（劳动卫生与环境卫生学专业论文）反义寡核苷酸的差异筛选.pdf

竺主! 塑墨查堂堕壹堡芏堕 翌主芷堡垒墨 反义寡核苷酸的差异筛选 中文摘要 本磺窕豹羹戆在于嚣瘸滔躐杂交法( s u b s t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) 辊毒l 来建立静飘大 容量的寡核苷酸( o l i g o + d e x o x y r i b o n u c l e t i d e s o d n s ) 库中筛选特定寡核苷酸片段的方法，同 时裁羁生物信憨学方法，泉颈溺箱关生锡学信惑。该方法基本原理为：旃寡核蝥酸库与 小鼠纤维肉瘤细胞( w e h i ) 的m r n a 杂交，然后将与w e h im r n a 结合的寡核黄酸片 断分离磁来再与另外一种细胞小鼠胚胎成纤维细胞( n i h 3 t 3 ) 的m r n a 杂交，收集未 与n i h 3 t 3m r n a 结合的寡核萤酸片段，可缮到能与w e h m r n a 杂交结合两不与 n i h 3 t 3m r n a 杂交结合的寡核苷酸片段，对这些寡梭苷酸片段进行扩增纯化分离后， 转染纲爨，棂据转染缨鼹的效果遴一步送行克隆测痔，撂溅痔维暴寒攫溅w e h im r n a 土 菜些特定的碱基序列，这些序列可作为r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e r n 蹦) 及反义寡核苷 羧静可麓俸瘸位点，同辩程臻生物信惠学方法礞溅这些侉疑瑟圣表静基鬻信意及与这鳖 序列结合的相应m r n a 的二级绪构，从而进一步为后续的s i r n a s 技术及反义核酸技术 避深入静研究抒下基础。 研究分三部分 1 r n a 凝义寡拨萤酸鲍蕤异簿选 小鼠纤维肉瘸细胞株( w e m ) 及小鼠胚胎成纤维细胞株( n i h 3 t 3 ) 予含1 0 的灭 添憝参牛袁溥熬r p m l l 6 4 0 培养豢中，3 7 4 c ，5 c 0 2 ( w v ) 浓度下培莽。 从培养的w e h i 及n i h 3 t 3 中分别掇取总r n a ，再用寡聚( d t ) 纤维豢 o l i g o ( d t ) l 柱子鼠憩r n a 中分离窭m r n a ，将寡核瞢酸( o t i g o d e x o x y r i b o n u c l e t i d e s o d n s ) 库先 与w e h i m r n a 杂交结台。从o l i g o ( d t ) 纤维素柱上将o d n s 库与w e h m r n a 的结 合物洗脱下来，两r n a 酶h ( r n a s e h ) 将w e h im r n a 消化掉，只剩下o d n s 片段， 褥姆这些o d n s 片段与n i h 3 t 3m r n a 杂交结合，收集未与n i h 3 t 3 结合懿o d n s 片段， 经浓缩纯化p c r 扩增，琼脂糖凝胶电泳熙示有所需目的条带的出现，表明筛选成功。 华中科技大学嗣济医学院 硕士学位论史 2 r n a 反义寡核苷酸的抗肿瘸效应 将二次p c r 产物纯化分离出与随丰凡库序剜致的革链0 d n s ，应用脂质体转染法将反 义o d n 导入细胞，理察细胞豹生长情况，同时用流式细胞仪来检测实验缎与对照组细胞的 凋亡情况，结果显示：实验组细胞( w e h i ) 的生长受到一定程度的抑制，细胞凋亡率明显离 子对照缝缨照渊亡搴，嚣n i h 3 t 3 绥艟转染兹嚣熬缨照滔牲及凋亡跨提则无朝曼竣变。骏 证了反义0 d n s 的抗肿瘸细胞生长增殖的效果。 3 r n a 反义寡核苷酸克隆测序 筛选出o d n s 片段p c r 扩增产物经q i a q u i c k n u c l e o t i d er e m o v a lk i t 试裁盒缝亿后， 在l t d n a 连接酶的作用下与p o e m te a s y 载体连结，连结产物转化感受态大肠肝菌 ( d h s ) ，在含有a m p i p t g x ，- g a l 的l b 的平板上选择性生长，挑选白色菌落2 0 个，3 7 ，摇臻过夜，取适量榉品送生物工稷公司测摩鉴定。 利厢生物信息学资源：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t4 扔w w w b i o i n f o m a t h r p i e d u 一来 琰测上述亭到掰寇含懿罄因燕感：基因戆染色豁定蕴以及与这黧t | 葶熨蝮对应懿m r n a 豹 二级空间结构，从而进步推测这些m r n a 上潜在s i r n a s 的作用位点，为下一步s i r n a s 技术酌磷究提镰前提蓥确。 总之，本研究探讨了利用消减杂交法原理从大容量的o d n s 库中筛选两种不同细胞 的差异反义寡桉萤酸并研究其抗肿瘤效应的一种方法，同时运掰阏上的生物信息学方法 来分析预测与掰筛选出的o d n s 片段别豹各霉申生物信息，对赋续的s i r n a s 技术及反 义核酸技术研究有一定的参考价值。y 撒讯殿o d n s 、r 晰扰、不絮? 脯效应、弋拗信群 2 兰主! 燮垄堂里壹垦堂堕 堡主兰燮一 d i f f e r e n t i a ls c r e e n i n g o fa n t i s e n s e o l i g o n u c l e t i d e sh y b r i d i z i n gw i t h r n a a b s t r a c t t h ea i mo ft h i ss t u d yi st oe x p l o r ep r e l i m i n a r i l yan e wm e t h o dt os c r e e nc e r t a i nk i n d so f o l i g o d e o x y r i b o n u c l e t i d e s ( o d n s ) f r a g m e n t sf r o m al a r g er a n d o mo d n s l i b r a r y t h eb a s i c a l t h e o r yo ft h em e t h o di sb a s e do nt h em e c h a n i s m so fc d n a s u b s t r a c t i v eh y b r i d i a t i o n ( s h ) f i r s tt h em r n a so fm o u s ef i b r o s a r c o m ac e l ll i n e ( w e h i ) a r eh y b r i d i z e dw i t ht h eo d n s l i b r a r y ，t h e n ，t os e p e r a t eo d n s t h a tc o m b i n e dw i t ht h em r n a so fw e h ia n dh y b r i d i z et h e s e i s o l a t e do d n sw i t hm r n a so fm o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s ( n i h 3 t 3 ) ，t h eo d n s u n b i n d i n gw i t hm r n a s o fn i h 3 t 3a r ec o l l e c t e d ，t h e s eu n b i n d i n go d n sa r et h es p e c i f i c o d n st h a tb i n dw e h i m r n aw h i l en o tw i t hn i h 3 t 3m r n a t h e s eo d n sa r ea m p l i f i e db y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nf f c r 、a n dt r a n s f e c t e di n t o c e l l s r e s p e c t i v e l yt o d e t e r m i n et h e e f f e c to fa n t i s e n s eo d n s o nt h eb a s i so ft h es e q u e n c i n gr e s u l t so ft h e s eo d n s ，w ec a n a c q u i r ec h r o m o s o m el o c a l i z a t i o no ft h e s es e q u e n c e sb yb i o i n f o r m a t i c s ，w ea l s o c a ni n f e r s o m es e q u e n c e so fw e h i m r n aa n dp r e d i c ti t ss e c o n d a r ys t r u c t u r e s t h e s es e q u e n c e s p r o v i d e dp o t e n t i a lt a r g e t s i t e s f o r s m a l l i n t e r f e r i n gr n a ( s i r n a ) a n d a n t i s e n s e o l i g o n u c l e t i d e s s ot h es t u d yw i l lp r o v i d et h ep r e r e q u i s i t e f o rt h e s u b s e q u e n tr e s e a r c ho f s i r n a t e c h n o l o g y a n da n t i s e n s et e c h n o l o g y t h e s t u d y c a nb ed e v i d e di n t ot h r e e p a r t s ： 1 d i f f e r e n t i a ls c r e e n i n go fa n t i s e n s eo l i g o - d e x o x y r i b o n u c l e t i d e so fr n af r o mt h eo d n r a n d o m l i b r a r y w e h ia n dn i h 3 t 3c e l ll i n e sw e r ec u l t u r e di nr p m l l 6 4 0 s u p p l e m e n tw i t h 1 0 h e a t e d - i n a c t i v a t e df e t a lc a l fs e r u ma n da3 7 ci n c u b a t o rw i t hs a t u r e dh u m i d i t ya n da5 ( v v ) c 0 2a t m o s p h e r e t oi s o l a t em r n a sf r o mt o t a lr n a sw i t ho l i g o ( d t ) c e l l u l o s ec o l u m n s r e s p e c t i v e l ya f t e r e x t r a c t i n gt o t a lr n a s f r o mc u l t u r e dc e l ll i n e sa n di n c u b a t et h ew e h i sm r n aw i t ho d n s l i b r a r y t om a k es o m ec e r t a i nk i n d so fo d n s h y b r i d i z e dw i t hm r n a s o fw e h i t h e nt o s e p e r a t e dt h e s eo d n sf r o mt h ec o l u m na n dh y b r i d i z et h e s eo d n s w i t hn i i - 1 3 t 3m r n a t h e u n b i n d i n g o d n sw i t hn i h 3 t 3m r n a a r ea m p l i f i e db yp c ra n di d e n t i f i e dw i t ha g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ，t h ea i m d n ab a n d sw e r es h o w ni ng e la se x p e c t e d 3 兰主! 塑墨查兰璺逢墨兰照 一一坠整兰! ! i ! ! 垒 2 t h ea n t i 。p r o l i f e r a t i o ne f f e c to fa n t i s e n s ed i f f e r e n t i a lo d n s w e h ia n dn i h 3 t 3c e i ll i n e sw e r et r a n s f e c t e dw i t ht h ea n t i s e n s ed i f f e r e n t i a lo d n s u s i n g l i p o s o m e m e d i a t e dt r a n s f e c t i o nm e t h o d ，f o l l o w i n g2 4 ho fg r o w t hi nd i s h s ，t h e nw e o b s e r v e d t h ee f f e c to fa n t i s e n s eo d n so ut w os t r a i n s w ef o u n dt h a tt h ea n t i s e n s eo d n s c a ni n h i b i t 穗eg r o w t ho ft h et r a n s f e c t e dw e h ic e l l s ，w h i l et h e3 t 3 c e l l sr e t a i n e dn o r m a la n dh a v en o a n yc h a n g e s t h e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a tt h es e l e c t e da n t i s e n s eo d n sh a v et h ee f f e c to f a n t i f i b r o s a r c o m a 3 s e q u e n c i n g o fa n t i s e n s ed i f f e r e n t i a lo d n s t h ep g e m - te a s yv e c t o r s y s t e m s a l ec o n v e n i e n ts y s t e m sf o rt h ec l o n i n go fp c r p r o d u c t s u s et , d n al i g a s e s t ol i g a t et h ep g e m - t e a s yv e c t o r sw i t hp u r i f i e dp c rp r o d u c t s o fa n t i s e n s eo d n s , t h e l i g a t i o n sw e l - ei n t r o d u c e di n t oc o m p e t e n t b a c t e r i a lc e l tf o a s a ) t h e e c o l it r a n s f o r m e dw i t hr e c o m b i n a n tv e c t o rc a l lg r o wu po nas e l e c t i v ep l a t ec o n t a i n i n g a m p i c i l l i n f f p t g x - g a l b a c t e r i a c a 挂i n g r e c o m b i n a n tv e c t o rf o r mw h i t ec o l o n i e s ，t h e b a c t e r i a sw h i c ha r en o tt r a n f o n n e df o r mb l u ec o l o n i e s t op i c kw h i t ec o l o n i e sr a n d o m l yf r o m t h ep l a t ea n da d de a c hc o l o n yi n t o2 m lo fl bm e d i u mc o n t a i n i n ga m p i c f l l i n ，i n c u b a t et h e c u l t u r ea t3 7 。cw i t hs h a k i n g ，o v e rn i g h t s e n dt h e s es a m p l e st ob i o e n g i n e e rc o m p a n yt o s e q h e n c o t f r o mt h er e s u l t so fs e q u e n c i n g , w ec a ne i t h e ra c q u i r es o m eg e n e t i ci n f o r m a t i o n sa b o u t t h e s e s e q u e n c e s s u c ha s g e n e t i cc o d e c h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o n b yb i o i n f o r m a t i c s o f i n t e r a c to r p r e d i c tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fm r n a w i t hw h i c ht h e s ea n t i s e n s ed i f f e r e n t i a l o d n sc o m b i n e d s ot h a tw ec a l lf u r t h e ri n f e rt h ep o t e n t i a lp r o b a b l et a r g e ts i t e so fs i r n a s a n da n t i s e n s eu u e l e t i d e s a l li na l l ，b a s e do nt h em e c h a n i s mo fe d n as u b s t r a c t i v eh y b r i d i a t i o n ( s 固，t h es t u d y d e v e l o p am e t h o do fs c r e e n i n gd i f f e r e n t i a la n t i s e n s eo d n sf r o mo d n s l i b r a r y c o m b i n i n g w i t hb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s ，s o m eg e n e t i ci n f o r m a t i o n sr e l a t et ot h es e q u e n c eo fo d n sc a n b ep r e d i c t e dp r o p e r l y , t h e r e f o r e ，t h es t u d y p r o v i d es o m e u s e f u lr e f e r e n c ef o rt h es u b s e q u e n t r e s e a r c h k e yw o r d s ：a n t i s e n s eo d n s ，s i r n a , 酬，a n t i - p r o l i f e r a t i v ee f f e c t , s e q u e n c i n g , b i o i n f o r m a t i c s 4 兰主壁垫查兰璺查垦兰些 一坠芝望垒! 皇羔 第一章r n a 反义寡核昔酸的筛选 1 引言 本磷究选矮小鼠绣维岗瘗缨戆抹( w e h i ) 与小鬣嚣黪或纾维缨憝( n i h 3 t 3 ) 终为 实验细胞株，两株细胞均为纤维状贴壁细胞，w e h i 为恶性程度较高的肿瘤细胞，而相 对来说n i h 3 t 3 为正常对照细魏，翻翻消减杂交潦理，觚o d n s 痒中薅逡滔释缅稔m r n a 的差异o d n s 片段，从麓异o d n s 序列_ 束推测s i r n a 在阻断恶性肿瘤相关基因的m r n a 上的俸厢位点。 绝大多数哺乳动物纲胞m r n a 的3 端存在2 0 3 0 0 个腺苷酸组成的p o l y ( a ) 照，这种 结构为真核m r n a 分予的分离提取提供了极为方便的选择标志，寡聚d t o l i g o ( d t ) 】纤维 素分离缝纯m r n a 黪理论裁在予姥，嚣蔚，o i i g o o t ) 终维素蛙忍残为分离m r n a 的誊 规方法n 我们应用此方法分别将w e h i 及n i h 3 t 3 的m r n a 分离出来，将o d n s 库先 与w e h im r n a 杂交结合。瓣将萁杂交羲洗戴下来，嚣r n a s e h 瀵健终释杂交链中熬 m r n a 1 2 - 1 4 1 ，只剩下原来与w e h im r n a 结合的o d n s 片段，然后将此o d n s 片段与 n i h 3 t 3 酶m r n a 杂交结合，收集未与n i h 3 t 3 结合酌o d n 片段，将魏o d n s 片段缀 浓缩、纯化及p c r 扩增后，用琼脂糖凝胶电泳捡测。 2 实验帮分 2 1 试剂与仪器 2 。1 。1 谈潮 r p m l l 6 4 0 培养基，小牛血清，t r i z o l 试剂，购自l n v i t r o g e n 公司；胰蛋白酶，二乙 基焦碳酸釜( d e p c ) ，牛蛊清酝蛋鑫( b s a ) ，二硫苏貉醇( d t t ) ，t a q d n a 聚合酶， 脱氧核萤三磷酸( d n t p ) ，n 2 + 羟乙基哌嗪h 2 乙磺酸( 既p e s ) ，购自华美公司；小 鼠纤维随窟细臆( w e h i ) ，小鬣胚胎成纤维细胞( n i | 3 犸) ，中国武汉典型培养杨傈藏 中心；二甲基豫瑕( d m s o ) ，o l i g o ( d f ) 纤维索，r n a 酶h ( r n a s e h ) ，d n a l a d d e r ( 1 0 b p ) , p r o m e g a 公司生产；琼脂糖，髑班牙进口分装( 武汉大风生物公司) ；q i a q u i c k n u c l e t i d er e m o v a lk i t ，q 疆g e n 公裁生产；寡垓蓑酸疼( o d n s 痒) 痔歹摹： 5 g g g a g g a c g 蛆1 g c g g ( n ) 2 0 e a g a c g a ( x g c c c g a 一3 ，引物1 序列： 5 - 瑟g a g g a e g 越奄c g g 3 ，雩| 褥2 痔癸：5 - t c g g g c g a g t c g t c t g - 3 ，上海薄双 生物公词合成。其余试剂均为分析纯，使用三蒸水。 竺士壁苎垄兰旦查垦堂堕兰型兰墅坠 2 1 2 仪器 超净工作台，1 - 5 1 3 0 0 ；c 0 2 细胞培养箱s h e l l a b 2 3 5 0 m p ，美国；紫外分光光度仪 u v 2 4 0 i p c ，日本岛津公司；核酸蛋白定量仪，b i o m e t r a ；台式离心机m i k k o2 2 r ；台 式冷冻离心机，3 k 3 0 型，s i g m a ；p c r 仪，t g r a d i e n t ，b i o m e t r a ，超低温冰箱，f o r m a s c i e n t i f i c ；凝胶成像系统，v i l b e r l o u r m a t ；电泳仪，d y y 1 1 1 - 4 型稳压流电泳仪；不锈 钢正压除菌滤器，江苏太仓市实验设备厂；恒温水浴箱，江苏太仓市实验设备仪器厂。 2 2 实验方法 2 2 1 细胞的培养与冻存 将w e h i 细胞株及n i h 3 t 3 细胞株于含1 0 、小牛血清的配制好的r p m l l 6 4 0 培养 基中，3 7 。c ，5 浓度c 0 2 条件下培养。细胞株保存于含1 0 d m s o ( 二甲基亚砜) 的 r p m i l 6 4 0 培养基中，置于一8 0 c 低温冰箱保存【“。 2 2 2 细胞总r n a 的提取跏 ( 1 ) 取出培养的状态良好的细胞，消化后，制成细胞悬液，移入离心管，1 0 0 0 r p m 离心 5 分钟。 ( 2 ) 弃上清，每5 - 1 0 1 0 6 个细胞加l r n l t r i z o l 试剂，混匀，冰上静置5 分钟。 ( 3 ) 每毫升t r i z o l 加入0 2 m l 氯仿，混匀，冰上静置3 分钟。 ( 4 ) 移入1 5 m l e p 管，2 - 8 c ，1 2 0 0 0 9 ，离心1 5 争钟。 ( 5 ) 此时e p 管内溶液分层，上层为水相，含r n a ，中间层及下层含有d n a 及蛋白质。 ( 6 ) 吸取上层含有r n a 的水相层于另一新的e p 管中。 ( 7 ) 每毫升t r i z o l 加入0 5 m l 异丙醇，混匀，2 0 静最2 小时。 ( 8 ) 2 - 8 ，1 2 0 0 0 9 ，离心1 0 分钟，此时可在管壁或管底见小丸状r n a 沉淀。 ( 9 ) 小心吸弃上清，每m lt r i z o l 加入l m l7 5 l 醇漂洗沉淀，无需吹打沉淀。 ( 1 0 ) 2 - 8 ，7 5 0 0 9 ，离心5 分钟。小心弃上清，加入适量经d e p c 处理的三蒸水溶解， 取适量用核酸蛋白定量仪测r n a 的浓度及纯度后，放入8 0 c 低温冰箱保存。 ( 注：整个操作过程要求严格遵守无r n a 酶操作环境规则) 2 2 3m r n a 的分离及o d h s 库的筛选 2 2 3 1 配制下列溶液 ( 1 ) 1 m i r i s c lp h = 7 6 称取1 2 1 1 9t r i s 碱，加适量三蒸水溶解，用浓h c l 调p h 值至 7 6 ，定容至1 0 0 m l 高压灭菌。 6 竺登垫垄兰堕童垦兰堕翌生曼兰坚 ( 2 ) 0 5 me d t ap h ：8 0 取e d t a 2 n a 盐1 8 6 1 9 ，加适量三蒸水溶解，n a o h 调p h 至 8 0 ，定量至1 0 0 m l ，高压灭菌。 ( 3 ) 5 m n a c l 取2 9 2 2 9n a c l 三蒸水溶解定容至1 0 0 m l ，高压灭菌 ( 4 ) 1 0 s d s 取1 0 9 十二烷基磺酸钠，加适量水，微波炉加热助溶，冷至室温，用浓 h c l 调p h 至7 6 定容至1 0 0 m l ( 5 ) 2 n a n 3 取l g 叠氮钠加5 0 m l 水，加热助溶，冷至室温，- 2 0 贮存。 ( 6 ) 1 0 s l s 取1 0 9 十二烷氨基肌酸钠溶于1 0 0 m l 水中，加热助溶，不必灭菌，室温保 存。 ( 7 ) 1 nn a o h 取4 9n a o t t 于1 0 0 m 水中 ( 8 ) 1 md t t 取1 5 4 5 9 二硫苏糖醇用1 0 m l 水溶解，一2 0 。c 保存 ( 9 ) 1 0 m g m lb s a 取牛血清白蛋白1 0 0 m g 溶于1 0 m l 水中，4 。c 保存 ( 1 0 ) 1 mh e p e s k o hp h 8 0 取4 7 6 6 h e p e s 与1 1 2 9k o h 溶于2 0 m l 水 ( 1 1 ) l 上样缓冲液组成 0 0 2 mt r i s c 1 p h 7 6 0 5 m n a c l 0 0 0 1 m e d t a p h 8 0 o 1 s l s ( 1 2 ) 2 上样缓冲液组成 0 0 4 mt r i s c 1 p h 7 6 1 0 mn a c l o 0 0 2 me d l a p h 8 0 0 2 s l s ( 1 3 ) 洗脱缓冲液组成 0 0 1 mt r i sdp h 7 6 0 0 0 1 m e d t a p h8 0 0 0 5 s l s ( 1 4 ) 1 0 酶切缓冲液组成 0 2 mh e p e sk o hp h 8 o o 5 m k c l 4 0 r a mm g c l 2 1 0 m md i t 0 5 i n g m lb s a 7 望! ! 垫垄兰旦查垦兰堕塑兰曼兰坠 2 2 3 2 合成库的稀释 o d n s 库共5 个o d 值约1 6 5 u g _ 卡目兰刍于= 等 1 0 8 m o l j 比o d n s 库 的随机碱基序列为：5 - g g g a g g a c g a r g c g g - ( b 0 2 0 c a g a c g a c t c g c c c g a 一3 故该库的随机片段丰度为4 2 0 * 1 0 1 0 由及得出每一随机片段的摩尔数为4 m 1 0 。1 8 m o l 1 0 。1 8 m 0 1 相当于：1 0 1 8 6 2 5 x 1 0 2 3 = 6 2 5 x 1 0 5 个分子数 按每次筛选大约需要每种序列约1 0 0 0 0 个分子数，将该库用0 5 m l 灭菌水稀释后，取 1 0 u l 可满足此要求。 注：o l i g od n a 分子量可用碱基个数乘以单个脱氧核苷酸的平均分子量约3 3 0 近似计 算，即分子量= 碱基个数3 3 0 2 2 3 3o d n s 库的筛选过程“” ( 1 ) 用0 1 nn a o h 溶液悬浮保存于2 n a n 3 中的o l i g o ( d t ) 纤维素，分别装入两支 特制的带有玻璃棉的柱子中，装入的o l i g o ( d t ) 纤维素柱高约0 5 c m ( 约0 2 m l ，每m l 的 o l i g o ( d t ) 最大载样量为1 0 m g 总r n a ，此次实验使用总r n a 约为2 0 0 u g ，故相应减少了 o l i g o ( d t ) 纤维素的使用量，以防止o l i g o ( d t ) 的流失) 。 ( 2 ) 用灭菌的经d e p c 处理的水冲洗柱床 ( 3 ) 用1 上样缓冲液洗柱，直至流出液p h 小于8 0 ( 4 ) 取w e h i 细胞的总r n a 约2 0 0 u g ，溶于d e p c 处理的消毒水中，使最终体积 达o 5 m l ，将其放入水浴箱，6 5 ，温育5 分钟。( 6 5 ，5 m i n 有两个目的：其一破环 r n a 的二级结构，尤其是m r n ap o l y ( a + ) 尾处的二级结构，使p o l y ( a + ) 尾充分暴露， 提高p o l y ( a + ) r n a 的回收率。其二能解离m r n a 与r r n a 的结合，否则会引起r r n a 污染m r n a ，故这一步骤不能省略【9 】【”】) ( 5 ) 用水迅速冷至室温，加入等体积2 上样缓冲液，混匀后直接上柱，收集流出 液，当r n a 上样液全部进入柱床后，再用3 倍柱床容积的1 x 上样缓冲液洗柱，继续 收集流出液。 ( 6 ) 将所有收集的流出液6 5 。c 力 1 热5 分钟。冷至室温重新上样。 ( 7 ) 用1 0 倍柱体积的1 上样缓冲液洗柱。 8 望翌垫垄堂苎查垦兰堕坚兰兰! 坠 ( 8 ) 取寡核苷酸o d n s 库溶液1 0 u l 与d e p c 处理过的灭菌水4 9 0 u l 混匀，6 5 c ，5 分钟。另取等体积的2 x 上样缓冲液混匀，将混合物加入含w e h im r n a 的o l i g o ( d t ) 纤 维素的柱子中。收集流出液，重复( 5 ) - ( 6 ) 步骤。 ( 9 ) 用3 倍柱床容积的洗脱缓冲液洗柱，收集流出液，此流出液中含有w e h i m r n a 与o d n s 库的结合产物 ( 1 0 ) 将( 9 ) 步收集的流出液加入l o x 酶切缓冲液，使其最终达1 x 酶切缓冲液浓 度。加入1 个单位的r n a s eh ，混匀，3 7 。c ，3 0 m i n 。( r n a s e h 用来消化降解o d n s 与m r n a 杂交链中的r n a ) ( 1 1 ) 加入适量0 5 mp h 8 0 的e d t a 使反应时体系终止。 ( 1 2 ) 将上述反应液与等体积的2 上样缓和冲液，混匀，加含有n i h 3 t 3m r n a 的 0 1 i g o ( d t ) 一纤维素柱子中，收集流出液。 ( 1 3 ) 用1 0 倍柱应容积的1 上样缓冲液洗柱，收集口流出液。 ( 1 4 ) 合并1 2 、1 3 步的流出液，该流出液中含有与w e h i m r n a 而未与n i h 3 t 3 结合的 0 d n s 片段。 2 2 4 筛选出的0 d n s 片段的浓缩。1 用正丁醇抽提水溶液时，可将溶液的水吸入有机相，而溶液中的d n a 则不会分配到 正丁醇中去。利用该特性，可以显著减少0 d n 溶液的容积，而达到浓缩的目的。首先取 0 5 m l0 d n s 溶液，加入等体积的正丁醇，充分混合后，1 2 0 0 0 9 离心2 0 秒，弃上层有机 相，重复此操作，直到所需的0 d n s 容积0 1 m l 。 2 2 5o d n s 溶液的纯化 将2 2 4 中浓缩的0 1 m l o d n s 溶液用q i a q u i c kn u c l e t i d er e m o v a lk i t 试剂盒纯压， 操作步骤见其说明书。 2 2 6 用p c r 反应扩增纯化的o d n s 片段”“ 2 2 6 1 按下列顺序，将各成分加入无菌的p c r 管，每一反应体系为5 0 u l ，同时设置阴 性及阳性对照 无菌水 2 6 u 1 1 0 x 扩增缓冲液 5 u l 4 种d n t p 混合液1 0 m ml u l 引物l1 0 p m o l u l2 u l 华中科技大学同济医学院硕士擘位论文 此物21 0 p m o l u l2 u l m g c l ：液2 5 r n m3 u l 模板1 0 u l t a q 酶3 u u ll u l 将上述各成份在冰上混匀，放入已设置好程序的p c r 仪进行p c r 扩增 1 2 6 2 按下列条件进行p c r 循环扩增“”“”6 “7 1 循环变性 退火聚合循环次数 首轮循环 9 4 。02 分钟 6 2 。c2 0 秒7 2 。c3 0 秒1 后续循环 9 4 。c2 0 秒 6 2 。c2 0 秒7 2 。03 0 秒 2 3 未轮循环9 4 。c2 0 秒6 2 。02 0 秒 7 2 。05 分钟1 注：共进行2 5 个循环 2 2 7 将p e r 扩增产物进行4 琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的条带的有无，用凝胶成 像系统显示并保存电泳结果。 2 2 8 从p c r 产物中取出3 u l 作为二次p c r 的模板，进行二次p c r 扩增，用凝胶 电泳鉴定，用凝胶成像系统显示结果。 3 结果与讨论 第一次p e r 扩增筛选o d n s 片段的凝胶电泳结果。如图1 1 图1 1 ：p c r 产物凝胶电泳图 1 0 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 电泳显示扩增条带约5 0 碱基长短，正好与o d n s 随机库的序列长度( 5 1 个碱基) 相 当，故表明有o d n s 片段筛选出来，与预期结果相同。考虑到由于筛选出的? 核苷酸片 段分子数相当少的缘故，故第一次扩增的条带颜色较淡化，不显著，表明一次p c r 扩增 出的o d n s 片段量较少，达不到本实验后续研究所需求的产物量，故需要进行二次p c r 扩增。 二次p c r 扩增o d n s 的电泳结果，如图1 2 图1 2 ：二次p c r 凝胶电泳图 电泳结果显示目的条带的亮度明显较第一次p c r 产物目的条带亮，表明二次p c r 扩 增产物的量比第一次p c r 扩增产物的量显著增加，据紫外灯下与m a r k e r 比较估计，同 时结合紫外分光光度仪测产物的量，每5 0 u l 二次p c r 反应体系扩增产物在0 5 u g 左右， 能够满足后续实验的要求，可迸一步通过测序对其进行鉴定。 参考文献 1 卢圣栋，主编现代分子生物学实验技术，北京：中国协和医科大学出版社，1 9 9 9 1 4 9 2 鄂征，主编组织培养和分子细胞学技术，北京：北京出版社，1 9 9 9 ：4 0 4 8 3 辛华，主编细胞生物学实验指导，北京：科学出版社，2 0 0 1 ；1 4 4 1 4 5 4 卢圣栋，主编现代分子生物学实验技术，北京：中国协和医科大学出版社，1 9 9 9 1 4 9 1 s n 兰士壁塾垄主旦壹墨兰堕堡兰兰兰堕 5 金冬雁，黎孟枫等译分子克隆实验指南，北京：科学出版社，第二版，1 9 9 9 ；3 4 3 - 3 4 4 6 卢圣栋，主编现代分子生物学实验技术，北京：中国协和医科大学出版社，1 9 9 9 ； 6 3 6 4 7 冯作化，皇甫永穆分子生物学基本实验技术，武汉：同济医科大学出版社，2 0 0 0 ； 1 0 8 1 1 0 8 j o s e p h i n ec h a r l t o na n dd r e ws m i t h e s t i m a t i o no fs e l e x p o o ls i z eb ym e a s u r e m e n to f d n ar e n a t u r a t i o nr a t e s r n a 5 ；1 3 2 6 - 1 3 3 2 ( 1 9 9 9 ) 9 e l l i n g t o n a ，s z o s t a k j w ，i n v i r os e l e c t i o no fr n am o l e c u l e st h a tb i n d s p e c i f i c l i g a n d s n a t u r e ，3 4 6 ，8 1 8 8 2 2 ，( 1 9 9 0 ) 1 0 z e n g j , c o r s k i r a ，h a m e r d ，d i f f e r e n c e t i a l c d n ac l o n i n gb ye n z y m a t i cd e g r a d i n g s u b t r a c t i o n - n u c l e i c a c i d r e s ，2 2 ：4 3 8 1 4 3 8 5 ，( 1 9 9 4 ) 1 1 l e m a r i e p ，g a r r e t t n ，k a t o k ，c o n s t r u c t i o no fs u b s t r a c t e dc d n al i b r a r i e s e n r i c h e df o r c d n a f o r g e n e se x p r e s s e di n t h em e s o d e r mo fe a r l yx e n o p u sg a s y t m l a e s c i e n c e ， 3 1 6 ，9 3 8 - 9 4 4 ，( 1 9 9 3 ) 1 2 l i a n g p _ ，g a r d e e a b ，d i f f e r e n t i a ld i s p l a yo fe u k a r y o t i cm r n ab ym e a n so fp c r s c i e n c e , 2 5 7 ；9 6 7 9 7 1 ( 1 9 9 2 ) 1 3 j i n h ，c h e n g x ，d i f f e r e n t i a ls c r e e n i n go fas u b t r a c t e dc d n al i