（农药学专业论文）赤拟谷盗细胞色素P450基因的克隆、序列分析及表达研究.pdf

摘要 赤拟谷盗细胞色素p 4 5 0 基因的克隆、序列 分析及表达研究 农药学专业硕士研究生徐永强 指导老师王进军教授 摘要 细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系( c y t o c h r o m ep 4 5 0m o n o o x y g e n a s e s ，p 4 5 0 s ) 为广泛分布于生 物有机体内的重要酶系。细胞色素p 4 5 0 是p 4 5 0 s 的末端氧化酶，在整个p 4 5 0 s 中起着木端氧 化酶( t e r m i n a lo x i d a s e ) 的作用，决定着p 4 5 0 s 底物的广泛性和专一性。细胞色素p 4 5 0 参与 许多重要的生命过程，对动物、植物、真菌和细菌等的研究表明许多不同催化反应都1 功丁- 细胞色素p 4 5 0 的作用。对于昆虫而言，细胞色素p 4 5 0 在昆虫的生命活动中起着十分重要的 作用：如同醇类物质、保幼激素( j h ) 、昆虫信息素、脂肪酸及其相关化合物、防御物质和 外源化合物的代谢等，甚至可以合成昆虫体内的k 链烃类，具有重要的生物学和遗传学意义。 目前已鉴定出2 0 0 多个昆虫细胞色素p 4 5 0 基因全长或片段，分属丁c y p 4 ，c y p 6 ，c y p 9 ， c y p l 2 ，c y p l 5 ，c y p l 8 ，c y p 2 8 ，c y p 4 8 ，c y p 3 0 5 等基冈家族。 赤拟谷盗t r i b o l i u mc a s t a n e u m ( h e r b s t ) 是具有重要经济意义的世界性储粮害虫，在世界 范闱内分布广泛，我国绝大多数省( 区) 市均有分布，为害严重。此外，赤拟谷盗还是一种 重要的模式昆虫，是第一个完成了基冈组测序的鞘翅目昆虫。因此，从基冈组水平对赤拟谷 盗p 4 5 0 基因进行研究，不仅能为赤拟谷盗的防治提供理论依据，对于认识p 4 5 0 的生物学：特 性和遗传学特性也有重要意义。据此，本学位论文在国家白然科学基金( 3 0 8 7 1 6 3 1 ) 的资助 下，利用分子生物学和生物信息学方法对赤拟谷盗p 4 5 0 基囚进行研究，获得的主要结果如卜： 1 p 4 5 0 基因的克隆及序列分析 采用r t - p c r 方法克隆获得了1 个p 4 5 0 新基因c y p 6 b k l 7 的全长序列。c y p 6 b k l 7 全k 1 8 1 6 b p ，g e n b a n k 登录号为星型2 堑量墨2 ，包括由3 4 个核苛酸组成的5 u t r ( 5 端_ 1 卜编码区) 、 由1 5 1 5 个核苷酸组成的o r f ( 开放阅凄框) 和由2 4 6 个核营酸组成的3 u t r ( 3 端1 卜编码 区) 。o r f 编码5 1 5 个氨基酸，预测蛋白含有血红素结合基序f x x g x x x c x g 及所有细胞色素 p 4 5 0 的特征基序，如位于螺旋k 中参与稳定核心结构的e x x r 完全保守序列；n 端含有由2 2 个疏水氨基酸组成的跨膜锚定区域。另外，利用该方法还得到了另1 个新基因( f 0 6 ) 的3 ，段 序列，长6 1 4 b p ，g e n b a n k 登录号为星型竺2 垒! z 2 ，其编码区长度为4 1 4 p ，编码1 3 8 个氨基酸残 基，3 u t r 含有1 9 8 b p 的核苷酸；推导的氨基酸序列中含三个p 4 5 0 超家族的特征性保守序列： e t l r 区、p e r f 区以及血红素结合区域f x x g x x x c x g 。 l 两南大学硕十学何论文 根据赤拟谷盗基冈组序列设计引物，克隆得到了c y p 6 b q l 3 基因的等位基因 c y p 6 b q l 3 v 2 ，两者相似性为9 8 ，其o r f 长度为1 5 5 4 b p ，g e n b a n k 登录号为2 1 1 塑鱼。 o r f 编码5 1 8 个氨基酸，其中n 端含有由1 7 个疏水氨基酸组成的跨膜锚定区域：推定的氨基 酸序列包含所有昆虫p 4 5 0 基因的5 个特征序列，如血红素结合基序f x x g x x x c x g 、e t l r 区等。 2 生物信息学分析 c y p 6 b k l 7 基因编码的蛋白质预测分子量为5 8 7 7 k d a ，理论等电点为9 2 6 1 住该数据库 s w i s s m o d e l 中搜索发现与其同源性最高的是人类肝脏的c y p 3 a 4 ( 3 2 ) ，以c y p 3 a 4 蛋 白质晶体结构为模扳进行同源模建，得到了c y p 6 b k l 7 的三维结构模型，找到了赤拟谷盗的 酶解活性中心r - 胱氨酸c y s 4 4 2 。 c y p 6 b q l 3 v 2 基冈推定的氨基酸序列预测分子量为5 9 9 2 k d a ，理论等电点为7 。6 0 ：刚 s i m 4 程序对c y p 6 b q l 3 v 2 基因的外显子内含子结构进行分析发现该基因含有3 个外显子，2 个内含子，外显子内含子边界符合g t - a g 规则；通过基因组数据进行本地b l a s t 发现 c y p 6 b q l 3 v 2 基因的c d n a 序列只与一个c o n t i g ( c t g a a j j 0 1 0 0 0 8 0 8 ，第2 染色体) 具有较高 的相似性，表明该基因为单克隆基因。 3 系统发育分析 从g e n e b a n k 数据库中收集米自1 0 个物种的1 9 条细胞色素p 4 5 0 基因序列，其中有5 条 来自哺乳动物，其余均来自昆虫。利用m e g a 3 0 构建c y p 6 b k l 7 的分子进化树。系统进化 树分析表明c y p 6 b k l 7 与来源于赤拟谷盗的c y p 6 b k l 0 和c y p 6 b k l 的同缘关系最近，其次 是来源f 家蝇( m u s c ad o m e s t i c a ) 的c y p 6 a 1 和c y p 6 c 1 ，以及米源于尖音库蚊( c u l e x p i p i e n s p i p i e n s ) 的c y p 6 e 1 。 从g e n e b a n k 数据库中收集米自1 2 个物种的2 2 条细胞色素p 4 5 0 基因序列，利用m e g a 3 0 构建c y p 6 b q l 3 v 2 的分子进化树。系统发育分析表明，c y p 6 b q l 3 v 2 与代谢蜕皮激素、米源 于家蚕( b o m b y xm o r i ) 的c y p 3 0 2 a 1 和来源丁果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 的c y p 3 0 7 a 1 的同缘关系较近。 4 基因表达研究 将c y p 6 b k l 7 克隆到表达载体p d e s t 1 7 的多克隆位点区，然后将重组表达载体转化到 b l 2 1 ( d e 3 ) 菌中，成功建立了c y p 6 b k l 7 基因的原核表达系统。 r e a l t i m ep c r 结果表明c y p 6 b q l 3 v 2 在被检测的赤拟谷盗的各个发育历期均有表达，其 中在蛹期的表达水平最低，1 龄幼虫期的表达水平最高，是蛹的1 4 9 倍，成虫的3 8 6 倍：总 体上随着虫龄的增加旱递减趋势，具体为：1 龄幼虫 4 龄幼虫 7 龄幼虫 虫 蛹。 关键词：赤拟谷盗p 4 5 0 分子克隆实时荧光定量p c r i i a b s t r a c t a bs t r a c t p 4 5 0 s ( e n c o d e db yc y pg e n e s ) c o n s t i t u t eam u l t i g e n i cs u p e r f a m i l yo fe n z y m e s ，k n o w nf o r t h e i ra b i l i t yt om e t a b o l i z eaw i d er a n g eo fe n d o g e n o u sa n de x o g e n o u sc o m p o u n d st h u sc o n t r i b u t i n g t on u m e r o u sf u n c t i o n si n c l u d i n gg r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，n u t r i t i o n ，a n dx e n o b i o t i cd e t o x i f i c a t i o n p 4 5 0 e n z y m e sa r ef o u n di nv i r t u a l l ya l li n s e c tt i s s u e s ，w h e r et h e ya r ei n v o l v e di np r o c e s s e st h a ta r ev i t a l f o r i n s e c tg r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n dr e p r o d u c t i o n ，i n c l u d i n ge c d y s t e r o i da n dj u v e n i l eh o r m o n e b i o s y n t h e s i sa n da s p e c t so fe c d y s t e r o i di n a c t i v a t i o n ，a sw e l la sm e t a b o l i s ma n dd e t o x i f i c a t i o no f x e n o b i o t i c s t h ef i r s ti n s e c tp 4 5 0g e n e ( c y p 6 a 1 ) w a si s o l a t e df r o ma ni n s e c t i c i d e r e s i s t a n ts t r a i no f h o u s e f l y , m u s c ad o m e s t i c a s u b s e q u e n t l y , m o r ea n dm o r ep 4 5 0g e n e sw e r ec l o n e d t od a t e ，m o r e t h a n2 0 0p 4 5 0g e n e sb e l o n gt oc y p 4 ，c y p 6 ，c y p 9 ，c y p l 2 ，c y p l 5 ，c y p l 8 ，c y p 2 8 ，c y p 4 8 ，a n d c y p 3 0 5h a v eb e e nc l o n e da n ds e q u e n c e d 。 t h er e df l o u rb e e t l e ，t r i b o f i u m c a s t a n e u m ( h e r b s t ) ( c o l e o p t e r a ：t e n e b r i o n i d a e ) ，i s a c o s m o p o l i t a na n dd e s t r u c t i v ep e s to fr a wa n dp r o c e s s e dc e r e a lg r a i n s f u r t h e li ti sam e m b e ro ft h e m o s ts p e c i e s r i c he u k a r y o t i co r d e r ，ap o w e r f u lm o d e lo r g a n i s mf o rt h es t u d yo fg e n e r a l i z e di n s e c t d e v e l o p m e n t ，a n da ni m p o r t a n tp e s to fs t o r e da g r i c u l t u r a lp r o d u c t s i n2 0 0 8 ，a sam o d e lb e e t l e ，t h e g e n o m eo fzc a s t a n e u mh a sb e e ns e q u e n c e d t od a t e h o w e v e r ，s t u d i e so nt r i b o l i u mp 4 5 0i sl a c k a n dp r e m a t u r e t h e r e f o r e ，t h i ss t u d yw a su n d e r t a k e na n dp a r t i a l l ys u p p o r t e db yt h en a t i o n a ln a t u r a l s c i e n c ef o u n d a t i o n ( 3 0 5 7 0 2 31 ) t oi d e n t i f ya n dc h a r a c t e r i z et h ep 4 5 0g e n e sf r o mzc a s t a n e u m f u r t h e r m o r e ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n a n dr e a l - t i m e q u a n t i t a t i v e p c rw e r e i m p l e m e n t e d t o i n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nc h a r a c t e ro fc y p 6 b k l 7a n dc y p 6 b q l 3 v 2t op r o v i d eab a s eo fg e n e e x p r e s s i o nd a t af o rf u t u r ee x p e r i m e n t so nt h er e g u l a t i o no ft h i sg e n ea n di t sp r o d u c t t h em a j o r r e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 i d e n t i f i c a t i o na n ds e q u e n c ec h a r a c t e r i z a t i o n an e wc y t o c h r o m ep 4 5 0g e n e ，c y p 6 b k l 7 ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o ：星型2 亘鱼量墨2 ) ，w a si s o l a t e d f r o mt h er e df l o u rb e e t l eu s er t - p c r t h ec d n as e q u e n c eo fc y p 6 b k l 7 ，1 8 1 6b pi nl e n g t h ， c o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 51 5n u c l e o t i d e se n c o d i n gap u t a t i v ep r o t e i no f5 0 5a m i n oa c i d r e s i d u e s ，c o n t a i n st h ec l a s s i ch e m e b i n d i n gs e q u e n c em o t i ff x x g x x x c x gc o n s e r v e da m o n ga l l p 4 5 0e n z y m e sa sw e l la so t h e rc h a r a c t e r i s t i cm o t i f so fa l lc y t o c h r o m ep 4 5 0 s b e s i d e s ，3 s e q u e n c e o fan e wc y t o c h r o m ep 4 5 0g e n e ( f 0 6 ) ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o ：星型墼垒! z 2 ) ，w a si s o l a t e df r o mt h e r e df l o u rb e e t l eu s er t - p c r ，6 1 4b pi nl e n g t h t h ea m i n oa c i dr e s i d u e ss e q u e n c eo ff 0 6c o n t a i n st h e c l a s s i ch e m e b i n d i n gs e q u e n c em o t i ff x x g x x x c x gc o n s e r v e da m o n ga l lp 4 5 0e n z y m e s a na l l e l eo fc y p 6 b q l 3f r o mt h et r i b o l i u mc a s t a n e u mg e n o m ep r o j e c t ，n a m e dc y p 6 b q l 3 v 2 i i i 两南大学硕十学何论文 ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o ：e 1 2 q 窆量受i ) ，w a si s o l a t e df r o mt h er e df l o u rb e e t l e t 1 1 ee d n as e q u e n c eo f c y p 6 b q l 3 v 2 ，1 5 6 3b pi nl e n g t h ，c o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 5 5 4n u c l e o t i d e se n c o d i n ga p u t a t i v ep r o t e i no f5 1 8a m i n oa c i dr e s i d u e s ，c o n t a i n st h ec l a s s i ch e m e _ b i n d i n gs e q u e n c em o t i f f x x g x x x c x ga sw e l la so t h e rc h a r a c t e r i s t i cm o t i f so fa l lc y t o c h r o m ep 4 5 0 s 2 b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i s t h ep r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h ta n dt h e o r e t i c a lp io ft h ec y p 6 b k l 7i s5 8 7 7k d aa n d9 2 6 ， r e s p e c t i v e l y 3 dm o d e lo ft h ec y p 6 b k l 7w a sc o n s t r u c t e da c c o r d i n gt oc y p 3 a 4g e n eb yu s i n g s w i s s m o d e l t h ep r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h ta n dt h e o r e t i c a lp io ft h ec y p 6 b q l 3 v 2i s5 9 9 2k d aa n d7 6 0 ， r e s p e c t i v e l y c y p 6 b q l 3 v 2w a sb l a s t e da g a i n s tg e n o m i cs e q u e n c e so fzc a s t a n e u mi ng e n b a n k i t w a sf o u n dt h a tt h i s g e n ec o n s i s t e d t h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n s t h es p l i c i n gs i g n a l sa r e e x o n g t - i n t r o n - a g e x o n t h ec d n as e q u e n c eh a dh i g hs i m i l a r i t y t o o n l y o n e c o n t i g ( c t g a a j j 01 0 0 0 8 0 8 ) ，s u g g e s t i n gt h a tt h ec y p 6 b q 1 3 v 2g e n ew a sas i n g l e - c o p yg e n ei nt h e g e n o m e 3 p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ec l o s e rp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fc y p 6 b k l 7w i t h c y p 6 b k l 0f r o mzc a s t a n e u ma n do t h e ri n s e c t sc y p 6m e m b e r st h a no t h e rp 4 5 0f a m i l i e s m e m b e r s f r o mm a m m a l s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e d t h a tt h e r ew a sc l o s e r p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p o f c y p 6 b q l 3 v 2w i t hc y p 3 0 2 a 1 ( 且m o r i ) a n dc y p 3 0 7 a 1 ( nm e l a n o g a s t e r ) m e d i a t i n gs y n t h e s i s o ft h ei n s e c tm o l t i n gh o r m o n e ，d i s t a n tr e l a t i o n s h i pw i t hc y p 6 8 1 僻p o l y x e n e s ) m e t a b o l i z ep l a n t a l l e l o c h e m i c a l s ，c y p 6 d i ( m d o m e s a c a ) l i n k i n gt op y r e t h r o i dr e s i s t a n c e a n do t h e rm e m b e r so f c y p 6f a m i l y 4 e x p r e s s i o ni n v e s t i g a n t i o n t h er e c o m b i n a n to fp d e s t 1 7 - - c y p 6 b k l 7w a so b t a i n e dt oe x p r e s st h er e c o m b i n a n tp r o t e i no f c y p 6 b k l 7 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f e c t e di n t ob l 2 1 ( d e 3 ) s d s - p a g es h o w e dt h a t c y p 6 b k l 7w a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nb l 2 1 ( d e 3 ) t oc o m p a r et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fc y p 6 b q l 3 v 2g e n ei nt h ed i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s o fzc a s t a n e u m ，q r t - p c ra n a l y s i sw a sp e r f o r m e d t h ed e v e l o p m e n t a le x p r e s s i o ni nt h ea d u l t sa n d i m m a t u r es t a g e sr e v e a l e dt h a tc y p 6 8 01 3 v 2w a se x p r e s s e da ta l ll i f es t a g e si n v e s t i g a t e d t h e m r n a e x p r e s s i o nl e v e l si nt b b1 s ti n s t a rw a s1 4 9a n d3 8 6f o l d sh i g h e rt h a nt h o s ei np u p a ea n d a d u l t s ，r e s p e c t i v e l y t h ec y p 6 b q1 3 v 2e x p r e s s i o na p p e a r e di nt h eo r d e ro f1 s ti n s t a rl a r v a e 4 t h i n s t a rl a r v a e 7 t hi n s t a rl a r v a e a d u l t p u p a e k e yw o r d ：t r i b o l i u mc a s t a n e u m ；p 4 5 0 ；m o l e c u l a rc l o n i n g ；r e a l - t i m ep c r i v 缩略词 缩略词 缩写 英文全称中文译名 b p c d n a c x s d e p c d n t p e b e d l = a i p t g o l i g o p c r r n a r n a s e r t r p m t a q 1 脯s b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a c a r b a m a t e s d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d i s o p r o p y l - t h i o 1 3dg a l a c t o s i d e o l i g o n u c l e o t i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e a s e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s e m i n e s t e dp c r t h e r m u sa q u a t i c u s 碱基对 互补脱氧核糖核酸 氨基甲酸酯 焦碳酸二乙酯 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 异丙基b d 硫代半乳糖苷 寡核苷酸 聚合酶链式反应 核糖核酸 核糖核酸酶 反转录 每分钟转数 半套式p c r 栖热水生菌 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三( 羟甲基) 氨基甲烷 x - g a l 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 i n d o l y l d g a l a c t o s i d e5 溴一4 一氯一3 一吲哚一b d 半乳 6 9 独创性声明 学位论文题目：麦拯签姿细胞鱼塞笪5 q 基国笪直隆! 庄到佥援丛麦 鲨婴塞 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 标注。 学位论文作者：彳劬3 纭签字日期：2 。0 9 年。5 月猫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止)。 学位论文作者签名： 绦多弦 样嗍：砷年岁月 导师签名： 第一章文献综述 第一章文献综述 1 赤拟谷盗 赤拟谷盗t r i b o l i u mc a s t a n e u m ( h e r b s t ) 隶属于鞘翅目c o l e p t e r a ，拟步甲 科t e n e b r i o n i d a e ，拟谷盗属t r i b o l i u m ，是具有重要经济意义的世界性储粮害虫。 由于繁殖力强，易于饲养，所占空间小，适应力好等特点，常被作为实验生物， 现已成为重要的模式昆虫。 1 1 赤拟谷盗的发生与危害 赤拟谷盗在世界范围内分布广泛，寿命长，适应性强，繁殖快，严重危害粮 食、油料、肉类及其加工品、毛皮、皮革、动植物性药材、昆虫标本等达一百多 种商品，食性非常复杂，是严重的储藏物特别是豆类、糜类和谷类害虫( s p r a t t ， 1 9 8 4 1 白旭光，2 0 0 2 ) 。 由于赤拟谷盗具有群集性，当秋冬季节来临时，大量的赤拟谷盗成虫群集在 一起，可能造成粮食局部发热霉变，从而影响储粮安全。赤拟谷盗对花生等油料 作物的危害及导致的污染比其它蛀食性储粮害虫还要严重。在澳大利亚，赤拟谷 盗已成为油菜籽的重要害虫( d a v i s ，1 9 9 8 ) 。通常人们将赤拟谷盗列为后期性害 虫，是小麦的次要害虫。但研究发现赤拟谷盗可以在完整的小麦中发育，有麦胚 暴露是幼虫存活的基本条件( f r a e n k e la n db l e w e t t ，1 9 4 3 ：p a r k ，1 9 6 4 ) 。赤拟谷 盗在我国储藏原粮如小麦中常有发生( 王光春，2 0 0 7 ) ，甚至会达到相当高的密度。 赤拟谷盗不仅直接取食粮食，而且还是谷物产品的间接污染物。其成虫体上的臭 腺还能分泌含有苯醌致癌物质的臭液，使被害物产生腥霉臭气，面粉被害则结成 块状，导致变色发臭不能食用，造成的损失极为严重( 仵均祥，2 0 0 3 ) 。 赤拟谷盗适应环境的能力也在不断增强，如在河南郑州市当环境温度1 0 左 右时，仍可看到其在粮包和仓库内活动，这与过去文献上介绍的生存温度相比低 了许多。据报道，在赤拟谷盗与其近缘种杂拟谷盗( t r i b o l i u mc o n f u s u m ) 同生态 环境竞争中，赤拟谷盗往往获胜( p a r k ，1 9 6 4 ) ；另外，赤拟谷盗具有极强的耐饥 饿能力，约是谷蠹( r h y z o p e r t h ad o m i n i c a ) 及米象( s i t o p h i l u so r y z a e ) 的4 倍 ( d a g l i s h ，2 0 0 6 ) 。在近2 0 年的储粮害虫防治中，关于赤拟谷盗对化学药剂的抗 性问题也有较多地反映。以上种种现象说明，赤拟谷盗对环境的适应性在发展， 其发生范围、发生频率、防治难度都表现出增大的趋势，是经济意义较为重要的 一种储藏物害虫。 赤拟谷盗还是克氏伪裸头绦虫病的中间宿主( 徐洪忠和危粹凡，1 9 9 9 ) 。克氏 伪裸头绦虫是一种人畜共患寄生虫，寄生于人和猪的小肠内引起疾病。我国已有 1 + 两南人学硕十学何论文 上海、陕西等省市相继报道，贵州省也曾有报道。该虫的中间宿主为赤拟谷盗， 因此，对赤拟谷盗的研究也为克氏伪裸头绦虫病的防治提供了科学依据。 1 2 赤拟谷盗作为模式生物研究进展 由于繁殖力强，世代间隔短，群体所占空间小，饲养简单，适应力强，很少 发病，易于管理，数量性状易于观测，易于遗传学的杂交，基因操作方便，允许 运用化学诱变、透射、二元转座子等方法屏蔽其有效的遗传学信息等特点，赤拟 谷盗已成为非常重要的模式昆虫( t r i b o l i u mg e n o m es e q u e n c i n gc o n s o r t i u m ， 2 0 0 8 ) 。赤拟谷盗基因工程的主要负责人之一，堪萨斯州立大学教授d e n e l l 认为， 利用赤拟谷盗易于培养、生命周期短和温和的遗传背景能够创造出复杂的方法学。 早在2 0 世纪5 0 年代赤拟谷盗就被用于数量遗传学研究，美国普度大学b e l l 教授 和他的学生们首先利用这种昆虫作为导航实验生物，很快人们发现赤拟谷盗这种 全变态昆虫在改进数量性状和测定选择方法方面比果蝇更有效。现在赤拟谷盗和 果蝇一样是主要的昆虫遗传系统，也给其它的研究提供了便利。其优点主要体现 在：( 1 ) 遗传学研究方面，赤拟谷盗有9 对常染色体和1 对性染色体，与果蝇( 共 4 对) 相比，其变异的复杂性更接近于高等生物；( 2 ) 发育研究方面，赤拟谷盗 的幼虫具有完整的头部和3 对胸足，其胚胎也具有完整的对称性，这与果蝇模式 不同，但和脊椎动物更为相似；( 3 ) 基因序列和功能研究方面，由于赤拟谷盗的 遗传和发育更接近高等动物，其基因序列将为人类和果蝇的基因组研究提供联系， 有可能找到人类和非人类基因信息方面的联系，尤其可以填补果蝇基因组研究中 发现的空缺。 赤拟谷盗还被誉为遗传学与家畜育种的桥梁。赤拟谷盗世代间隔短适于作长 期选择效果的研究；其突变位点丰富，可区分的约1 7 0 种之多，也是杂交试验的 良好材料；所占空间小的特点可用于研究大随机交配群体的遗传漂变、基因频率 的变化及保种理论。研究者已用它探讨加性和非加性基因作用、近交与杂交效应， 遗传与环境互作、母体效应、非线性技术研究、实验设计验证及统计方法等。新 的遗传学研究成果往往先用赤拟谷盗检验，然后用于家畜家禽。历届遗传学应用 与畜牧生产国际会议上，均有多篇用赤拟谷盗为实验材料的论文被宣读。 赤拟谷盗已被研究的性状有：卵长、卵宽、卵重、后代数、受精率、蛹长、 蛹宽、蛹重、不同日龄幼虫体重、成虫体重、生长速率等。另外，赤拟谷盗已被 选作宇宙科学的实验生物之一，由宇宙飞船载入了太空。 2 0 0 8 年，赤拟谷盗的全基因组测序已经完成。赤拟谷盗的基因组包括大约2 亿个核苷酸，基因( 或蛋白) 数量大约有1 6 0 0 0 个。现在，赤拟谷盗的基因组数 据已在各方面的研究中得到广泛运用，如张淋淋等( 2 0 0 8 ) 利用全基因对赤拟谷 2 第一章文献综述 盗微卫星的丰度和分布进行了比较分析，p a r k 等( 2 0 0 8 ) 对赤拟谷盗的转录本进 行了分析，e n g s o n t i a 等( 2 0 0 8 ) 对赤拟谷盗气味结合受体基因家族进行了分析研 究。另外，科学工作者还利用赤拟谷盗全基因对赤拟谷盗的乙酰胆碱酯酶基因、 细胞色素p 4 5 0 基因进行分析。随着分子生物学、基因工程技术、生物信息学等 相关学科的迅速发展，赤拟谷盗基因组数据将被广泛应用于分子遗传学、分子生 态学、分子分类学、医学、毒理学等领域，有望在昆虫有益物质利用以及害虫的 生态调控等方面取得重大突破。 2 细胞色素p 4 5 0 酶系与细胞色素p 4 5 0 氧化酶 2 1 细胞色素p 4 5 0 酶系 细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系( c y t o c h r o m ep 4 5 0m o n o o x y g e n a s e s ，p 4 5 0 s ) 主要 位于某些细胞的光滑内质网上，为氧化酶系。广泛分布于动物、植物和微生物等 生物体内。该酶系中主要组成部分为细胞色素p 4 5 0 ，其p 4 5 0 蛋白与c o 的结合 体在4 5 0 n m 处有特征吸收峰，故将该酶系命名为细胞色素p 4 5 0 酶系。 p 4 5 0 酶系因其功能和特性的不同曾有多种命名：多功能氧化酶( m i x e d f u n c t i o no x i d a s e ，m f o s ) 、细胞色素p 4 5 0 酶系、单加氧酶、芳香烃羟化酶、药物 代谢酶等( n e l s o n ，2 0 0 6 ) 。命名为多功能氧化酶源于当还原型辅酶i i ( n a d p h ) 和分子氧存在的前提下，该酶系在生物发育过程中调节诸如甾体、激素和脂肪酸 等内源化合物的滴度( t i t e r s ) ，以及对药物、农药、植物毒素等生物异源物质进行 降解代谢和合成代谢；此外，由于在该酶系中决定整个系统底物专一性是细胞色 素p 4 5 0 与氧分子和底物结合，参与氧的活化，反应中结合半个分子氧形成水， 而另外半个分子氧使底物氧化而进入产物，其实质是单加氧作用，故又称其p 4 5 0 单加氧酶。上世纪末期学者普遍认同该命名，认为该名称比多功能氧化酶更为确 切。近年来的研究表明，细胞色素p 4 5 0 酶系可能是自然界中最具催化多样性的 生物催化剂( c o o ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。因此，有学者提出细胞色素p 4 5 0 这惯用名称已 不能很好地表示这一类物质，而提出用多样酶类( d i v e r s o z y m e ) 命名这一血红蛋 白家族。 细胞色素p 4 5 0 蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使p 4 5 0 酶系可以催化多 种类型的反应，另外其特殊的光谱性质及诱导底物多样性和生物合成的可诱导性 等特性在其他酶系中并不常见。因此，细胞色素p 4 5 0 酶系对杀虫剂以及其它环 境有毒物质具有代谢作用，在昆虫的选择毒性和抗性中，在一些起重要生理功能 的内源性物质如激素( 如保幼激素和蜕皮激素) 和脂肪酸的代谢中，在昆虫对寄 主植物的适应性中都具有十分重要的作用。 3 两南大学硕十学何论文 2 2 细胞色素p 4 5 0 氧化酶 细胞色素p 4 5 0 是细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系的末端氧化酶，在整个p 4 5 0 s 中 起术端氧化酶( t e r m i n a lo x i d a s e ) 的作用，决定着p 4 5 0 酶系底物的广泛性和专一 性。它是一类结构类似而又不尽相同、性质类似而又有差异的一类大小约 4 6 6 0 k d a 的蛋白质。细胞色素p 4 5 0 几乎存在于包括细菌、真菌、植物和动物在 内的所有有机体中，根据细胞色素p 4 5 0 氧化酶在生物体中的分布可以分为两大 类。第一类是细菌线粒体型，存在于细菌和真核细胞线粒体中，从n a d h ( 细菌 p 4 5 0 ) 或n a d p h ( 真核细胞线粒体型p 4 5 0 ) 获得电子，通过两个蛋白组成的氧 化还原链( f a d 还原酶和f e s 蛋白) 传递给细胞色素p 4 5 0 ；第二类是微粒体型， 存在于真核细胞微粒体中，从n a d p h 获得电子直接通过n a d p h 细胞色素p 4 5 0 还原酶传递给p 4 5 0 。线粒体细胞色素p 4 5 0 并不参与提供能量，一般认为线粒体 中的细胞色素p 4 5 0 具有严格的底物专一性，主要代谓! 内源性化合物，对外来物 质无代谢作用( 冷欣夫和邱星辉，2 0 0 1 ) ，但是在家蝇线粒体中发现的细胞色素 p 4 5 0 氧化酶c y p l 2 a 1 能够降解杀虫剂( g u z o ve ta 1 ，1 9 9 8 ) 。由于p 4 5 0 蛋白种 类的多样性和底物的重叠性使p 4 5 0 酶系可以催化多种类型的化学反应，对多种 内外源化合物具有代谢和活化的作用。 另外，细胞色素p 4 5 0 根据电子从n a d ( p ) h 传递到活性位点的方式分为四 类：i 类p 4 5 0 蛋白需要f a d 还原酶和铁硫还原蛋白；i i 类p 4 5 0 蛋白仅需要含f a d ( f m n ) 的p 4 5 0 还原酶；i i i 类酶，自己供给，不需要电子供体；l v 类p 4 5 0 直 接从n a d ( p ) h 接受电子。需要注意的是这种与还原部分相互作用的分类方式 与p 4 5 0 的进化历史无关( f e y e r e i s e na n dw e r c k r e i c h h a t ，2 0 0 0 ) 。 2 2 1 细胞色素p 4 5 0 的保守结构区 细胞色素p 4 5 0 的氨基酸序列同源性很低，有时不足2 0 ，且仅有3 个绝对 保守的氨基酸。但p 4 5 0 晶体结构显示，这种高度的变异性并不能排除普通拓扑 图( g e n e r a lt o p o g r a p h