（动物遗传育种与繁殖专业论文）利用微卫星标记分析8个亚洲水牛群体遗传结构.pdf

利用微卫星标记分析8 个亚洲水牛群体遗传结构 研究生：王冬蕾 导师：常洪教授 ( 扬州大学动物科学与技术学院) 摘要 本研究根据联合国粮农组织( f a o ) 和国际动物遗传学会( i s a g ) 联合推荐 的1 3 个微卫星标记，以a b l 3 1 0 0 - a v a n t 全自动基因序列分析仪为平台，结合荧光 多重p c r 技术，对6 个中国地方水牛品种( 德昌水牛、兴隆水牛，富钟水牛、 温卅i 水牛、东流水牛、福安水牛) 和2 个引进水牛品种( 摩拉水牛、尼里一拉菲 水牛) 进行遗传结构分析。通过计算遗传杂合度、多态信息含量、奈氏遗传距离 和奈氏标准遗传距离，采用邻近结合法和非加权组对算术平均法进行聚类分析和 群体遗传结构分析了8 个亚洲水牛群体内和群体间的遗传变异，结果如下： 8 个水牛群体在1 3 个微卫星座位中共检测到1 5 7 个等位基因，其中7 个群体 具有各自的特有等位基因，其和为2 3 ；该8 个群体在1 3 个微卫星座位的等位基 因数在4 4 6 8 之间，有效等位基因数在2 2 9 0 8 4 2 3 0 8 之间，杂合度在 0 4 9 5 1 0 7 1 9 4 之间，多态信息含量在0 4 4 9 5 - - 0 6 7 7 6 之间。 总群体在1 3 个微卫星位点上的基因多样度在0 6 3 0 1 - - 0 8 8 9 7 之间，平均为 0 7 6 7 1 ；亚群体的基因多样度在0 4 5 1 9 - - 0 8 0 6 2 之间，平均为0 6 5 7 9 ，低于总群 体杂合度；基因分化系数平均为o 1 4 2 4 。在总变异中，有1 4 2 4 的变异来自群体 间。 1 3 个微卫星座位中，除i l s t s 0 3 3 和c s s m e 0 7 0 座位为中度多态性座位外， 其余1 1 个座位为高度多态座位，是适合分析水牛遗传多样性的多态标记； 2 个引进水牛品种与6 个国内水牛群体之间的遗传距离较远。国内群体中， 无论在奈氏遗传距离( d a ) 还是奈氏标准遗传距离( d s ) 中，德昌水牛与福安水 牛距离最远，东流水牛与富钟水牛距离最近。 聚类分析表明8 个亚洲水牛群体聚为3 大类，第一大类有：富钟水牛、东流 水牛、兴隆水牛、温州水牛和福安水牛；第二大类德昌水牛独自聚为一类；第三 大类：两个引进品种聚为一类。 关键词：水牛；微卫星；遗传多样性；多重p c r ；荧光引物 a n a l y s i so nt h eg e n e t i cs t r u c t u r eo fe i g h tb u f f a l o p o p u l a t i o n si na s i au s i n gm i c r o s a t e l l i t em a r k e r s m s c a n d i d a t e ：w a n gd o n g l e i a d v i s o r ：p r o f c h a n gh o n g ( c o l l e g e o f a n i m a l s c i e n c e a n d t e c h n o l o g y , y a n g z h o u u n i v e r s i o _ ，) t h eg e n e t i cs t r u c t u r ea m o n g6c h i n e s en a t i v eb u f f a l op o p u l a t i o u s ( d e c h a n g 、 x i n g l o n g 、f u z h o n g 、w e n z h o u 、d o n g l i u 、f u a n ) i nc o m p a r i s o nt o2i n t r o d u c e db u f f a l o b r e e d s ( m u r r a h 、n i l i - r a v i ) w a sa n a l y z e du s i n g 1 3m i c r o s a t e l l i t ed n am a r k e r s r e c o m m e n d e db yf a oa n di s a ga n d f l u o r e s c e n c e m u t i p l e xp c rb a s e d o n a b l 3 1 0 0 - a v a n t t h e g e n e t i ch e r e o z y g o s i t y ( 1 - i ) ，p o l y m o r p m s m i n f o r m a t i o n c o n t e n t ( p i e ) ，g e n e t i cd i s t a n c ea m o n gt h e s ep o p u l a t i o n sw e r ec o m p u t e da n dt h e s e8 b u f f a l op o p u l a t i o n sw e r ec l u s t e r e d ，p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ，p o p u l a t i o ns t r u c t u r e a n a l y s i sw e r eu s et oe v a l u a t et h eg e n e t i cv a r i a b i l i t yw i t h i nb r e e d sa n dg e n e t i c r e l a t i o n s h i p sa m o n gb r e e d s t h er e s u l t sw e r e a sf o l l o w s ： 1 5 7a l l e l e sw e r ed e t e c t e dw h e nt h i r t e e l lm i e r o s a t e l l i t el o c iw e r ea n a l y z e di n 8 b u f f a l op o p u l a t i o n s 7p o p u l a t i o n sh a v et h e i ro w nu n i q u ea l l e l e s ，t h et o t a ln u m b e ri s2 3 缸t oa l lt h ee i g h tp o p u l a t i o n s ，n u m b e ro f a l l e l e sw a sb e t w e e n4 4 6 - 8 ，e f f e c t i v en u m b e r o f a l l e l e so e ) w a sb e t w e e n2 2 9 0 8a n d4 2 3 0 8 ，h e t e r o z y g o s i t y ( h 0w a sb e t w e e n0 4 9 51 a n do 7 1 9 4 ，a n dp o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t 口i c ) w a sb e t w e e n0 4 4 9 5a n d 0 6 7 7 6 t h eg e n ed i v e r s i t yo ft o t a lp o p u l a t i o n sa la l lm i c r o s a t e l l i t el o c iw a sb e t w e e n 0 6 3 0 1a n do 8 8 9 7 ，t h ea v e r a g ew a so 7 6 7 1 t h eg e n ed i v e r s i t yi ne v e r yp o p u l m i o na t a l lm i c r o s a t e l l i t el o c iw a sb e t w e e n0 4 5 1 9a n do 8 0 6 2 ，t h ea v e r a g ew a so 6 5 7 9 ，w a s l o w e rt h a nh e t e r o z y g o s i t yo ft o t a lp o p u l a t i o n s t h ec o e f f i c i e n to fg e n ed i f f e r e n t i a t i o n w a so 1 4 2 4 1 4 2 4 o ft h e g e n e t i c v a r i a t i o ni nt h et o t a ld i f f e r e n t i a t i o nw a s w i t h i n - p o p u l a t i o n b e s i d e si l s t s 0 3 3a n dc s s m e 0 7 0w e r eo fm i d d l ep o l y m o r p h i s ml o c i ，t h eo t h e r e l e v e no f t h et h i r t e e nm i c r o s a t e l l i t el o c iw e r eo f h i g hp o l y m o r p h i s m ，a n dc o u l d b eu s e d t oa n a l y z ep r o p e r l yg e n e t i cd i v e r s i t yo f t h ei n v o l v e db u f f a l op o p u l a t i o n s t h eg e n e t i cd i s t a n c e sb e t w e e n6c h i n e s eb u f f a l op o p u l a t i o n sa n d2i n t r o d u n c c b r e e d sw a sf a rf r o me a c ho t h e r n o to n l yd ab u ta l s od s ，t h eg e n e t i cd i s t a n c e s b e t w e e nd e c h a n ga n df u a l lw a st h ef a r r e s t ，d o n g l i ua n df u z h o n gw a st h en e a r e s ti n c h i n e s ep o p u l a t i o n s e i g h tb u f f a l op o p u l a t i o n sw e r ec l u s t e r e dt o ：f u z h o n g 、d o n g l i u 、x i n g l o n g 、 w e n z h o ua n df u a nw e r ei nt h ef i r s tg r o u p t h es e c o n dg r o u p ：d e c h a n gh a di t so w n b r a n c h t h et w oi n t r o d u c e db u f f a l ob r e e d sw e r ei nt h et h i r dg r o u p k e yw o r d s ：b u f f a l o ，m i c r o s a t e l l i t el o c i ，g e n e t i cd i v e r s i t y , m u l t i p l ep c r , f l u o r e s c e n c e p r i m e r 王冬蕾：利用微卫星标记分析8 个亚洲水牛群体遗传结构 ! l 刖舌 1 1 中国水牛概况 1 1 1 中国水牛在动物分类学上的地位 牛在动物分类学上属于脊椎动物亚门( v e r t e b r a t a ) ，哺乳纲( m a m m a l i a ) ，偶蹄 目( a r t i o d a c t i a ) ，反刍亚目( r u m i n a f i a ) ，洞角科( c o v i c o m i a ) ，牛亚科( b o v i n a e ) 。其 中牛亚科家畜主要包括家牛属( b o s ) 、水牛属( b u b a l u s ) 、野牛属( b i s o n ) 、准野牛 属( b i b o s ) 及非洲野水牛属( s y n c e r u s ) 等。水牛属包括亚洲水牛( b u b a l u sb u l a l u s ) 、 菲律宾水牛( b u b a l u s ) 和印尼水牛( b u b a l u sd e p r e s s i e o m i s ) ，亚洲水牛又包括沼 泽型( s w a m p ) 和河流型( r i v e r ) 两个亚种。中国水牛属于沼泽型水牛，由于中 国分布地域辽阔，各地自然生态条件差异较大，归纳起来可分为四个类型：( 1 ) 滨海型，分布于东海、黄海的沿海地区；( 2 ) 平原湖区型，分布于长江中下游平 原；( 3 ) 高原平坝型，分布于云贵川高原的平坝、河谷和山塬地区；( 4 ) 丘陵山 地型，分布于华东、华中、华南及西南低山丘陵地区。滨海型为大型水牛，平原 湖区型和高原平坝型为中型水牛，丘陵山地型为小型水牛n - 3 1 。本研究中，东流、 德昌水牛属于中型水牛；温州水牛、福安水牛、兴隆水牛、富钟水牛属于小型水 牛。 1 1 2 世界水牛现状及其发展趋势 水牛作为一种古老而又尚未得到充分开发的畜种，目前正成为世界畜牧业研 究和开发的一个热点。水牛选育程度相对较低，具有较强的生命力、抗病力和耐 粗饲的能力，到目前为止，全世界还没有一例水牛发生疯牛病或痒病的报道。世 界各国对水牛的研究开发力度不断加大，无论发达国家还是很多发展中国家都把 一定的财力和人力投入到水牛业及其产品特别是乳制品的研究和开发中，甚至包 括一些历史上无水牛分布而且生态环境和条件并不十分适宜于饲养水牛的国家如 英国和加拿大。近1 0 年来水牛饲养头数大幅度增加，但中国增长幅度较小。 据f a o ( 2 0 0 4 年) 统计，全世界水牛存栏总数为1 7 2 7 1 9 万头，分布在1 2 9 个国家，其中1 6 7 2 7 3 万头分布在亚洲，占世界总数的9 7 。中国水牛总数为2 3 8 0 扬州大学硕士学位论文 2 万头，占世界水牛总数的1 3 2 ，居世界第三位。2 0 0 4 年中国水牛奶产量为2 7 0 万吨，占全球的3 5 6 ，居世界第三位 4 - 6 1 。 1 1 3 本研究所涉及的中国地方水牛品种资源概况 德昌水牛 产地分布：德昌水牛主产于四川省凉山彝族自治州安宁河流域的德昌、西昌、 冕宁、会理等县和渡口市的米易县，分布在凉山全州及渡口市郊各县，海拔为 4 8 0 2 5 2 0 m 。据1 9 8 1 年统计，有1 9 2 ，1 9 2 头。 外貌特征：德昌水牛头中等大，额宽广而稍隆起，颜面部较长而直，角根粗， 角架大，角长l m 以上者甚多，角间距有达1 8 0 c m 多。公牛颈粗短，母牛颈细长， 颈肩结合良好。体躯紧凑( 体长指数：公牛1 0 4 8 ，母牛1 0 4 9 ) ，前躯发育良好( 胸 围指数：公牛1 5 0 3 ，母牛1 5 0 6 ) ，胸部较深而宽度适中，髻甲部高于十字部。背 腰平直，腰短兼小，腹圆大充实。尻稍斜，后躯欠丰满；尾根粗，尾长适中。四 肢粗壮，系短而有力，蹄圆大质坚。被毛稀而短，毛色多为瓦灰。德昌水牛体躯 魁伟，成年公牛体重5 2 7 3 4 - 9 7 5 k g ，成年母牛体重4 9 0 o 士2 3 9 k g ，成年阉牛体重 5 9 8 o 士2 7 2 k g 。德昌水牛有良好的耕作能力和持久力，主要性能为役用。 兴隆水牛 产地分布：海南省万宁市西南及西北一带。 数量：1 9 8 2 年存栏2 4 2 万头。主要特性：体型较大，被毛灰黑色或黑色，少 数白色，颈下有“v ”字型的白色带。角粗长，里长弓形向后上方弯起。体躯宽长， 腰背微凹，尻稍斜，四肢粗壮。成年公牛体高为1 2 9 c m ，母牛为1 2 4 c m 。公牛体 重为5 0 0 k g ，母牛为4 6 0 k g 。载重力一般为5 0 0 6 0 0 k g ，最高挽重8 0 0 k g 。屠宰率 为5 3 ，净肉率为4 1 。繁殖率为8 2 ，成活率为8 5 以上。母牛初情期2 3 岁，公牛初配期3 岁，多数两年一胎。 富钟水牛 产地分布：广西的富川和钟山。 数量：1 9 8 1 年存栏5 7 万头。主要特性：体型高大、粗糙紧凑，发育匀称。 毛色有黑灰和石板青两种，颈下胸前有条新月形的白带。头大小适中，角根粗， 王冬蕾：利用微卫星标记分析8 个亚洲水牛群体遗传结构! 呈四方形，向后弯曲成半月形。背腰宽且平直，母牛后躯发达，尻略斜，乳房柔 软，乳头呈圆柱状，左右对称。四肢粗壮，蹄圆结实。成年公牛体高为1 2 4 e m ， 母牛为1 2 5 e r a 。公牛体重为4 2 0 k g ，母牛为4 1 5 k g 。公牛每小时耕地为5 0 0 多m 2 ， 母牛为4 4 0 多m 2 。平均屠宰率为4 4 ，平均净肉率为3 3 。公牛性成熟期2 5 岁， 母牛2 5 3 5 岁，母牛初配年龄3 5 4 5 岁，繁殖率为6 1 ，犊牛成活率为9 4 。 温州水牛 产地分布：浙江省温州市 数量：1 9 8 1 年存栏4 1 万头。主要特征：体型矮壮，结构紧凑，肌肉丰满。 被毛青灰色居多，黑色和黄褐色次之。头长方形，眼内角有白星，下颌腹侧中间 有一肉疣隆起，角呈八字形、半月形或圆弧形。颈长短适中，向前平伸，腰背平 直，腹大而圆，尻部倾斜度大，后躯发育良好，乳房发达。四肢粗壮端正，筋腱 明显，蹄圆质坚。成年公牛体高为1 2 7 e m ，母牛为1 2 3 e m 。公牛体重约5 2 0 k g ，母 牛为5 0 0 k g 。泌乳期2 4 0 天，泌乳量5 0 0 1 0 0 0 k g ，乳脂率8 5 一9 7 。它的鲜奶 含脂率为黑白花奶牛含脂率的2 5 倍。据浙江省农林牧渔业名特优品种资源集 等书记载，温州水牛为役乳两用牛。 东流水牛 产地分布：安徽省沿江滨湖地区。数量：1 9 8 1 年存栏3 万头。 主要特性：体型中等偏大，体质结实而紧凑，骨骼粗壮，肌肉发达。前躯硕 壮，后躯欠佳。被毛以青灰色为主，黑褐色次之，白色极少，颈下胸前有月牙形 白色颈带”。角呈半月状向前或内弯曲。蹄大而圆，蹄质坚硬。成年公牛体高1 3 2 e m ， 母牛为1 2 6 e m 。公牛体重为5 5 0 k g ，母牛为5 0 0 k g 。公牛最大挽力为3 4 0 4 4 0 k g ， 母牛为2 2 0 3 2 0 k g ，耕水田时一般挽力为l l o 1 3 5 k g 。屠宰率为4 1 4 3 ，净 肉率约3 0 ，骨肉比1 ：2 9 1 ：2 8 。挤奶期9 1 0 个月，日挤奶2 k g 。公牛1 7 2 4 月龄性成熟，母牛1 7 月龄，初配期3 岁，繁殖率为4 6 ，成活率为7 8 。 福安水牛 产地分布：福建省福州、福安等地。 数量：1 9 8 0 年存栏7 万头。主要特性；体躯高大，肌肉坚实丰满。被毛青黑、 扬州大学硕士学位论文 一4 青灰、浅褐等色，四肢飞节以下和下腹呈灰白和白色，膝关节下和蹄各有一圈明 显的黑带。颈部丰厚，髻甲略高，背腰宽平且短，腹大而不下垂。四肢粗壮，少 数后肢的飞节略向内靠，蹄圆质坚。成年公牛体高为1 2 9 c m ，母牛为1 2 5 c m 。公牛 体重约5 2 0 k g ，母牛为4 6 0 k g 。役力强而耐久，公牛挽力为1 4 5 k g ，最大挽力为2 2 0 k g ， 阉牛分别为1 5 8 k g 和2 7 5 k g 。阉牛屠宰率为5 5 6 8 ，净肉率为3 3 3 7 。泌乳 期1 5 0 3 0 0 天，泌乳量为3 7 5 6 0 0 k g ，平均日产奶约3 k g 。公牛初配年龄为2 5 3 岁，母牛为3 岁，繁殖率为6 0 ，成活率为9 5 。 1 2 家畜遗传多样性 1 2 1 家畜遗传多样性的含义及其保护的意义 广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。但一般所指 的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个群体内不同个体的 遗传变异总和。家畜遗传多样性是指所有的家畜及其野生近缘种的种间和种内的 遗传变异的总和。其中不仅包括了不同种家畜间的遗传变异差异，还包括了同种 家畜内不同品种间和品种内共同的和特异的基因及其组合体系。 我们对家畜遗传多样性的分析与评估也就是为了更好的保护家畜的遗传多样 性，从而达到更好的保护我国优良的家畜遗传资源的目的，为家畜遗传资源的保 护、评估及开发利用提供更加合理的理论依据。家畜遗传多样性的保护就是要尽 量全面、妥善地保护现有的家畜遗传资源( a n i m a lg e n e t i cr e s o u r c e s ) 或种质资源 ( g e r m p l a s mr e s o u r c e s ) ，使之免遭混杂和灭绝，其实质就是使现有的畜禽基因库 中的基因资源尽量得到全面保存，无论这些基因目前是否有利用价值。虽然保持 一个特定的保种群的成本是非常可观的，但是这种投入比完全忽视畜禽遗传多样 性保存导致对未来丧失应变能力所带来的损失要低的多。家畜遗传多样性是长期 进化形成的宝贵资源，它的任何一点利用都可能在类型、质量、数量上给畜牧业 生产带来革命性的创新 7 1 。 畜禽品种是在特定的自然生态环境和社会历史条件下经过人类长期驯化、培育 形成的，对这些遗传资源的保存也为一个国家的文化历史遗产提供了活的见证， 反映了人类在进化过程中对野生动物的驯化及培育的历史。可以利用群体间以及 王冬蕾：利用微卫星标记分析8 个亚洲水牛群体遗传结构 ! 个体见的遗传变异来研究动物的发育和生理机制，并深入了解动物驯化、迁徙进 化、品种形成过程以及其它一些生物学基础问题【8 】。 1 2 2 遗传多样性的研究方法及在水牛中的进展 研究遗传多样性的方法随生物学，尤其是遗传学和分子生物学的发展而日益 成熟和多样化，可从不同角度和层次来揭示物种的变异。包括形态学标记、细胞 学标记、生化学标记和d n a 分子标记。 一个理想分子标记应具有： 高度多态，以保证个体或系在每一个基因座都可能携带不同的等位基因 丰富性，以保证足够多的标记覆盖整个基因组； 中性，对所研究的数量性状和适应性等都是呈中性的； 共显性，以保证标记某基因座上所有的基因型都可以被识别嘲。 1 2 2 1 形态和生理遗传标记 形态和生理遗传标记可以作为家畜家禽群体起源、地方品种特征特性的标志， 这类标记包括许多方面，主要有颜色、体型、外形等。在不同的生态条件下，各 地水牛群体的形态外貌特征也表现出多样性。水牛角的长短、粗细与头部发育相 适应，头轻则角细短，头重则粗长。有不同的角型，被毛密度不一，毛色深浅有 别，皮肤颜色、有无黑色素斑块及斑块大小、性状都不尽一致”0 】。水牛的毛色遗 传方式比较简单主要受两个基因座位控制：一个是决定皮肤颜色的基因座位，一 个是决定被毛颜色的基因座位【l l l 。 1 2 2 2 细胞遗传多样性 染色体核型分析的出现将遗传标记转向细胞学水平。染色体是遗传物质的载 体，基因的携带者，在生物性状的世代传递过程中起主要作用。染色体结构和数 目的变异是生物遗传变异的重要来源。染色体结构变异包括缺失、倒位、重复、 异位等，其实质是遗传物质或遗传信息的增减或位置改变【1 2 l 。 染色体水平的多态性对物种的适应及其进化具有重要意义。但由于染色体分 带技术的技术性较强，易受实验条件的影响，且大多数染色体具有这种细胞学标 记的数目有限，导致细胞学标记对某些不具有特异性带型的染色体或片段进行鉴 扬州大学硕士学位论文 ! 定时结果的可靠性略差。西林水牛”l 、德昌水牛【1 4 1 染色体核型的研究表明，中国 水牛的染色体数2 n = 4 8 ( 4 6 条常染色体，2 条性染色体) ，n f = 5 8 。 1 2 2 3 血液蛋白标记 自1 9 5 5 年s m i t h i e s 成功地采用淀粉凝胶电泳方法分离血清蛋白以来，各种电泳 技术迅速发展，实验方法不断丰富，各国学者对不同家畜的血液蛋白质多型进行 了大量研究。日本在来家畜研究会从2 0 世纪6 0 年代开始对亚洲各国( 老挝、孟加 拉国、缅甸、斯里南卡等) 近4 0 个水牛群体的血液蛋白( 酶) 近2 0 个基因座的多 态性进行了系统地研究，这其中包括中国云南省大理和西双版纳两地的水牛群体 1 5 1 。到目前为止，在牛中已发现具有多态性的蛋白质或酶有2 8 种3 6 个座位，水牛 中具有多态性的有1 2 种【1 6 】。四川农业大学对水牛血液蛋白多态性进行了大量的研 究：史荣仙等对四川水牛血液蛋白多态性进行了研究，电泳检测了长江流域5 个水 牛地方品种的血红蛋白、血清运铁蛋白多态性，对云贵高原水牛血液蛋白多态性 进行了研究1 7 d 9 】。1 9 9 3 年付茂忠等 2 0 1 对海子水牛血液蛋白多态性进行了研究。郑 维明等【2 l 】对中国1 2 个水牛类群共1 0 5 8 头水牛血清自蛋白多态性进行了检测。赖松 家等对福安水牛血液蛋白多态性，中国水牛血清淀粉酶、血清运铁蛋白多态性进 行了研究 2 2 - 2 4 1 。 1 2 2 4 微卫星d n a 标记 微卫星标记是上世纪8 0 年代末发展起来的一种新型的分子标记。印度得拉巴 细胞分子生物学研究中心( c c m b ) 的水牛基因组在印度国家奶业发展委员会和生 物技术部共同资助的项目中第一期工作鉴定出4 0 0 个d n a 标记。第二阶段将研究 这些标记的遗传学意义，并对他们进行定位【2 5 l 。b a r k c t 等( 1 9 9 7 ) 采用2 1 个微卫 星位点分析了1 1 个亚洲水牛群体间的遗传变异，并与2 5 个多态性蛋白质位点相 比较，结果由微卫星分析得到的系统树与这些牛群的地理分布相同，而由蛋白质 位点得到的系统树却与之相异 2 6 1 。目前国内对水牛的遗传育种研究涉及d n a 水平 的内容较少口7 郐l 。许明( 2 0 0 5 ) 2 9 1 利用1 1 个微卫星座位对5 个中国地方水牛品 种的遗传多样性进行了研究。 王冬蕾：利用微卫星标记分析8 个亚洲水牛群体遗传结构 1 1 2 2 5 线粒体d n a 的多态性 线粒体是一种存在于所有真核动物细胞中的半自主性细胞器，由内膜、外膜、 基质和突出的嵴构成。在线粒体内部存在着线粒体自身的遗传物质一线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 和一些与有氧呼吸有关的酶。线粒体d n a 是核外唯 一的遗传物质，可以进行自我复制、转录和翻译等细胞过程，但在上述过程中却 仍然受到核遗传物质的控制。线粒体d n a 遵循母性遗传，即子代的线粒体d n a 完 全是来自于母本 3 0 1 。m t d n a 的变异主要来源于突变而非重组。线粒体d n ad 1 0 0 p 区的进化速率较其它区域又高5 1 0 倍，是目前线粒体d n a 研究的热点。正由于 m t d n a 具有这些遗传特性而被广泛地用于分子进化、生物分类、群体遗传结构及 家畜经济性状等方面的研究 3 1 - 3 5 。 b h a t 等口q 用1 3 种内切酶分析了摩拉水牛的m t d n a 。a m a n o 等口7 1 研究了沼泽 型水牛和江河型水牛的m t d n a r f l p 多态性。t a k a k a 3 8 1 用1 5 种内切酶对沼泽型水 牛和江河型水牛的m t d n a 进行了分析。l a u 【3 明检测了沼泽型、江河型水牛共1 4 个 群体5 4 个个体的c y t b 基因3 0 3 b p 序列，1 1 个群体8 0 个个体的d - l o o p 区1 5 8 b p 序 列。k i e r s t e i i l i 删等分析了6 1 头江河型水牛和1 9 头沼泽型水牛m t d n a d 1 0 0 p 序列。 h u 等1 4 1 1 应用1 8 种限制性内切酶对云南德宏水牛( 2 头) ，滇东南水牛( 7 头) 、盐津水 牛( 3 头) 进行了m t d n ar f l p 分析。赖松家【4 2 1 通过4 个地方水牛类群1 8 个个体的 m t d n ac y t b 基因4 2 0 b p 序列进行了分析。 1 3 微卫星标记 1 3 1 微卫星标记的结构及分布 在真核生物的基因组中，广泛分布着许多简单重复d n a 片段，一般每个重复 单位仅有1 4 个碱基，重复次数为1 0 - 2 0 ，这些重复的d n a 序列就称为微卫星 d n a 1 6 1 。微卫星在基因组中是均匀分布的，除着丝粒及端粒区域外，染色体的其 他区域广泛散在分布有微卫星位点( w m t e ro 。1 9 9 2 ) 1 4 3 。真核生物中平均每1 0 k b 中就存在一个简单重复的微卫星d n a ( t a u t z ，1 9 8 9 ) 嗍。研究表明，在哺乳动物 中似乎每个基因都至少存在一个微卫星标记，牛基因组中约每1 8 8 k b 就含有一个 微卫星。 扬州大学硕士学位论文 1 1 3 2 微卫星标记的特性及应用 微卫星本身的重复单位数变异是形成微卫星多态性的基础。微卫星产生的机制 一般认为是d n a 复制和修复过程中滑动错配或染色体减数分裂时姐妹染色单体不 均等交换的结果( t a c h i d a 等，1 9 9 2 ) 4 5 】。即d n a 复制过程中，当复制复合物复 制一个重复单位后，子链与模板链分离，然后与下一个或下几个重复单位重新结 合，使一个或几个重复单位形成“环凸”区域，导致重复单位拷贝数增加或减少。 重复次数的多少与微卫星位点等位基因数呈强的正相关，即重复次数越多，该微 卫星位点等位基因数也越多，多态性也越丰富( m a 等，1 9 9 6 ) 4 6 1 。目前牛微卫星 位点等位基因数的变动范围为2 1 8 个。微卫星的突变率很高，比一般的d n a 突 变高几个数量级。h e a m e 等( 1 9 9 2 ) 估计微卫星的突变率为1 0 4 x 1 0 4 4 7 1 。 联合国粮农组织( f a 0 ) 在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中， 已经将微卫星作为优先推荐的分析工具，并制定了家畜品种之间遗传距离测定的 全球方案。微卫星d n a 作为遗传标记，其优越性表现在5 个方面： 微卫星d n a 遗传遵循孟德尔遗传规律，等位基因间呈共显性遗传，以保证 每个座位上所有的基因型都被识别； 数量多且均匀分布在基因组中，因此就有大量的微卫星标记可使用； 具有丰富的多态性，使每个基因座都有携带不同等位基因成为可能： 微卫星在进化过程中所受的选择压力小，微卫星位点大部分位于染色体非 编码区，仅少数位于编码区，而自然选择，人工选择等都是根据适应性和外型进 行的选择，也就是对编码基因的选择，因而微卫星所受到的选择压力就很小，因 此利用微卫星标记来测定群体间的遗传距离，可以得出比较真实的结果。 微卫星d n a 检测容易、省时；重复性好，适于进行自动化分析。 微卫星标记广泛应用于人、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、犬、大象、老虎、孔 雀等众多物种的遗传多样性评定中微卫星能参与遗传物质的结构改变，基因调控 及细胞分化等过程，并有自身特异的结合蛋白，还能直接编码蛋白质，是一种非 常活跃的碱基序列。因此，微卫星标记已广泛应用于构建物种的遗传连锁图，研 究q t l 间的相关，构建基因图谱，制作d n a 指纹图，定位功能基因和数量性状 王冬蕾：利用微卫星标记分析8 个亚洲水牛群体遗传结构! 位点，基因诊断和系谱确认等方面。在评估动物遗传多样性上，对于关系密切的 群体如品种间，应用微卫星标记度量遗传距离，重建系统发生树己被许多研究认 为是有利的f 4 扣s 4 1 。 1 4 毛细管电泳 可以在a b l 3 1 0 0 一a v a n t 全自动基因序列分析仪中对p c r 产物进行毛细管电 泳检测，仪器自带软件g e n e m a p p e rv e r s i o n3 2 对微卫星基因型进行分析。 1 4 1 毛细管电泳设备组成 毛细管电泳设备是由石英毛细管、样品进样系统、高压电源和检测系统四部 分组成。毛细管是其十分重要的部件，一般内径为5 0 l o o u m ，长2 0 1 0 0 c r a 。影 响毛细管长度的两个因素是峰的分辨率与分离时间。一般，毛细管越长，分辨率 越好，分离时间越长。a b l 3 1 0 0 用于s t r 基因分型的毛细管内径为5 0 u m ，长为 4 7 u r n f s 5 1 。 1 4 2 毛细管电泳的原理与基本特点 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是2 0 世纪8 0 年代中后期迅速发 展起来的一项新的分离分析技术。c e 因其分离效率高、分析速度快、样品用量少、 抗污染能力强及易自动化等特点而被广泛应用于分子生物学、医学、药学、高分 子等领域，特别是在生物分析及生命科学领域中已展示了诱人的应用前景 5 6 1 。毛细 管电泳亦称高效毛细管电泳( h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s , h p c e ) ，统 指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分 配行为上的差异而实现高效、快速分离的一类液相分离技术【5 7 1 。 它与平板凝胶电泳相比，具有以下六个方面的特点5 8 1 ： d n a 样品加样、分离和检测全部自动化： 分析速度快，分离效率高，由于毛细管内径很小，表面积与体积的比率很 大，因而散热和抑制对流的能力强，所以可以施加比传统电泳高得多的电压( 3 0 k v ) ，从而提高了分离效率。由平板电泳的数小时变为毛细管电泳的几分钟； 微量，样品用量和试剂消耗少由于毛细管尺寸小，样品用量只2 3 0 n l ，所 以样品消耗少，有利于样品重复检测； 扬州大学硕士学位论文 竺 灵敏度高，定量准确； 分析成本低，毛细管电泳所使用的石英毛细管可以反复使用。其柱体积只 有几微升，分析过程中的体积流速又很小，不必消耗大量的溶剂。使用的背景电 解质浓度也很低。 柱上检测，每次每道毛细管只分离一个样品，分离完一个样品后重新自动 灌注新的胶液分离下一个样品，不需要追踪校正样品的电泳泳道，也没有因样品 间由于加样不当引起的交叉污染： 方法建立比较简单样品分离与检测一体完成，不需要扫描凝胶图。 1 5 本研究的目的和意义 地方牛种工作的发展，主要依靠对品种遗传特性的深入研究，发掘潜在的宝 贵的遗传特性。这样保护工作才会更有针对性、目的性。对于畜禽遗传多样性的 保护和利用也就是最大限度地保护和利用在遗传上具有特异性的品种，这些品种 的确认首先要建立在各品种间遗传关系的基础上，这就需要通过先进的分子生物 学技术对地方水牛品种资源进行深入的研究。 对水牛遗传多样性的分析与评估是为了更好的保护它的遗传多样性，从而达 到更好的保护我国优良的水牛遗传资源的目的，为水牛遗传资源的保护、评估及 开发利用提供更加合理的理论依据。以往家畜的品种鉴定和分类基本根据各种家 畜的体型外貌、地理分布和生态类型、历史及考古资料。近年来，由于生物化学 和现代遗传学技术的发展，人们已开始从血液型、酶型、血液蛋白多态性及染色 体特征上研究品种间的差异和亲缘关系。随着科学技术的发展，这些研究在解决 了一定问题的同时，也遗留了一些缺憾，有待于从分子水平上深入的揭示其本质 的遗传变异。本研究利用多重p c r 和微卫星荧光标记对我国6 个水牛群体和2 个 国外引进品种的1 3 个座位进行遗传结构分析，旨在为我国水牛资源的遗传育种、保 护、合理利用提供一定的依据。其中对国内水牛群体中特有基因的统计和频率的 计算，为群体间识别和区分，正确评价各群体遗传多样性的资源价值提供了分子 理论依据。 王冬蕾：利用微卫星标记分析8 个亚洲水牛群体遗传结构 旦 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验样本 在各群体的中心产区分别随机选取水牛6 0 头左右作为实验样本，要求具备品 种的典型特征，并且在3 代或2 代内没有血缘关系，颈静脉采血1 0 m l 头左右。采 样情况如表1 所示。 表1 ：8 个水牛群体名称和采样情况表 t a b l e1 ：n a m e s ，s a m p l i n gl o c a t i o n s , a n ds a m p l es i z e so f 8b u f f a l op o p u l a t i o n e s 中国品种c h i n e s en a t i v eb r e e d s 德昌水牛- - d e c h a n g 四川省德昌县d e c h a n g c o u n t y , s i c h u a n p r o v i n c e 5 9 兴隆水牛x i l l g l o n g 海南省定安县，琼山市，万宁市 6 l a n d i n g c o u n 毗q i o n g 曲a n c i t y a n d w a n 曲l g c i 吼h a i n a n p r o v i d e 富钟水牛f u z h o n g 广西壮族自治区富川县f u e h u a n c o u n t y , g u a n g x i z h u a n g a t 曲n o m o u s r e g i o n 6 0 温州水牛w e n 出浙江省平阳县p 嗡锄gc ( m 峨丑蝎堍n o v k 雌 6 0 东流水牛d o n g l i u 安徽省池州市东至县d o n g z h i c o u n t y , c h i z h o u c i t y , a n h u i p r v v i n c e 5 9 福安水牛f u t福建省福安市f u a n c i t y , f u j i a n p r o v i n c e 5 4 引进品种i n t r o d u c e db r e e d s 摩拉水牛湖南省华客县畜禽牧草良种繁殖场 6 0 m u r r a he l i t er e p r o d u c t i o n f i e l d o f d o m e s t i c a n i m a l s a n d f o r a g e , h t x o n g c o u n t y , h u n a n p r o v i n c e 尼里一拉菲水牛广西壮族自治区南宁市 6 0 n i l i - r a v i n a n n i n g c i t y , g u a n g x i 刁m a n g a u t o n o m o u sr e g i o n 2 1 2 主要的常用试剂 嘣s 饱和酚、三氯甲烷、三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 、十二烷基硫酸钠( s d s ) 、 蛋白酶k ( p r o t e i n a s ek ) 、p b r 3 2 2 m s pi 和p g e m - 3 z ( + ) h a e l l d n a 标记、丙烯 酰胺( a c r y l a m i d e ) 、甲又双丙烯酰胺( n n - m e t h y l e n e - b i s - a c r y l a m i d e ) 、硼酸、 n ，n ，n ，n 四甲基7 , - - 胺( t e m e d ) 、t a q 酶、d n t p s 、过硫酸铵( a p ) 、e d t a n a 2 、 扬州大学硕士学位论文 碳酸钠、硝酸银、醋酸 2 1 3 主要实验仪器设备 表2 ：实验所用仪器、设备名称 t a b l e2 ：t h ee q u i p m e n t su s e di nt h ee x p e r i m e n t 1 2 仪器名称及型号 产地 a b l 3 l o o b i o - r a d 凝胶成像系统 g e n e a m p 9 7 0 0p c r 仪 e p p e n d o r f 梯度p c r 仪 h n ：a c h ic r 2 1 g 型高速冷冻离心机 2 儿l o 皿，2 0 山1 0 0 t t l 2 0 0 儿1 0 0 0 皿g i l s o n 移液器 e p p e n d o r f b i o p h o r t o m e t e r 浓度测定仪 m i l l i p o r e 超纯水器 s h a b a 水浴恒温振荡器 d y y - i u - 6 b 型稳压稳流电泳仪 d y y - m - 2 4 a 垂直电泳槽 c s l 0 1 1 e b 电热鼓风干燥箱 k q 5 0 0 d b 型数控超声波清洗器 s a n y om l s 3 7 5 0 高温高压灭菌器 2 3 lg a l a t m 机械型微波炉 t g l1 6 9 台式高速离心机 h y - 2 调速多用振荡器 8 1 - 2 型恒温磁力搅拌器 s w - c j - 2 f d 超净工作台 o h a v s 电子天平 w h - 2 微型旋涡混合仪 澳柯玛电冰柜 美国 意大利 新加坡 德国 日本 法国 德国 法国