（农业昆虫与害虫防治专业论文）五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 磊 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究蚴：么凑为帆聊乡月夕日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和 电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者张苏凌为导懒：勿饩 签名哦嘲年；冠z 弘 签名喙州年扪b 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 摘要 实蝇( f r u i tf l y ) 泛指双翅目( d i p t e r a ) 、实蝇科( t e p h r i t i d a e ) 、果实蝇属 ( b a c t r o c e r a ) 昆虫，是危害水果和蔬菜的重要害虫类群。目前，已有6 4 个国家 和地区不同程度地将实蝇列为植物检疫危险性害虫，并采取了严格的检疫措施， 实蝇的分类与鉴定研究也受到了世界各国的高度重视。 本研究以我国常见的五种检疫性果实蝇为研究对象，采用r p a d 技术、i s s r 技术，并利用m t d n ac y t b 基因片断对实蝇的系统发育和分子鉴定进行了研究。 主要研究结果如下： 1 利用目前常用的6 种d n a 提取方法，如c t a b 法、s d s 法等，提取酒精 浸泡保存的实蝇标本的基因组d n a 。根据所提取的实蝇基因组d n a 的浓度和质 量，确定出最佳的d n a 提取方法为氯仿，异戊醇抽提法。 2 对实蝇r a y d p c r 体系进行了优化，建立了适于实蝇r a p d 分析的p c r 反应体系：在2 5 p l 反应体系中，模板d n a 用量为8 0 n g ，m g c l 2 浓度为2 0 m m ， 四种d n t p 浓度各为0 2 m m ，t a q 引物浓度为0 靴m ，酶用量为1 u 。扩增程序： 先9 4 预变性3 m i n ；再9 4 变性4 5 s 、3 6 退火1 r a i n 、7 2 延伸2 r a i n ，共4 0 个循环；最后延伸1 0 m i n 。在此基础上，从4 0 条引物中筛选出稳定性好、多态 性高的1 0 条随机引物，共扩增出3 1 6 条谱带，所获片段大小为1 0 0 2 5 0 0 b p ， 并利用扩增谱带区分不同种类的实蝇。根据d i c e 遗传距离得出五种实蝇间的遗 传聚类结果：具条实蝇b s c u t e l l a t a 、瓜实蝇b c u c u r b i t a e 与南瓜实蝇b t a u 聚为 一枝，然后再和桔小实蝇b d o r s a l i s 聚在一起，最后与亲缘关系较远的柑桔大实 蝇r m m a x 相聚，这与传统分类所提出的亲缘关系基本一致，也表明利用r a p d 技术能够把不同种的实蝇区分开来。 3 首次利用i s s r 技术对实蝇的系统发育关系进行了研究。构建了实蝇的 i s s r p c r 反应的最佳体系，并从3 0 条i s s r 引物中筛选出8 条稳定性好、多态 性高的引物。根据i s s r 扩增图谱构建了五种实蝇的u p g m a 聚类图，并进行了 五种实蝇的鉴别研究，结果表明i s s r 是一种稳定的分子标记技术，能够用于实 蝇的系统发育及分子鉴定研究。 4 对柑桔大实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、桔小实蝇、具条实蝇五种实蝇m t d n a c y t b 基因进行了克隆、测序。在获得的4 2 0 b p 的序列片断中有1 2 8 个位点为多 态性位点，从中筛选出稳定的2 0 个变异位点作为五种实蝇的信息鉴别位点，并 采用邻接法( n j ) 和未加权组对算术平均法( u p g m a ) 构建分子系统发育树， 结果表明：筛选出来的变异位点能够成功的区分出五种实蝇；而用两种方法构建 的系统树结果基本一致。瓜实蝇、南瓜实蝇和具条实蝇先聚在一起，然后和桔小 实蝇聚为一枝，最后再与柑桔大实蝇相聚。 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 本论文利用三种分子标记对五种实蝇进行了分子系统发育与分子鉴定研究， 研究方法快速准确，对其它实蝇的分类与鉴定研究也具有一定的参考价值，为构 建检疫性实蝇的快速分子鉴定体系奠定了基础。 关键词：实蝇；系统发育；分子鉴定；r a p d ；t s s r , 线粒体d n a c y tb 2 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 a b s t r a c t f r u i tf l yi so n eo ft h ef a l n j l e so fd i p t e r a , b e l o n gt ob a c t r o c e r aa n dt e p h r i t i d a e ， m a k eas e r i o u sd a m a g eo np r o d u c t i o no ff r u i t sa n dv e g e t a b l e s n o w a d a y s ，f r u i tf l y a r er e g a r d e da sak i n do fs e r i o u sp e s t sb y6 4c o n t r i e sa n da r e a s m a n yg o v e r n m e n t s a d o p t sas e r i e so fs c d o u sq u a r a n t i n em e t h o d st oa v o i dt h ei n t r o u c a t i o no ff r u i tf l i e s a n dp a ym o r ea t t e n t i o nt ot h e i rc l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n i nt h i ss t u d y , f i v es p e c i e so ff r u i tf l i e sa r er e s e a r c h e d b ym e t h o d so fr a p d 、 i s s ra n dp a r t i a lm t d n ac y t b s e q u e n c e sa n a l y z e d , s t u d i e s o nt h em o l e c u l a r p h y l o g e n e t i ca n dm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o no ff r u i tf l i e sw e r ec a r r i e do u t t h er e s u l t s a l ef o l l o w s ： 1 。g e n o m i cd n ai nf r u i tf l i e s ( s t o r e di na l c o h 0 1 ) w a se x t r a c t e db ys i xm e t h o d s ， s u c ha sc t a ba n ds d s w ea n a l y s e dt h ec o n c e n t r a t i o na n dq u a l i t yo fd n ae x t r a c t e d b yd i f f e r e n tm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s tm e t h o di sh y d r o x y b e n z e n e c h l o r i n e 2 a no p t i m a lp c rs y s t e mf o rr a p di nf r u i tf l i e sh a sb e e nf o u n d ：i n2 5 m l r e a c t i o ns o l u t i o n ，c o n t a i n e d8 0 n gd n a t e m p l a t e ，2 0 m mm g z + ，0 2 m md n t p , 0 劫m p r i m e r s 1 ut a qp o l y m e r a s e t h ea m p l i f i c a t i o np r o g r a mw a sd e v i s e d ：9 4 f o r3 r a i n ； d e n a t u r i n ga t9 4 。cf o r4 5 s e e ，p r i m e ra n n e a l i n ga t3 6 cf o rl m i n ，e x t e n s i o na t7 2 c f o r2 m i n , 4 0 c y c l e s m ，a tl a s te x t e n s i o na t7 2 cf o r1 0 r a i n t h e nt e np r i m e r sw e r e s c r e e n e df r o m4 0r a n d o mp r i m e r sa n da m p l i f i e d3 1 6b a n d s ( f r o m1 0 0 b pt o2 5 0 0 b p ) t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew e r ec o n s t r u c t e db a s e do nd i c eg e n e t i cd i s t a n c e i nt h e p h y l o g e n e t i ct r e e ，b s c u t e l l a t a ，b c u c u r b i t a ea n db t a uc l u s t e r e dt o g e t h e r , t h e nt h e y c l u s t e r e dw i t hb d o r s a l i si n t oo n eg r o u p ，a n dc l u s t e r e dw i t hb m i n a xa tl a s t a l lt h e s e r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tr a p di ss u i t a b l ef o ra n a l y s i so fp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p s a m o n gf r u i tf l i e s 3 i ti st h ef i r s tt i m et h a tf r u i tf l i e sw a sr e a s e r c h e db yi s s r w eh a sb e e nf o u n d a l lo p t i m a lp c r s y s t e mf o ri s s ri nf r u i tf l i e s t h e ne i g h tp r i m e r sw e r es c r e e n e df r o m 4 0i s s rp r i m e r s t h ep h y l o g e n e t i ct r e eo ft h ef i v ef r u i t f l i e sw e r ec o n s t r u c t e dw i t h m e t h o do fu p g m a , a n di d e n t i f i e dt h e mb ya m p l i f i e db a n d s a l lt h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a ti s s ri s s u i t a b l ef o ra n a l y s i st h ep h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p sa n d i d e n t i f i c a t i o na m o n gf r u i tf l i e s 4 t h em t d n a c y t bg e n e so f5f r u i t f l ys p e c i e s ，i n c l u d i n gb a c t r o c e r ad o r s a l i s ， b c u c u r b i t a e ，b c o r r e c t a ，b t a u ，b s c u t e l l a t a a n da n db m i n a xw e r ec o l o n e da n d s e q u e n c e d t h es e q u e n c ed a t ar e v e a l e dc o n s d e r b l ev a r i a t i o ni n1 2 8n u c l e o t i d es i t e s 3 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 a m o n gt h es e q u e n c e sa n a l y z e d ，t h e ng e t2 0s i t e st oi d e n t i f yd i f f e r e n ts p e c i e s a m o l e c u l a rp h y l o g e n e f i ct r e ew a sc o n s t r u c t e db yu s i n gn e i g h b o rj o i n i n g ) a n d u n w e i g h t e dp a i rg r o u pm e t h o dw i t h a r i t h m e t i cm e a n ( u p g m a ) m e t h o d o l o g i e s t a l l t w op h y l o g e n e t i ca n a l y s i sg e n e r a t e ds i m i l a ra f f i n i t i e s ，t h ec o n g e n e r sb c u c u r b i t a ea n d b t a uc l u s t e r e dw i t hb s c u t e l l a t a , t h e nc l u s t e r e dw i t hb d o r s a l i s , a t 、a s tc l u s t e r e d 且m n a x t l l i st e x th a sc a r r i e do nr e s e a r c ht ot h em o l e c u l a rp h y l o g e n e t i ca n dm o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o no ff r u i t f l i e sb yt h r e ed i f f e r e n tm o l e c u l a rm a r k e r s a tt h es a m et i m e ， t h e s em e t h o d sc o u l db ec o n s u l t e di nt h ei d e n t i f i c a t i o no fo t h e rf r u i tf l i e s s o ，t h es t u d y c o u l dc o n s t r c u c t e dt h ef u n d m e n t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c h k e yw o r d s ：t e p h r i t i d a e ；p h y l o g e n e t i c ；m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ；r a p d ；i s s r ； m t d n a c y t b 4 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 刖昌 昆虫种类繁多、分布广泛，是世界上最昌盛的动物类群。长期以来，对大多 数昆虫的记录、分类和识别主要靠形态特征，因为外部形态比较直观，容易观察 与研究。这些分类依据在高级分类阶元内往往能清晰的反映一个物种的分类地 位，然而在较低级分类阶元，如种、亚种内，则很难确定物种的分类地位，对于 种群、生态型的研究就更加局限了。因此，有必要对昆虫的分类进行更深入的研 究。 昆虫分子系统学是以分子生物学为实验手段，研究昆虫分类鉴定、类群遗传 结构、系统发育和分子进化的学科。二十世纪七十年代，随着限制性内切酶的发 现、d n a 重组技术的建立、d n a 洋列快速测定方法的发明，以及聚合酶链式反 应( p c r ) 技术的产生，大大推动了分子生物学及其技术的迅猛发展。分子生物 学技术应用于昆虫系统学研究中，往往通过研究昆虫核酸分子的结构来探求各类 群之间的亲缘和进化关系，从生命的本质上寻找昆虫各类群之间的内在联系( 成 越新等，2 0 0 0 ) 。这就弥补了形态分类的不足，对形态分析起到很大的补充作用， 极大的促进了昆虫分子系统学的发展。同时，以基因为基础的分子标记得以迅猛 发展，被广泛应用于系统分类、遗传图谱构建和种类鉴定等方面的研究。总之， 以分子生物学为手段，进行昆虫系统学的研究已经成为昆虫学领域的研究热点。 1 昆虫分子系统学研究进展 1 1 研究对象 由于核酸( d n a 和鼢渔) 含有丰富的生物学信息，记载了生物进化的历史， 随着p c r 技术的发展和d n a 测序技术的成熟，应用d n 蜥记和d n a 序列研究生 物的系统发育和进化规律成为当前分子系统学研究的热点( 刘殿峰等，2 0 0 5 ) 。 然而，生物基因组数量相当庞大，无法进行全面的序列分析，需要针对基因组中 个别特征基因片段进行重点研究。因此，选择合适的分子标记片段是昆虫分子系 统学研究的关键所在。 目前，应用于分子标记基因种类很多，其中以线粒体d n a ( i i t o c h o n d r i a l d n a ，m t d n a ) 、核糖体d n a ( r i b o s o m a ld n a ，r d n a ) 为主( c r o z i e r ，1 9 8 9 ； d e s a l l e ，1 9 9 2 ) 。 1 1 1 核糖体d n a ( r d n a ) 生物的性状基本上是由核基因决定的，核基因中含有丰富的生物学信息，用 适当的核基因研究昆虫的系统发育，其结果更有可能比较真实地反映出昆虫的进 化历史( 刘殿锋等，2 0 0 5 ) r d n a 是以串联多拷贝形式存在的中度重复的d n a p 笋列，主要功能是编码核 5 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 糖体r n a 。t a u t z 等( 1 9 8 8 ) 研究发现，昆虫细胞中r d n a 每个重复单位由非转录 间隔区( n o n - t r a n s c r i b e ds p a c e r ，n t s ) 、转录间隔区( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ， r r s ) 和3 种r n a ( 1 8 s 、5 8 s 、2 8 s r 时q a ) 基因编码区组成，结构如图1 。 1 8 s 5 8 s 2 8 s n 稿i t s i 1 n t s l 图1r d n a 的结构示意图 ( s t r u c t u r edr i b o s o m a ld n a ) r d n a3 个区域的d n a i 拄化速率各有不同，因此，在进行系统发育研究时， 不同区域的r d n a 适用于不同阶元类群关系的研究。 1 8 sr d n a 是昆虫分子系统发育研究中应用最多的标记基因之一，因为其大 小适中，长约2 k b ，既能提供足够的信息，又便于实验室操作，适于高级分类阶 元和远缘物种关系的分析，以及推断早期的进化事件。f l o o k 和r o w e l l ( 1 9 9 8 ) 利用1 8 sr d n a 基因序列，重建传统的古翅亚部( p a l a e o p t e r a ) 和新翅亚部 ( n e o p t e r a ) 昆虫的系统发育，其结果表明直翅目是单系群。m a r v a l d i 等( 2 0 0 2 ) 则利用1 8 sr d n a 序列数据分析了象甲总科( c u r c u l i o n o i d e a ) 各科之间的系统发 育关系，并构建了系统发育树。 2 8 sr d n a 长约4 5 k b ，可为系统发育分析提供大量信息，但由于其在进化 过程中比较保守，所以主要应用于昆虫高级分类阶元的系统进化研究。目前利用 2 8 sr d n a j 差_ 行研究的有半翅目( d i e t r i c h e t a l ，2 0 0 1 ) 、蜚蠊目( m u k h a e t 以， 2 0 0 2 ) 、膜翅目( 李芳芳等，2 0 0 3 ) 。 5 8 sr d n 蝴码真核生物大亚基特有的r r n a ，由于其序列长度太短( 约 1 0 0 b p ) ，提供的信息太少，所以在系统发育的研究中应用较少。 i t s 区一般在昆虫中全长约1 1 5 k b 左右，进化速度比较快，主要被用于研究近 缘种或低级分类阶元的系统发育，如利用i t s 探讨不同种间或种群间的亲缘关系。 p o r t e r 等( 1 9 9 1 ) 及p a s k e w i t z ( 1 9 9 3 ) 等分别将i t s 片段用于双翅目按蚊科复合种 的系统发育分析中；w e e k e r s 等( 2 0 0 1 ) 用i t s 序列探讨了西地中海沿岸和西欧的 c a l o p t e r y x 属蜻蜒之间的系统发生关系；m u c c i o 等( 2 0 0 0 ) 用i t s 2 研究了双翅目 d i p t e r a e 蛉属p h l e b o t o m u s 的l a r r o u s s i u s v i 属6 个代表种和p h l e b o t o m u s j i e 属1 个代 表种之间的系统发生关系。 目前，r d n a 已经在系统发育的研究中得到了广泛的应用，但还有一些问题 有待进一步解决，如怎样选取适合的序列片断：不同算法得到的结果如何统一等 ( 刘伟，1 9 9 8 ) 6 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 1 1 2 线粒体的d n a ( m t d n a ) 线粒体d l q a 于1 9 6 2 年- 由n a s s 等发现，此后，在其结构、组成、复制、转录、 基因表达及调控等方面已经累积了大量资料( b r o w ne ta 1 ，1 9 8 3 ) 。人、小鼠、 牛、非洲爪蟾、果蝇和海胆的m t d n a 全序列已经清楚。有关线粒体d n a 的进化 生物学和分类学中的应用资料更为丰富。近十年来，线粒体越来越受到分子遗传 学和进化遗传学家的重视，并取得了很多成果。 昆虫m t d n a 是双链( h 链和l 链) 超螺旋环状分子，分子大小为1 5 4 - 1 6 3 k b ( 王备新等。2 0 0 2 ) ，其编码基因排列紧 密，染色体上遗传重组。昆虫m t d n a 3 t ：编 码3 8 个基因：1 3 个蛋白基因或亚基编码基 因，2 个核糖体r n a ( 1 2 s r r n a 、： 1 6 s r r n a ) ，2 2 个t r n a 基( c y t b ) 因和一 段非编码基因的a + t 富集区( a + t - r i c h 区) 。其中蛋白质编码基因包括：细胞色 素b 基因、2 f - a t p 酶的亚单位( a t p a s e 6 、 a t p a s e 8 ) 基因、3 个细胞色素c ( c y t c ) 氧 化酶的亚单位( c o l 、c o i i 、c o i i i ) 基因、 n a d h 氧化还原酶的7 个亚基基团( n d i 、 2 田2 钱粒体d n a 结构示意例 ( s “t k i u 忙o fm i t $ c h o a d i dd n a ) n d 2 、n d 3 、n d 4 、n d l 、n d 5 和n d 6 ) 基因( 鲁成等，2 0 0 2 ) ( 图2 ) 。 昆虫m t d n a p f 歹i j 是研究属、种问系统发育较好的分子标记。由于m t d n a 不 同区段基因序列的进化速度不一样，因此选取m t d n a _ 上的不同基因或片断序列， 可以进行不同分类水平的进化研究。对于亲缘关系较远的物种，一般选取压力大、 比较保守的基因序列；对于亲缘关系较近的物种，则选取选择压力小，进化较快 的基因序列。 目前，已对果蝇d r o s o p h i l a y a k u b a ( c l a r y ，1 9 8 5 ) 、飞衄_ , o c u s t a m i g r a t o r i a ( f l o o k e t a l ，1 9 9 5 ) 等1 6 种昆虫的m t d n a 作了全序列测定( 陈复生等，2 0 0 4 ) 。 仅在鞘翅目中，进行过m t d n a 多态性分析的类群，就有1 3 科3 2 属2 0 0 余种( 代金 霞等，2 0 0 3 ) 。 1 1 3 其它基因 1 1 3 1 核蛋白编码基因 在系统发育研究中核蛋白编码基因的应用远少于m t d n a 和r d n a ，是其中有 部分核蛋白编码基因被用于分子标记基因。延长因子e f 2 1 q ( e l o n g a t i o n f a c t o r 2 1 a l p h a ) 是应用最多的一种分子标记基因，研究表明，它的序列对种和科( 亚科) 7 五种实蝇的分子系统发育分析与分子抉速鉴定研究 内属的研究上特别有用。但是由于e f 2 1 a 内的氨基酸高度保守以及第3 密码子位 置编码所有系统发育主要信息，r e g i e r 等( 1 9 9 8 ) 研究发现氨基酸的变化可能与 目与目之间甚至更高水平的信息有关联。此外，d d c 、9 6 p d h 、h b 、p e r 、p e p c k 和 w g 等非单拷贝核基因也较广泛应用于昆虫系统发育研究，a d h 基因仅见用于果蝇 科的研究。虽然核蛋白编码基因有多拷贝、大内含子等限制应用的障碍，但这些 问题正逐渐被新技术所克服。 1 1 3 2 卫星d n a 和微卫星d n a 卫星d n a 进化速率高，序列通常具有种的特异性，卫星d n a 可通过序列扩 增，不等交换，点突变和基因交换而发生变化。研究发现，仅有少数例子证明在 整个属内有相同的卫星d n a 序列，在许多属中，卫星d n a 可用于种的鉴别。微 卫星d n a 则可用于产生d n a 指纹来进行近缘种或生物种的进化研究。 随着生物分子学的发展，越来越多的基因被运用到分子系统发育学的研究。 1 2 研究方法 1 2 1 蛋白质电泳 蛋白质可以在凝胶的电场中得到分离，其分离带可通过染色而观察到 ( m u r p he la 1 ，1 9 9 0 ；m a y ，1 9 9 2 ) ，而凝胶上的分带类型可以从基因及其等位 基因得到解释( m a y ，1 9 9 2 ) 。蛋白质电泳是从分子水研究昆虫系统进化的有效 手段，通过对电泳图谱分析，可以有效的揭示自然种群的遗传结构、基因流动、 选择作用和系统发育关系等问题。 在昆虫系统学运用比较广泛的是等位酶和同功酶：c a c c o n e 等( 1 9 8 7 ) 通过 对等位酶变异分析研究了北美洞穴蟋蟀的种间和居群间的变异和扩散。雷朝亮等 对南方小花春和微小花春酯酶网工酶进行了比较研究( 雷朝亮等，1 9 8 9 ) 。f o l e y 等( 1 9 9 3 ，1 9 9 4 ) 利用同功酶研究南太平洋地区按蚊a n o p h e l e s p u n c t u l a t u s 复合 体种类组成时，发现了新种，并编制了电泳特征检索表。其它运用到蛋白电泳技 术的还有小赤眼蜂( p i n t o ，1 9 9 2 ) 、各种蚜虫( c a s t a n e t e t a l ，1 9 8 3 ；l o x d a l e e t a l ， 1 9 8 3 ：m e s h e l o f f e t a l ，1 9 9 0 ：p u t e r k a e t a l ，1 9 9 3 ) 、果蝇( f e d e r e t a l ，1 9 8 9 ) 、 松夜蛾( w a i n h o u s e e t a l ，1 9 9 8 ) 等。 1 2 2 限制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) d n a 经限制性内切酶消化后所产生的d n a 片段大小和数量，可以快速和廉 价的提供有关序列趋异的信息( d o w l i n ge ta 1 ，1 9 9 0 ) r f l p 就是应用限制性 内切酶切割不同类群个体的基因组d n a 或某一基因，产生不同长度限制性片段， 8 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 根据酶切图谱，计算类群之间的遗传距离，构建系统树。通常用于r f l p 研究的 是线粒体基因组d n a ( m t d n a ) ，因为昆虫的m t d n a 较小，基因结构较清楚， 用限制性内切酶切割后可直接进行分析。 目前，大多数昆虫m t d n a 的r f l p 研究都是在种内或近缘种进行，高级阶 元的分析较少。p i a u 等( 1 9 9 9 ) 对蜉金龟科两个近缘种的m t d n a 进行了r f l p 分析，阐明了物种釉群内和种群间在分子水平上的差异。s u z u k i 等( 2 0 0 4 ) 在对 萤科的l u c i o l al a t e m l i s2 个生态型的c o i i 基因进行r f l p 分析时，显示快速闪 烁型是比较原始的类型，慢速闪烁型代表了较进化的类型。其它运用r f l p 方法 进行系统学研究的还有双翅目中的果蝇科( h a y m e r ，1 9 9 4 ) 、膜翅目的蜜蜂科 ( s m i t h ，1 9 9 0 、1 9 9 1 ；h a l l ，1 9 9 0 、1 9 9 2 ) 和胡蜂科( s c h m i t z ，1 9 9 0 ) 、同翅 目中的各种蚜虫、直翅目中的蝗科和蜢科( c o l g a n ，1 9 9 1 ；c h a p c o 甜a l ，1 9 9 2 a 、 b ，1 9 9 4 ) 和鳞翅目的夜蛾科( i me t a l ，1 9 9 2 ) 等。 1 2 3 随机扩增多态性d n a ( i h n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i c d n a ， r a _ p d ) 1 9 9 0 年，w i l l i a m s 和w e l s h 两个研究小组同时发明了一种d n a 分子水平上 的大分子多态性检测技术一随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 。其理论依据是：不 同物种的基因组中与引物相匹配的核苷酸序列的空间位置和数目都有可能不同， 所以，扩增产物的大小和数目也有可能不同，其差异可以通过凝胶电泳显示。 r a p d 技术快速、灵敏、程序简便，是一种有效的遗传多样性的检测手段。 b l a c ki v 等( 1 9 9 2 ) 首先将r a i d 技术运用于4 种蚜虫的鉴别比较，他们采 用4 种1 0 个碱基的随机引物对4 种蚜虫进行了r a p d 反应，检测了它们扩增产 物的多态性，明确地区别出4 个种。随后，p u t e r k a 等( 1 9 9 3 ) 利用r a p d 技术 对俄罗斯小麦蚜虫进行了系统析；k a m b h a m p a t i 等( 1 9 9 2 ) 将r a p d 技术用于鉴 定和区别蚊子的种和种群；s t e v e n s 等( 1 9 9 6 ) 根据r a p d 分析鉴别蝇类种群的 遗传结构。目前，r a p d 技术已经在伊蚊( k a m b h a m p i f i ，1 9 9 2 ；b a l l i n g c r - c r a b t r e e ， 1 9 9 2 ) 、按蚊( 王学忠，2 0 0 0 ) 、寄生蜂( e d w a r d s ，1 9 9 3 ) 、粉虱( g a w e l ，1 9 9 3 ) 、 果蝇( 陈燕茹，1 9 9 7 ) 、玉米螟( 孙姗，2 0 0 0 ) 、蟋蟀( 田英芳，2 0 0 1 ) 、瓢虫( 张 迎春，2 0 0 2 ) 等的系统学研究方面等得到了广泛的应用。 1 2 4 简单序列问重复扩增( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 1 9 9 4 年，z i e t l d w i c z d 创建了一种新的分子标记，即简单重复序列问分子标 记( i s s r ) ，其基本原理是以加锚的s s r 寡聚核甘酸作为引物，对位于反向排列 且间隔不大的s s r 之间的d n a 序列进行p c r 扩增，然后进行电泳、染色，根 据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间i s s r 标记的多态性。该技术具有 9 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 如下特点：1 快速、简便、成本低，无需预先克隆和测序；2 稳定性和可重复性 高。i s s r 技术锚定s s r 序列的5 或3 末端2 4 个随机选择的核苷酸作为引物， 以靶定基因组上与锚定的核苷酸匹配的位点，避免引物在基因组上的滑动，增强 了p c r 扩增反应的专一性；3 i s s r 引物具有通用性。i s s r 引物可基于任何在微 卫星位点发现的s s r 重复单元( 2 、3 或4 个核萤酸等) ，并且侧翼靶标简单序 列重复的任何一端均能够锚定基因组序列。有鉴于这些优点，i s s r 技术已经广 泛应用于植物的品系鉴定、基因定位、遗传图谱构建和系统发育，但在昆虫学的 系统发育研究中，应用的相对较少。k u m a r 等( 2 0 0 1 ) 用i s s r 方法评估了2 8 个印度水稻害虫种群的遗传变异程度。戴凌燕等( 2 0 0 4 ) 利用i s s r 技术研究了 中国棉铃虫不同地理种群间的基因流动情况。 1 2 5 单链构象多态性分析( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o n a l p o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 和双链构象多态性分析( d o u b l e - s t r a n d c o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ，d s c p ) 单链构象多态性s s c p 和双链构象多态性分析d s c p 的基本原理相似，都是 由于突变，引起d n a 分子的双螺旋构象的改变，导致它们在聚丙烯酰胺凝胶中 电泳速度发生变化。通过s s c p 和d s c p 分析，可检测d n a 特定片段的分子变 异情况( 成跃新等，2 0 0 0 ) 。这两种方法不仅经济、简便、稳定，其灵敏度也受 到了研究者们的广泛关注。 h i s s 等( 1 9 9 4 ) 首次将s s c p 应用于昆虫，对8 种叶蝉、5 种蚊子、2 种寄 生蜂及6 种螨的线粒体中的核糖体r n a ( r r n a ) 进行了s s c p 分析，证明了s s c p 是一种很好的种群遗传分析手段。s c d l i m e r 等( 2 0 0 0 ) 用s s c p 分析法研究了步 甲属o r i n o c a r a b u s 亚属的进化关系；李石柱等( 2 0 0 3 ) 对多斑按蚊复合组5 个成 员种进行了s s c p 分析，结果显示电泳图谱具有种特异性，可用于鉴别不同蚊种。 a t k i n s o n 等( 1 9 9 7 ) 则把d s c p 应用在自蚁种群的研究中，并通过双翅目果蝇和 膜翅目蚂蚁验证了d s c p 分析的有效性。 1 2 6 d n a 序列分析 d n a 序列分析就是通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺 序，构建分子系统发育树，并推断类群间的系统演化关系( 成跃新等，2 0 0 0 ) 。 由于该分析方法是直接从研究对象的遗传信息入手，因此，大多数研究者认为该 方法是目前进行分子进化及系统发育研究最有效、最可靠的方法。目前，用于测 序的技术主要有两种：s a n g c r 发明的双脱氧链末端终止法和m a x a m 与g i l b e r t 发明的化学降解法。这两种方法在原理上有较大差异，但都是根据核苷酸在某一 固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生a ，t ，c ，g 四组不同 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的p a g e 胶上电泳进行检测，从而获得 d n a 序列。 随着分子生物学技术的发展，对d n a 直接测序，然后进行序列对比，已经 成为遗传分析的一种常规手段，越来越广泛的应用到了昆虫学的各个研究领域 中。c a c c o n e 等( 2 0 0 1 ) 对7 种鞘翅目昆虫m t d n a 进行了序列分析，研究了甲 虫穴居生活的分子地理学。k o b o y a s h i 等( 2 0 0 0 ) 对瓢甲科( c o c c i n e l l i d a e ) 的瓢 虫e p i l o r c h n av i g i n t i 种群内个体的c oi 基因进行了序列分析，结果表明该种群 分化成两个遗传上不同的种团。大量研究也证实了d n a 序列分析的准确性和精 确性。 1 2 7 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o p h i s m ，a f l p ) 1 9 9 3 年，v o s p 和z e b e a u m 发明了的一种新的d n a 指纹技术，即a f l p 。 其基本原理是：通过对基因组d n a 酶切片段的选择性扩增来检测d n a 酶切片 段长度的多态性。a f l p 是限制性酶切与p c r 结合的一种技术，因此兼具r f l p 技术的可靠性和p c r 技术的高效性，可以在一个反应内检测大量限制性片段， 为不同来源和不同复杂程度基因组的分析提供了一个有力的工具。该技术所需的 样本d n a 量少，不需s o u t h e r n 杂交，实验结果稳定，重复性好，多态性强，在 遗传多样性分析、种质鉴定、分子系统学研究中得到了广泛的应用。r e i n e k e 等 ( 1 9 9 9 ) 运用a f l p 技术对鳞翅目昆虫中的毒蛾科遗传多样性和种群结构进行了 研究：5 个a f l p 引物扩增9 8 个样品后，检测到了4 8 1 个多态性和5 8 个单态性 片段；通过a f l p 分析，揭示了特定遗传变异的存在，可能是由于种群的历史瓶 颈效应和外界环境因素所导致的多态性的积累。 1 2 8 其它方法 除了上述方法外，还有分子杂交技术、简单序列重复( s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ，s s r ) 即微卫星d n a 标记、d n a 指纹( d n a f p ) 图谱技术、m r n a 差别 显示p c r ( m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a t i o n ， d d r t - p c r ) 技术等等。随着分子生物学技术的发展，越来越多、越来越先进的 分子标记手段不断涌现，也被昆虫学家广泛的运用到昆虫系统进化、近似种的区 分、种群遗传结构及分化、生态特性和行为( 迁移扩散、生态入侵、领地扩展) 等研究领域。 总之，分子生物学的发展和昆虫遗传多样性研究技术的不断完善，为进一步 研究昆虫的系统发育研究开拓了更广阔的前景。但我们也必须认识到，上述分子 学方法都是从特定的角度或特定的层次进行研究，各有其优点和局限性，应用时 1 1 五种实蝇的分子系统发育分析与分子快速鉴定研究 应根据研究目的，选择合适的方法。我们在进行系统进化研究时，应将分子遗传 多样性分析结果与物种形态、生理特征、生态环境及地理分布等因素综合起来考 虑，才能得到比较准确的结果。 2 实蝇的研究现状 实蝇是隶属于双翅目( d i p t e r a ) 、实蝇科( t e p h r i t i d a e ) 的昆虫，本科昆虫是 双翅