（农药学专业论文）半夏、银杏指纹图谱的研究.pdf

摘要 本论文主要以贵州省中药材半夏、中成药银杏叶片生产原料、中间体及成 品为研究对象。 收集了贵州省的半夏样品，采用高效液相色谱法进行了半夏中总生物碱的含 量测定、乌苷含量测定、水溶性成份的指纹图谱研究。对贵州省不同产地及贵州 某半夏药材g a p 种植基地的药材质量进行了考察，并对贵州省某半夏g a p 种 植基地的药材的动态质量进行了初步研究。本研究建立了中药材半夏的质量评价 方法，能为科学评价中药材的质量作出了有意义的探索。 通过与贵州信邦制药股份有限公司合作，并在本课题组前期工作的基础上， 针对中成药银杏叶片生产过程中采用的新原料、中间体、成品进行一系列的质量 控制的研究。研究结果表明其采用新原料进行生产是可行的，其质量完全达到生 产要求。采用l c m s 的方法研究了全国不同生产厂家的银杏叶片成品的指纹图 谱，并对银杏黄酮、银杏内酯指纹图谱的部分化学成分进行了归属。 最后，综述了近年来国内外有关半夏中药材在化学、分析方法和药理活性等 方面的文献报道研究进展。 关键词：半夏；银杏；h p l c ；指纹图谱：质量控制；银杏叶片；总生物碱； h p i ，c ，m s 。 资金来源：贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目一黔省专合字 2 0 0 5 2 4 9 】 a b s t r a c t t h ip a p e ri sm a i n l ya b o u tt h er e s e a r c ho nt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n a lm a t e r i a l p i n e l l i at e r n a t aa n d r a wm a t e r i a l s 、i n t e r m e d i a t e s 、f i n i s h e dp r o d u c t so f g i n k g ob i l o b a t a b l e ti ng u i z h o up r o v i n c e t h e r es a m p l e so ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n a lm a t e r i a l sp i n e l l i at e r n a t ew e r e c o l l e c t e di nd i f f e r e n t r e g i o n s a n dd i f f e r e n th a r v e s tt i m e s t h em e t h o do f h p l c f i n g e r p r i n tw a t e r - s o l u b l ec o n s t i t u e n t so fp i n e l l i al e r n a t ew a se s t a b l i s h e d ，a n d t h em e t h o do fc o n t e n t sd e t e r m i n a t i o no ft o t a la l k a l o i da n dg u a n i n ei nt r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n a lm a t e r i a l sp i n e l l i at e r n a t ew a se s t a b l i s h e d a d d i t i o n a l l y , t h ei n i t i a l r e s e a r c h o nd y n a m i cs t a t eq u a i t yo ft h eg a pg r o w t hb a s eo f p i n e l l i a t e r n a t a i sd e v e l o p e d m e t h o dt oa s s e s st h eq u a l i t yo fp i n e l l i at e r n a t aw e r ee s t a b l i s h e d t h e r e s u l t sp r o v i d e daf i r mb a s i sf o re v a l u a t i n gt h eq u a l i t y & t h em e d i c i n a lh e r b b a s e do nc o o r p e r a t i o nw i t hx i n b a n gc o l t d ( g u i z h o u ，c h i n a ) a n di n v e s t i g a t i o n a t t a i n e db e f o r eb yo u rt e a m ，o u ra t t e n t i o nw a sp u tt oas e r i e so fq u a l i t yc o n t r o lt o m a t e r i a l s ，e x t r a c t sa n de n d p r o d u c t si nt h em a n u f a c t u r i n gp r o c e s s t h ec o n c l u s i o ni s t h a ti ti sr e l i a b l et ou s en e w l ym a t e r i a l si nt h ep r o c e s sa n dt h ep r o c e s sq u a l i f i e dt ot h e r e q u i r e m e n to fp r o d u c t s a tt h es a m et i m e ，t h ef i n g e r p r i n to fp r o d u c t sr e f e r r i n gt o g i n k g ob i l o b af r o md i f f e r e n tf i r m sa r o u n do u rc o u n t r yw a sa n a l y s t e db yl c m s ，a n d t h em e d i c i n a lm a t e r i a lo fc h a r a c t e r i s t i cp e a k sb e l o n g e dt ot h ef i n g e r p r i n tw a sd e f i n e d a tl a s t , t h e p r o c e s so fr e s e a r c h o nc h e m i c a l ，a n a l y t i cm e t h o da n dt h e p h a r m a c o l o g ya c t i v i t yw a sr e v i e w e da c c o r d i n gt or e l e v a n tr e f e r e n c e si na n da b r o a d k e yw o r d s ：p i n e l l i at e r n a l a ；g i n k g ob i l o b a ：h p l c ；f i n g e r p r i n t ；q u a n t i t y c o n t r o l ；g i n k g ob i l o b at a b l e t ；a l k a l o i d ；h p l c m s 4 刖舌 当今世界在“回归大自然”思潮的影响下，许多国家寻找天然药物的呼声日 渐高涨，而中药以其丰富的资源、独特的理论体系、特有的疗效和较低的毒副作 用等特点受到了世界各国的重视。但我国传统的中药及制剂大多缺乏严密的质量 标准和科学的检测手段，难以有效的控制其内在质量，不能保证用药的安全、有 效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展。因此，将 传统中药与现代科学技术相结合，实现中药现代化已成为必然趋势。其中，加强 中药材质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题，是实现中药现代化的前 提。只有对中药材进行科学的质量控制，才能保证中药质量，实现中药的“安全、 有效、稳定、可控”o 、中国医学科学院药物研究所编辑，1 9 9 2 年；9 、甘师俊，等， 1 9 9 8 年；2 6 、肖培根，等，2 0 0 0 年：5 2 、罗国安。等，2 0 0 0 年) 。 一、中药的质量控制研究现状 作为有着悠久文明史的中药，其安全性、有效性早已经过历史的验证。但中 药的均一稳定性即质量可控的问题则是制约中药发展，走向国际市场的瓶颈 颈问题。我国中药材资源丰富，种类繁多，来源复杂，品种混乱。同名异物、同 物异名的现象甚为普遍，购销中以假乱真、以劣充优的情况时有发生。市场上除 正品外，尚有一代用品、伪品和混淆品，质量差异很大，势必影响l 临床疗效。同 时药材源于自然界，生长环境、采收季节、加工方法和贮存条件不同，导致其质 量和临床疗效有很大差异。中药材的另一特点是所含化学成分复杂，且多数中药 材有效成分尚不清楚。中药的功效又具有多样性，一个成分难以代表一味中药， 某个作用也不能概括其全部功效。中药材的这些特点及影响质量的各种因素，增 加了中药材质量评价的难度( 2 7 、苏薇薇，1 9 9 6 年；4 、王秀坤。等，1 9 9 6 年) 。 而解决这难题的有效手段，就是要借助于现代的、被国际社会所认可的中 药指纹图谱技术。通常是指中药化学( 成份) 指纹图谱，含中药材( 原料药材) 指纹图谱：中药原料药( 包括饮片、配伍颗粒) 指纹图谱和中药制剂指纹图谱。 是中药生产质量的一种新型标准，可以确保中药品的一致性，疗效的安全性及可 靠性，是组分群体的特征图谱，能全面反映中药品所含化学成份的种类与数量， 进而反映中药材及产品的质量( 6 3 、徐翔，等，2 0 0 6 年；2 8 、张君，等，2 0 0 5 年) 。 中药指纹图谱质控技术又与g a p 基地建设，s o p 质量管理息息相关。中药 生产标准化是中药产业现代化发展的基础和关键，而中药指纹图谱技术又是中药 现代化建设的主要技术手段之一，对中药“安全、有效和质量可控”，保证物种的 延续，遗传基因的稳定性，品种的地道性和药用价值起着至关重要的作用( 7 4 、黄 璐琦，等，2 0 0 2 年) 。 近年来，对中药材的研究集中在以下几个方面：( 1 ) 品种评价的研究，区别正 品与非正品，划分药材的质量等级，明确中药材的优劣真伪。( 2 ) 寻找中药材的 代用品，扩大药源。( 3 ) 研究种属分类，探索亲缘关系。( 4 ) 快速鉴定未知样品。 至今己有许多文献报道，利用u vi r ，t l c 、h p l c ，h p c e 等方法提供的信息对 中药材进行了质量研究( 5 3 、房德敏，2 0 0 5 年) 。 二、半夏药材的质量控制研究 半夏中含有生物碱、甾醇类、氨基酸和无机元素等四类主要成分，但其含量 均较低，其中甾醇类、氨基酸类和无机元素的测定对半夏药材质量控制的专属性 差；生物碱、有机酸被认为是半夏中的主要有效成分，目前己知的测定方法有： 生物碱主要测定方法：重量法、滴定法、薄层扫描法和h p l c 法f 2 9 、芮正详，等， 1 9 9 2 年：3 0 、吴皓，等，1 9 9 5 年：3 1 、吴皓，等，1 9 9 8 年；3 2 、吴皓，等，1 9 9 6 年；8 3 、 m a s a t a k a ，1 9 8 4 年) ；国外( 8 3 、m a s a t a k a ，1 9 8 4 年) 学者采用正相h p l c 法，测定 半夏中麻黄碱的含量：吴皓采用薄层扫描法测定其中麻黄碱的含量；王艳华( 5 、 王艳华，2 0 0 1 年) 采用反相高效液相色谱法对半夏中葫芦巴碱的含量进行了测定； 何凌云( 3 3 、何凌云，2 0 0 2 年) 等采用薄层扫描法测定半夏药材中琥珀酸的含量， 上述方法在一定程度上反映了药材质量。 三、银杏制剂的质量控制研究 银杏叶片中的主要生物活性成分为银杏黄酮糖苷和银杏萜内酯，能有效的防 治心脑血管疾病，拮抗血小板活化因子( p a f ) ，对与自由基有关的疾病如老年 性痴呆症、衰老等都有明显的改善作用，文献报道对银杏叶提取物及其制剂的研 究较多( 1 4 、池静端，等，1 9 9 7 年；8 5 、p i e t t ap ，等，1 9 9 1 年：8 6 、p i e t t ap ，等，1 9 9 1 年) ， 多以银杏黄酮苷和银杏内酯为含量测定指标，在大部分成分尚不清楚的情况下， 银杏总黄酮的测定方法以h p l c 法间接测定黄酮苷元为主，这种传统的质量控制 方法并不能真正反映银杏叶提取物和其制剂的质量稳定，因此，本课题利用高效 液相色谱( h p l c ) 及高效液相色谱电喷雾质谱联用( h p l c m s ) 法，按照国家药 品监督管理局制订的中药注射剂色谱指纹图谱研究操作规程指南( 试行) 和 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) ( 5 4 、国家药品监督管理局文件，2 0 0 0 年) ，对银杏叶片( 贵州信邦制药有限公司生产，黔卫药准字( 1 9 9 6 ) 第5 0 1 4 1 9 号) 进行指纹图谱研究，对信邦公司提供的银杏浸膏、银杏叶片中间体及成品中 的银杏黄酮、银杏内酯分别进行测定，建立银杏浸膏、银杏叶片中间体及成品的 指纹图谱。 实现中药的现代化已经成为国家的重要政策，加强中药品质评价的现代化与 标准化是其中的重要内容，建立中药指纹图谱将是完成这一内容的重要途径。对 该片剂进行指纹图谱的研究，是满足国家政策的需要，也是该产品质量的提高、 增强国内外市场竞争能力的迫切需要，同时该研究将会对贵州省的中药现代化进 程起到一定的推进作用。 综述 半夏p i n e l l i at e m a t a ( t h u n b ) b e f i t 为天南星科半夏属植物半夏的干燥块茎最 早收录于神农本草经，列为下品，而神农本草经中下品药一般是”多毒不 可久服”，历代本草文献均将其记载为”辛温，有毒”( 4 l 、吴皓，等，2 0 0 1 年) 。 其功效为燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结，主治湿痰冷饮、胸膈胀满、呕吐、反 胃、头晕不眠、惊厥头痛等。法半夏是其炮制品之一，应用广泛，并且收载于 2 0 0 0 中国药典一部( 5 7 、国家药典委员会，2 0 0 0 年) 。近年来，由于野生资 源的减少，商品货源日趋紧张，市场上常用虎掌( p e d a t i s e c t as e h o t t ) 、水半夏 ( t y p h o n i t u nf l a g e l l a f o r mb l u m e ) 等代半夏入药，造成半夏用药的混乱。为了实 现中药材质量的可控和进一步研究的需要，本文就半夏的生药学、化学成份及分 析、药理及毒性方面的研究情况作简要综述，并就半夏类药材的研究前景提出自 己的一些看法。 1 生药学研究 1 】药材性状鉴别 1 1 1 半夏：类球形或稍偏斜，直径0 8 1 5 c m 。上端多圆平，中央有一圆 形凹陷的芽痕，底部钝圆而光滑，少有突起。质坚实，端面白色，粉性。嚼之发 粘麻舌而刺喉( 4 2 、汪年琼，等，2 0 0 1 年) 。 】1 2 虎掌：主块茎四周有多数小块茎组成，如虎类脚掌，块茎中心有茎 痕，四周具有麻点根痕，混入商品半夏者多为1 5 c m 左右。 1 1 _ 3水半夏：椭圆形、圆锥形，有的下端略尖；顶端有稍下陷的类圆形 芽痕，较半夏之芽痕小而浅，其上覆盖黄棕色芽鳞。遍体可见大小深浅不同的小 坑，细小而深者为须根痕，较大而浅者为珠芽痕( 6 、王永红，等，1 9 9 9 年) 。 1 2组织结构鉴别 1 _ 2 1半夏：块茎横切面外层有木栓细胞1 0 余列，部分栓皮细胞中含有茶 褐色粘液状物质。薄壁细胞内充满淀粉粒，由外至内逐渐增多，含草酸钙针晶束的 圆形或椭圆形粘液细胞到处可见，直径7 5 1 5 2 u m 。芽鳞表皮细胞近似长方形，排 列较整齐( 6 6 、钱彦丛，等，1 9 9 7 年) 。 1 2 2虎掌：薄壁细胞及粘液细胞较半夏稍小，粘液细胞直径6 7 一1 3 5 u m ， 芽鳞表皮细胞的形状、大小及淀粉粒的组成与半夏有较明显不同( 4 3 、季申，等， 2 0 0 0 年1 。 1 2 3水半夏：块茎周边薄壁组织中分布一圈茶褐色粘液状物质，并多见 形成珠芽的分生组织( 5 9 、赵秀清，等，1 9 9 7 年) 。 1 3 粉沫特征鉴别 1 3 1半夏：单粒淀粉粒类圆形、半圆形或圆多角形，直径2 - 3 0u n l ，脐点 裂缝状、人字状、三叉状或星状；复粒多见，较大，多由2 _ 分粒组成，偶见分 粒散在草酸钙针晶，长2 0 - 1 4 4u m ，导管多破碎( 5 9 、赵秀清，等，1 9 9 7 年：4 4 、 陈俊华，1 9 9 0 年) 。 1 3 2虎掌：单粒淀粉粒类球形、椭圆形或盔帽形，直径3 - 2 9 u m ，脐点点 状、星状或人字状；复粒多，由2 1 0 分粒组成、草酸钙针晶散在或成束，长1 3 - 9 6 u m 。螺纹或环纹导管，直径约4 8l l l n ( 4 3 、季申，等，2 0 0 0 年) 。 1 3 3 水半夏：单粒淀粉粒较少，圆球形、卵圆形半圆形或多角形，直径 3 - 1 4 u m ，脐点点状、人字状、短缝状或三叉状：复粒较多由2 - 1 2 分粒组成草酸 钙针晶散在或成束，长1 4 7 2 u m 导管以螺纹为主，偶见环纹，直径7 - 3 4 u m ( 6 7 、 高月华，等，2 0 0 0 年) 。 2 化学成份研究 2 1生物碱类对于半夏，仅仅从总生物碱含量测定方面进行了一些研 究。对培养物和人工栽培半夏生物碱含量对比分析表明，培养物中含0 4 8 栽培 半夏为0 1 3 7 ( 6 0 、赵岚，等，1 9 9 0 年) 。吴皓( 3 0 、吴皓，等，1 9 9 5 年) 等测定 了生半夏及炮制品中总生物碱含量，结果姜矾半夏中最高为0 1 7 7 2 ，姜煮半夏 中最低为o 1 2 1 7 ，生半夏为0 1 5 5 6 。刘苏平等( 1 9 、刘苏平，等，2 0 0 0 年) 对移栽大田后的组织培养半夏与栽培的原亲本测定总生物碱含量，结果差异不 大。于超等( 1 、于超，等，2 0 0 4 年) 测定表明不同产地半夏中总生物碱的含量有 一定差异。掌叶半夏在生物碱的分离与结构鉴定方面已经做了大量的研究。秦文 娟等( 6 8 、秦文娟，等，1 9 8 1 年；6 9 、秦文娟，等，1 9 8 3 年；7 0 、秦文娟，等， 1 9 8 4 年：7 l 、秦文娟，等，1 9 9 5 年) 从掌叶半夏块茎的生物碱部分先后分离鉴定 了3 0 个化合物：掌叶半夏碱甲，掌叶半夏碱乙，掌叶半夏碱丙，掌叶半夏碱丁， 掌叶半夏碱戊。l 脯氨酰一l 一缬氨酸酐，l 一缬氨酰一l 缬氨酸酐，l 缬氨酰一l 一丙氨酸 9 酐，l 一乙酰基一1 3 一咔啉，1 3 谷甾醇，1 3 咔啉，脲嘧啶，菸酰胺，5 甲基脲嘧啶， l 脯酰一l 一丙氨酸酐，3 一乙酰氨基2 派啶酮，腺苷，l ，苯丙氨酰一l 一丝氨酸酐，棕 榈酸，2 一甲基一3 一羟基吡啶，l 一脯氨酸l 脯氨酸酐，l 缬氨酰一l 一亮氨酸酐，l 一苯 丙氨酰一l 丙氨酸酐，l 甘氨酰一l 一脯氨酸酐，l 一酪氨酰一l 亮氨酸酐，l 一酪氨酰一l 一 缬氨酸酐，l 一丙氨酰一l 一亮氨酸酐，l 一丙氨酰一l 一异亮氨酸酐，l 一苯丙氨酰一l 一丝氨 酰酐，l 一酪氨酰一l 一丙氨酸酐及腺苷等。王瑞( 7 、王瑞，等，1 9 9 7 年) 等从掌叶半 夏的块茎中分离到5 个结晶，晶1 、晶v 为新化合物，命名为掌叶半夏碱己、掌 叶半夏碱庚，并经光谱分析确定掌叶半夏碱己为掌叶半夏碱戊的同分异构体。水 半夏中亦含有生物碱，但含量低于半夏( 4 5 、吴绍安，等，1 9 8 6 年) 。水半夏各 炮制品中，水浸品最高为0 0 5 4 ，水煮品最低为0 0 1 4 ，生品中为0 0 3 7 ( 7 6 、 黄连忠，等，1 9 9 9 年) 。 2 2 凝集素半夏凝集素( p t l ) 是由分子量为1 0 1 i k d 的亚基组成的，具 有特异的糖结合专一性，专一于甘露聚糖。陶宗晋等( 7 2 、陶宗晋，等，1 9 8 1 年) 从半夏的鲜汁中分离的半夏蛋白，分子量为4 4 0 0 0 ，不仅能凝集红细胞，还能 凝集其它类型的细胞。结晶半夏蛋白经6 m 盐酸胍变性解聚后，经分步层析可以 重新天然化( 7 3 、徐琴钰，等，1 9 8 1 年) 。应用酶活力测定方法及固定化胰蛋白酶 亲和层析，证实半夏块茎中含有胰蛋白酶抑制剂( 4 6 、吴克佐，等，1 9 8 1 年) 。脂 肪细胞膜上存在半夏蛋白的受体，而且结合是专一的( 1 0 、孙册，等，1 9 8 1 年) 。 半夏蛋白亦具有促使细胞分裂的活性，并且这种作用具有动物种属专一性( 1 1 、 孙册，等，1 9 8 3 年；8 9 、y o k o ，等，1 9 9 2 ) 。郭锰等( 6 1 、郭锰，等，1 9 9 3 年) 研究指出，金属离子或e d t a 对半夏凝集素的糖结合活性无显著影响，k + 可以 显著增加糖结合活性。大多数单糖、二糖不抑制p t l 与甘露聚糖的结合，但一 些疏水配基形成的糖苷可产生显著的抑制效应。张辉( 4 7 、张辉，等，1 9 9 3 年) 等研究了p t l 在人工脂双层形成的离子通道的基本性质，指出p t l 通道为阳离 子选择通道，这为p t l 易化递质释放提供了解释。姚剑红( 9 0 、y a oj i a n h o n g ，等， 2 0 0 1 年) 等利用p a c e p c r 技术从半夏花序中克隆出半夏凝集素的全长c d n a ， 发现半夏凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白，半夏凝集素与其它天南星科 植物凝集素一样，为具有三个甘露糖专一结合盒的凝集素。k u r a t a k 等( 8 2 、 k i y o s h ik u r a t a ，等，1 9 9 8 年1 报道，6 k d p 是半夏块茎中的一种主要蛋白质，具 0 有类似凝集素的作用，能止呕吐。孙光星等( 1 2 、孙光星，等，1 9 9 5 年) 首次从 掌叶半夏中分离纯化出一种对兔红血球有血凝活性的凝集素，称之为掌叶半夏凝 集素a ( p i n e l l i ap e d t a i s e c t al e c t i na ，p p l a ) 。在p a g e 、s d s p a g e 和等点聚焦电 泳上p p l a 均显示出一条蛋白质着色带。通过s c h i f f 试剂电泳染色法鉴定p p l a 为糖蛋白。掌叶半夏总蛋白经化学分析证实，总蛋白中不含磷，不含脂蛋白，含 有糖成分，总蛋白中含有十余种蛋白质，蛋白质含量9 6 1 ( 1 3 、孙光星，等， 1 9 9 2 年) 。p p a 是从掌叶半夏块、茎中分离纯化到的具有一种抗蚜虫活性的凝集 素，它是掌叶半夏的主要蛋1 兰1 ( 7 7 、黄大肪，等，1 9 9 7 年：7 9 、潘映红，等，1 9 9 8 年1 。 2 3 氨基酸李先端( 2 0 、李先端，等，1 9 9 0 年) 等对半夏、虎掌等8 种半 夏进行氨基酸分析，且测定了各种氨基酸的含量。结果表明：半夏类药材中所含 的氨基酸主要有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、 蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨 酸。其中谷氨酸在各类半夏药材中的含量均很高，盾叶半夏中达最高，为 1 8 7 0 p p m ，其次是虎掌，为1 7 6 0 p p m ，滴水珠和水半夏中最低，为5 0 0 p p m 。总 氨基酸含量最高的是盾叶半夏，而滴水珠中含量最低。季文兰( 4 8 、季文兰，等， 1 9 9 7 年) 等对不同种质半夏氨基酸的含量测定表明，窄披针型半夏的含量略高于 竹叶型半夏，且具有一定镇咳祛痰流行性的天门冬氨酸的含量也是窄披针型半夏 的含量略高于竹叶型半夏。半夏不同群缬氨酸和精氨酸含量存在很大差异。总体 上均以秋收者含量为高( 6 2 、郭巧生，等，2 0 0 1 年) 。 2 4 刺激性成分最初认为半夏的刺激性成分是胆碱、尿黑酸、葡萄糖 甙及其双葡萄糖甙，后来又提出，3 , 4 一二羟基苯甲醛具有刺激性的作用( 4 2 、汪年 琼，等，2 0 0 1 年) 。吴皓( 4 9 、吴皓，等，1 9 9 9 年) 等认为：半夏中所含的草酸钙 针晶为半夏的刺激性成分之一，且其特殊晶形与刺激性有直接关系。李国良( 2 1 、 李国亮，等，1 9 9 9 年) 报道，儿茶醛为半夏辛辣刺激性物质，它不易溶于水，且 遇高温后分解。 2 5 其它麻黄碱、1 3 一谷甾醇、精油、脂肪酸、d 一葡萄糖、l 一鼠李糖、d 葡萄糖醛酸、脂质、鸟苷及类黄酮等成分在半夏上也有一定的含量( 3 5 、张科卫， 等，2 0 0 0 年；8 0 、c h u n al i ，等，1 9 9 8 年；8 4 、m a s a s h it o m o p a ，等，1 9 9 4 年) 。 3药理研究 3 1镇咳、祛痰 口服半夏煎剂0 6 9 k g 对1 碘溶液注入猫胸右膜腔或电 刺激喉上神经所致的咳嗽有不同程度的抑制作用，且可维持5 h 以上。半夏生品、 新老法制品粉沫混悬液灌胃，对小鼠氨熏所致的咳嗽有不同程度的抑制作用 ( 2 2 、汤玉妹，等，1 9 9 4 年) 。水半夏具有与半夏相类似的镇呕、镇咳作用，且强 度与半夏无显著性差异，而祛痰作用强于半夏( 2 3 、刘继林，等，1 9 8 9 年) 。掌 叶半夏水剂( 2 0 9 & g ) 口h a 有祛痰作用，给药组呼吸道排出酚红量分别为对照组的 15 0 及1 7 0 。 3 2 抗肿瘤半夏炮制品的甲醇提取物对肿瘤细胞有一定的抑制作用。半 夏提取物对复水型肉瘤、肉瘤一1 8 0 、实验性小鼠宫颈癌一1 4 、肝癌实体型及h e l a 细胞、j t c - - 2 6 体外实验均有一定的抑制作用。半夏各炮制品总生物碱对慢性髓 性白血病细胞( k 5 6 2 ) 有抑制作用，能损伤悬浮生长的k 5 6 2 细胞形态，抑制其增 殖( 5 0 、陆跃鸣，等，1 9 9 5 年) 。从半夏中提取的多糖具有较强的网状内皮系统 激活活性( 8 、友田正司，等，1 9 9 5 年) 。能增强网状内皮系统舌噬功能和分泌作 用，抑制肿瘤的发生和增殖。掌叶半夏醇提液，对s 1 8 0 的抗瘤率为4 5 8 0 一5 3 7 ， 对h c a 的抗瘤率为3 7 1 , - 一5 3 4 ，对u 4 的抗瘤率为6 1 7 0 一8 4 8 。从掌叶半 夏中提取出的总蛋白，以l 浓度的生理盐水液给小鼠腹腔注射0 1 m l ，对小鼠 s 1 8 0 瘤株的抑制率为5 0 1 6 7 o ( 1 3 、孙光星，等，1 9 9 2 年) 。朱铭伟等( 2 4 、 朱铭伟，等，1 9 9 9 年) 认为：掌叶半夏总蛋白对s k o v 3 、o v c a r 、a o 和3 a o 卵巢癌细胞株均有程度不同的抑制作用，抑制率为6 2 2 2 - - 0 2 4 3 。 3 3抗心律失常半夏经预防给药对氯化钡诱发大鼠心律失常具有明显的 对抗作用。掌叶半夏生物碱氯仿部分对抗乌头碱和氯仿所致的小鼠实验性心律失 常有较明显的作用，并延长心肌细胞动作电位的有效不应期。 3 , 4 抗生育半夏蛋白1 2 5 m l g j f m l 对早孕小鼠的抑孕率为5 0 。半夏蛋白 还有很强的抗兔胚泡着床作用，子宫内注射5 0 0 u g ，抗着床率为1 0 0 ( 5 1 、陈蕙 玲，等，1 9 9 8 年) 。 3 5 解毒作用半夏中所含葡萄糖醛酸的衍化物有显著的解毒作用，可使 士的宁对小鼠半数致死量的值升高，对乙酰胆碱也有解毒作用。 3 6其它半夏具有抗溃肠、止吐、镇痛、抗血栓、降血脂、抗真菌、抗 炎、降低眼内压等作用。掌叶半夏具有抗惊厥作用。 4 毒性研究 半夏乙醇浸膏给小鼠腹腔注射半数致死量为1 3 1 4 2 9 k g 。半夏水溶成分内加 入醋酸铅后沉淀的物质中，含有引起蛙及小鼠骨骼肌痉挛的物质，用碱性醋酸铅 生成的沉淀中，含有使蛙瞳孔散大的物质，滤液中则含有使蛙产生中枢性及箭毒 样肌麻痹的物质。生半夏粉9 9 k g ，对妊娠母鼠和胚胎均有明显的毒性，制半夏 汤剂，3 0 9 k g ( 相当于临床常用量的1 5 0 倍) 引起孕鼠阴道出血，胚胎早期死亡数 增力n ( 5 1 、陈蕙玲，等，1 9 9 8 年) 。姜半夏3 0 9 k g 剂量，可诱发小鼠骨髓细胞姐妹 染色体交换( s c e ) 轻微升高，1 5 9 k g 和9 9 k g 剂量无影响。说明高剂量( 相当临床 剂量1 0 0 倍) 对d n a 可能有一定损伤作用。对家兔眼睑结膜的刺激性作用强度， 掌叶半夏 半夏 水半夏。掌叶半夏的5 0 醇提物加水浸物进行小鼠腹腔注射， 测得l d 5 0 茭j ( 4 6 + 11 7 ) g k g 。过2 0 0 目筛的掌叶半夏细粉混悬剂及5 0 0 水煎剂， 对家兔眼睑结膜有强烈刺激作用，煎剂在1 0 0 9 k g 剂量时，1 0 0 动物发生泻下 ( 2 5 、汤玉妹，等，1 9 9 4 年) 。 5 前景展望 半夏类药材品种多，来源广，具有很好的药用价值。但近年来由于生态环境 的破坏，耕作制度的改革，尤其是水旱轮作制度的实行，半夏野生资源遭到严重 的遗传侵蚀，其产量急剧下降，市场上半夏药材供不应求。与此同时，一些与半 夏药材在外表上非常相似的其它半夏药材趁虚而入，以假乱真，以次充好。因此， 对半夏类药材进行深入研究显得尤为迫切。半夏凝集素有很好的药用价值，但 含量很低。今后，可以利用转基因植物快速生产半夏凝集素；也可以通过细胞培 养技术，如利用转基因器官培养技术和利用细菌或真菌生产所需产物。掌叶半夏 在生物碱的分离与结构鉴定方面已做了大量的研究，而半夏仅仅从含量测定方面 进行了一些研究。因此，不仅要开展半夏生物碱的分离和纯化工作，也要利用生 物技术生产其有效成分。另外，半夏类生药具有毒性，但目前其主要有毒成分还 未完全研究清楚，这有待于进一步的研究半夏炮制品虽然解决了去毒的问题，但 长时间的水处理势必造成某些有效成分的损失。因此，探寻一种既能去毒，又能 防止有效成分损失的方法亟待解决。 二实验设计思路 厂 厂 产地半不同采收时银杏黄酮指银杏内酯的 材的研间半夏药材纹图谱的研 含量测定 的研究 究 ，ii 测定总测定不同采 用h p l c 研究采用h p l c 喊、鸟收期的总生信邦采用新采定四种银 含量，物碱、鸟苷 原料生产的杏内酯的含 立水溶含量，研究 可行性，用量 分指纹半夏药材动 h p l c m s 研 态质量情况 究不同银杏 叶片 lil 4 三实验部分 3 1 半夏样品的采集及理化鉴别 3 1 1贵州省半夏种植地域分布调查 据贵州省农业厅2 0 0 3 年调查统计( 5 8 、贵州省中药现代化科技产业协调办公室文 件，2 0 0 3 年) ，目前全省半夏栽培面积共1 4 1 5 8 亩。其中：黔南州5 0 8 5 亩，毕节 地区3 5 2 4 亩，黔西南州2 2 6 8 亩，黔东南州1 1 4 4 亩，贵阳市1 0 5 0 亩，安顺市 5 0 0 亩，铜仁地区2 7 2 亩，六盘水市2 2 0 亩，遵义市1 0 0 亩。种植面积较大的有 长顺、威宁、赫章、毕节、兴仁、锦屏、紫云、清镇等县、市；分县面积为： 威宁2 6 0 0 亩，赫章4 0 0 亩，毕节3 5 0 亩，黔西1 0 0 亩，清镇7 5 0 亩，修文3 0 0 亩，长顺5 0 8 5 亩，锦屏8 0 7 亩，天柱2 0 0 亩，兴仁2 2 0 8 亩，赤水1 0 0 亩，紫 云5 0 0 亩，万山2 0 0 亩，水城1 2 0 亩。 3 i 2 贵州省半夏g a p 种植规划布局 1 ) 2 0 0 0 2 0 0 5 年：半夏生产拟规划布局于威宁赫章、毕节、黔西、水城、 盘县、修文、开阳、清镇、紫云、长顺、兴仁、锦屏等地，共3 万亩。其中， 拟由贵州恒霸药业公司等企业牵头，在威宁、赫章、清镇等地建设2 3 个半夏 规范化生产基地与产业化经营，规范化生产基地面积共0 2 万亩。 2 ) 2 0 0 6 2 0 1 0 年：半夏生产拟规划布局于威宁、赫章、毕节、黔西、水城、 盘县、修文、开阳、清镇、紫云、长顺、兴仁、锦屏、纳雍、务川等地，共8 万亩。其中，拟由贵州恒霸药业公司等企业牵头，在威宁、赫章、清镇、纳雍、 务川等地建设5 6 个半夏规范化生产基地与产业化经营，规范化生产基地面积 l 万亩，并力争于2 0 1 0 年前有1 个基地通过国家药品监督管理局g a p 认证( 表 3 一】) 。 表3 - 1贵州省半夏生产基地规划布局 t a b l e3 - 1 t h eb a s eo f p i n e h i at e r n a t ai ng u i z h o up r o v i n c ei sp r o g r a m m i n gl a y o u t 2 0 0 0 年2 0 0 5 年2 0 0 6 年2 0 1 0 年 编号 地点面积( 万亩)地点面积( 万亩) l威宁010 威宁0 4 2 赫章0 0 5赫章0 1 5 3清镇005清镇0 1 5 4纳雍0 1 0 5务川0 1 0 6 长顺0 1 0 鱼兰i! ：!l! ：1 3 1 3 半夏药材的理化鉴别 采集的半夏中药材样品由贵阳中医学陈德媛研究员鉴定为天南星科植物半 夏p i n e l l i at e r n a t e ( t h u n b ) b r e i t 的干燥块茎。本品呈类球形，有的稍偏斜，直 径l 1 5 c m 。表面白色或浅黄色，顶端有陷的茎痕，周围密布麻点状根痕：下 面钝圆，较光滑。质坚实，断面洁白，富淀粉，见图3 1 。气微、味辛辣、麻舌 而刺喉。 图3 1中药材半夏外观图 f i g 3 - 1a p p e a r a n c ed i a g r a mo f c h i n e s eh e r b a lm e d i c i n em a t e r i a lp i n e l l i at e r n a t a 取样品粉末l g ，加甲醇1 0 m l ，加热回流3 0 分钟，滤过后，滤液挥至约0 5 m l ，作为供试品溶液。另取清氨酸对照品、丙氨酸对照品、缬氨酸对照品、亮 氨酸对照品，加7 0 的甲醇制成每lm l 各含l m g 的混合溶液，作为对照品溶 液。照薄层色谱法，吸取供试品溶液5 u l 、对照品溶液l u l ，分别点于同一以 图3 - 2 半夏中药材的薄层色谱图 f i g u r e3 - 2t h et h i n 1 a y e rc h r o m a t o g r a mo f c h i n e s eh e r b a lm e d i c i n em a t e r i a lp i n e l l i at e r n a t a 溶液。 图中1 为四川遂宁生半夏、2 为贵州威宁生半夏、3 为贵州清镇生半夏、4 为对照品 羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g 薄层板上，以正丁醇一冰醋酸一水( 8 ：3 ：1 ) 为展开剂，展开，取出晾干，喷以茚三酮试液，在1 0 5 加热至斑点显色清晰( 5 5 、 国家药药典委员会，2 0 0 5 年) 。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显 相同的颜色的斑点，见图3 2 。 3 1 4 半夏样品的收集 3 1 4 1不同产地半夏样品的收集 为比较贵州省不同产地的半夏药材的品质，本研究收集了贵、i t 省和四川省 不同产地的半夏样品，来源产地及时间见表3 2 。洗净、去皮、晾干、干燥，将 样品经粉碎机粉碎后，过筛，置广口瓶，密闭保存备用。 表3 - 2 不同产地来源及采收时间样品 t a b l e3 - 2t h es a m p l es o u r c ef o r md i f f e r e n tp l a c ea n dd i f f e r e n tt i m e 编号产地采收时问编号产地采收时间 i 贵州盘县干半夏 2 0 0 41 09 贵州花溪 2 0 0 4 1 0 2 贵州毕节干半夏 2 0 0 41 01 0 贵州清镇 2 0 0 5 1 0 3 贵州毕节大兰镇2 0 0 5 1 0 1 1 贵州盘县2 0 0 5 1 0 4 贵州威宁小海镇 2 0 0 5 1 01 2 贵州水城 2 0 0 4 9 5 贵州威宁哲觉镇 2 0 0 40 81 3 四川省遂宁生半夏 2 0 0 4 9 6贵州水城2 0 0 5 1 0f 4四川省遂宁法半夏2 0 0 4 9 7 贵州安顺2 0 0 4 1 0 1 5 四川省遂宁京半夏 2 0 0 49 8 贵州清镇麦格乡 2 0 0 50 8 3 1 4 2 贵州省某半夏g a p 种植基地样品的收集 为考察半夏药材的动态质量变化情况，本研究收集了贵州省半夏g a p 种植 基地不同采收季节和不同地点的半夏样品4 2 个，来源及产地见表3 3 。洗净、 去皮、晾干、干燥，将样品经粉碎机粉碎后，过筛，置广口瓶，密闭保存备用。 表3 - 3g a p 生产基地的半夏样品 t a b l e3 - 3t h es a m p l eo fp i n e l l i at e m a t af r o mg a p g r o w t hb a s e 编号产地采收时间编号产地采收时间 1 某基地一a 采样点 2 0 0 5 82 2 某基地一采样点1 02 0 0 5 1 0 2 某基地一b 采样点 2 0 0 5 82 3 某基地一采样点0 1 2 0 0 5 ii 3 某基地一采样点0 12 0 0 5 92 4 某基地一采样点0 2 2 0 0 5 l l 4 某基地一采样点0 22 0 0 5 92 5某基地一采样点0 32 0 0 5 i l 5 某基地一采样点0 3 2 0 0 592 6 某基地一采样点0 4 2 0 0 5 1i 6 某基地一采样点0 4 2 0 0 592 7 某基地一采样点0 5 2 0 0 5l l 7某基地一采样点0 52 0 0 592 8 某基地一采样点0 6 2 0 0 5 11 8 某基地一采样点0 6 2 0 0 5 92 9 某基地一采样点0 72 0 0 51 i 9某基地一采样点0 72 0 0 593 0 某基地一采样点0 8 2 0 0 5l i 1 0 某基地一采样点0 82 0 0 59 3 l 某基地一采样点0 9 2 0 0 51 l l i某基地一采样点0 92 0 0 5 93 2某基地一采样点1 02 0 0 5 il i2 某基地一采样点1 02 0 0 59 3 3 某基地一采样点0 1 2 0 0 51 2 1 3 某基地一采样点0 12 0 0 5 1 0 3 4 某基地一采样点0 2 2 0 0 51 2 1 4 某基地一采样点0 2 2 0 0 51 03 5 某基地一采样点0 3 2 0 0 51 2 1 5 某基地一采样点0 3 2 0 0 51 03 6 某基地一采样点0 4 2 0 0 51 2 1 6 某基地一采样点0 42 0 0 51 03 7某基地一采样点0 52 0 0 5 1 2 1 7 某基地一采样点0 5 2 0 0 51 03 8 某基地一采样点0 6 2 0 0 5 1 2 1 8 某基地一采样点0 6 2 0 0 5 1 03 9 某基地一采样点0 7 2 0 0 5 1 2 1 9 某基地一采样点0 72 0 0 5 1 0 4 0 某基地一采样点0 8 2 0 0 5 1 2 2 0 某基地一采样点0 8 2 0 0 5 1 04 l 某基地一采样点0 9 2 0 0 51 2 2 i 某基地一采样点0 9 2 0 0 5 1 04 2 某基地一采样点1 0 2 0 0 51 2 3 2 半夏中总生物碱成分的含量测定 3 2 1 实验仪器及试剂 3 2 1 1 试剂 盐酸麻黄碱对照品，购于中国药品生物制品检定所( 编号1 7 1 2 4 1 2 0 0 3 0 3 ) ； 醋酸一醋酸钠缓冲溶液( p h 6 o ) 和溴麝香草酚蓝标准溶液( 5 5 、国家药药典委员会， 2 0 0 5 年) 均按中国药典2 0 0 5 版一部附录方法在临用时配制，其余试剂均为分 析纯( 重庆川江化学试剂厂) 。 3 2 1 2 实验仪器 a g i l e n t8 4 5 3 e 型紫外一可见分光光谱仪( 美国惠普公司) ；其它玻璃仪器均 己校正。 3 2 2 供试品溶液的制备 精密称取已经减压干燥至恒重的样品粉末( 过4 0 目筛) 0 5 0 9 ，置于5 0 m l 三角瓶中，加浓氨水0 5 0 m l ，湿润后，加氯仿1 0 0 0 m l ，冷浸3 h 后超声提取0 5 h ， 过滤，残渣以1 0 0 0 m l 氯仿分3 次洗涤，合并滤液与洗液，8 0 。c 以下回收氯仿 至干，加入1 0 0 0 m l 氯仿使溶解并转移至5 0 m l 分液漏斗中，再依次加入 1 0 0 0 m l p h 6 0 的缓冲液和1 0 0 m l 溴麝香草酚蓝标准液，充分振摇后，静置 o 5 0 h ，分取氯仿层，水层再用氯仿同法萃取两次，每次1 0 0 0 m l 。合并氯仿层， 0 c 以下回收至干，残留物用氯仿定容于1 0 0 0 m l 容量瓶内( 1 、于超，等，2 0 0 4 年) ，即得供试品溶液