 学位论文 绵阳系列等绝大部分生产品种均有毒性。研究表明目前仅有y r 5 、y r l o 、y r l 5 和y r 2 4 、y r 2 6 、 y r 2 8 及一些抗病材料的抗性仍然有效，致使小麦生产出现抗源危机。因此，如何提高抗病品 种的抗性持久能力或者寻找持久的抗性引起了人们的关注。 近期，主要从j ev a n d e r p l a n k ( 1 9 6 3 ) 提出存在两种形式的抗性( 垂直抗性和水平抗性) 后，人们开始探索不同于r 基因的抗性，试图寻找能够持久的抗性。虽然在这方面的研究没 有r 基因的研究深入，但是在这一领域科学家还是取得了一定的进展。早在1 9 1 2 年美国学 者就曾对马铃薯抗晚疫病的数量抗性做出过报道；c a l d w e l l 是美国数量抗性研究方面的先驱 之一，他提出慢锈性可能是一种能够持久的抗性；美国学者的研究确认了小麦抗条锈病的微 效基因，不同于主效r 基因，为部分抗性奠定了遗传学基础；j ep a r l e v l i e t 等( 1 9 7 5 ) 为部分 抗性提出了一个可操作的定义，将数量抗性的研究推进了一大步，1 9 7 8 年他又通过精细的试 验，显示出大麦单个抗锈病微效基因作用微小但具有累加性的效应。国际玉米小麦改良中心 在5 0 年代后期开始强调使用持久抗病性，慢锈性的概念于7 0 年代初期被接受并应用于抗锈 育种( r ps i n g h 等，2 0 0 2 ) 。 顺着抗病育种的发展轨迹来了解抗病育种，可以使我们充分了解抗病育种在作物生产领 域的地位和重要性，因此提高非持久抗病性的持久能力或者寻找持久的抗性及如何有效进行 抗病育种工作对现代农业生产具有重要的实际意义。 表i 1 我国小麦品种抗条锈性丧失的情况 。t a b 1 一ll o s so fv a r i e t yr e s i s t a n c et os t r i p er u s ti nc h i n a 1 1 3 小麦抗条锈种质资源研究概况 由于寄主与病原物是两种具有密切生态关系但不交换基因的生物嵌合体，并通过这一生 态关系相互施加选择压力，经过长期的适应以及相伴的遗传变异，使得受害的寄主种群不被 排除，得益的病原物不能无限增殖，从而使病害控制在一定水平上，并维持一种相对的动态 平衡。正是由于寄主与病原物这种协同进化的生态关系，许多抗病育种者主张从作物起源中 心或传统地方品种中寻找抗性资源( fl a m b e r t i ，1 9 8 5 ) 。正如a s e g a i 等指出，“我l f j 马j i l 化作 物的野生亲属构成一个期望的多样性基因库，对它们的开发、利用和保存是迫在眉睫的需要” ( as e g a l 等，1 9 8 0 ) 。在现代农田生态系统中，作物群体的基因是由人类控制的。在长期的 4 前言 品种驯化过程中，趋向于排除作物的异质性而种植同质性的作物群体。在主要作物抗病性利 用中，大量的作物只利用了少数己知的抗病基因，这些抗病基因一般为专化抗病性基因，即 用低反应型来控制病害( m lj i l l i a n 等，1 9 9 1 ) 。据p e r s o n 和s i d h u 统计，现有植物抗病性遗 传研究中，近9 0 的事例都是单基因或寡基因遗传的。倾向于快速排除异质性和严格的同质 性作物群体与之联系在起，这已成为一种普遍接受的观念，因而使高度同质性作物的种植 在时间和空间上表现出前所未有的单一性。这一事实所产生的最严重问题，就是由于病原菌 产生可克服抗病基因的小种，从而造成病害的大范围流行。这种现象充分暴露出现代农业生 态系统中作物遗传基础的脆弱性。鉴于抗病基础单一化，高度同质性品种大面积种植造成抗 病品种兴衰循环愈演愈烈的严重局面，各国科学家都力图运用不同途径解决这一世界性难题。 目前普遍认为拓宽作物的遗传基础，增加抗源多样性，包括多种抗源的合理布局，同一品种 导入多个抗病基因，寻求高质量、高品位的抗病基因，综合运用作物的多种抗病机制等是克 服作物遗传基础脆弱性，使作物具有持久抗病性的有效途径( s dt a n k s l e y 等，1 9 9 6 ) 。许多 国家都把利用小麦起源种和近缘种的抗锈基因作为克服小麦抗锈遗传基础脆弱的战略。在一 些作物上已经成功的利用了野生种质资源来提高作物的品质，当然用来作为抗病资源也是重 要方面( h ts t a l k e r ，1 9 8 0 ) 。 育成品种、地方品种和大量的野生起源种是抗病育种的3 类主要种质资源。关于育成品 种和地方品种的报道较多，而对于野生种质资源利用的报道则较少，这一方面是由于收集保 存的材料有限，另一方面是因为在利用上存在很大的技术难度( m v lg o o d m a n ，1 9 8 5 ：陈钢 等，1 9 9 8 ) 。研究野生种质资源的抗病机制是利用野生种质资源拓宽作物的抗病遗传基础的关 键( ad i n o o r ，1 9 7 0 ；ad i n o o r ，1 9 7 7 ) 。就遗传方面而言，野生种质在与其病原菌协同进化 的过程中，形成了多种多样的抗病性。抗病性的遗传机制包括了小种专化抗性或称为垂直抗 性、t n , 种专化抗性或多基因抗病性、耐病性以及避病性。 尽管野生种质群体中存在多种类型的抗病性，但有关野生种质与病原物作用机制的研究 几乎都集中在专化抗病性上。进行卣期抗病性一专化抗病性鉴定的野生种质包括大麦、燕麦 及小麦对锈病和白粉病的抗病性、野生大豆对大豆锈病的抗病性、野生亚麻对麻锈病的抗 病性( m rf i n c k h ，1 9 9 2 ) 。在非专化抗病性的研究方面，以色列的野生二棱大麦具有慢粉 性，野生燕麦具有慢锈性。野生种质抗病性评价是利用的基础。一般抗病性评价都是通过采 集的样本进行的。如果掌握研究方法，野生种质小种专化抗性的评估可在人为条件下进行。 然而，非小种专化性却非常难以评估( m rf i n c k h ，1 9 9 2 ) 。评估仅限于对一些简单参数如 潜育期、病斑大小、产孢多少、产孢速率的测定，总体上对野生种质非专化抗病性的发生频 率或者遗传背景了解的很少。小麦对小麦锈病的抗性就属于其中一例。小麦与小麦锈病有着 漫长的协同进化历史，两者在漫长的进化历史中形成了多种多样的抗病性和致病性。各国学 者对小麦的种质资源进行了广泛的调查、搜集、保存、研究和利用工作。经研究发现，小麦 野生近缘种中存在大量的抗锈种质资源，是小麦抗锈基因的主要携带者。这些野生近缘种具 有多种抗病类型，既有植物即存的多种物理因素所决定的抗侵入机制，又有病菌侵入后所诱 发的多种保卫反应机制，如抗定殖、抗扩展、慢锈性和耐锈| 生等抗病机制。由野生近缘植物 向普通小麦转移这些外源抗锈基因，已成为提高小麦抗锈性的重要手段。 小麦抗条锈基因共有两类来源，一类来自普通小麦，另一类来自小麦的近缘属。在己报 5 东北农业大学农学博f ：学位论文 道的1 0 0 多个小麦抗条锈基因中，大部分基因来自普通小麦，来自小麦近缘种属的有：m 来自六倍体斯卑尔脱小麦，y r 7 来源于硬粒小麦，y r $ 来自顶芒山羊草，y r 9 是通过染色体代 换或易位从黑麦转移到普通小麦中的，y r l 5 来自四倍体野生二粒小麦，y r l 7 来自偏凸山羊草， y r l 9 ( y r c o m ) 可能来自在项芒山羊草与普通小麦中国春杂交过程中用来干扰同源染色体配 对的斯卑尔脱山羊草，y r 2 6 来源于四倍体圆锥小麦。凇4 和y r 2 8 米源于节节麦，我国八倍 体小偃麦中四和远中8 号携带的抗条锈基因可能是来自天兰偃麦草。而普通小麦品种原冬9 6 位于染色体4 d 上的抗条锈基因可能是由y 射线诱导的突变基冈。新发现的y r s p 来源于斯卑 尔脱小麦( 魏艳玲等，2 0 0 3 ) 。这些都是条锈病的良好抗源，研究利用的潜力很大。 因为新的条锈菌小种的不断出现，使从国外引进的大量抗源及其衍生后代的抗条锈性面 临丧失的威胁。为了扩大抗源的选择范围，我国的科研工作者开始把利用外源基因丰富小麦 的遗传基础、拓展其抗病基因库作为解决小麦品种抗病性丧失的重大战略措施。远缘杂交技 术、组织培养技术、染色体工程技术、外源染色体鉴定技术的不断改进和创新，染色体工程 基础材料的不断完善和充实，使野生近缘种质的抗病性利用已成为可能。目前已将多个l r 、 s r 和y r 基因由野生近缘植物导入普通小麦，大大丰富了小麦的抗锈基因库，但对这些野生 近缘种质资源及其杂交后代抗条锈性特点缺乏系统研究。 山羊草属是小麦近缘物种中与小麦亲缘关系最为密切的属，不仅抗逆性强，适应性广， 而且含有多种抗病基因，如抗白粉病基因、抗条锈病、叶锈病和秆锈病基因、抗眼斑病基因、 抗小麦条纹花叶病基因等。因此，山羊草属植物在小麦的遗传改