（微生物学专业论文）除草剂氟磺胺草醚降解菌的分离鉴定及降解特性研究.pdf

7 、 一 黑龙江大学硕士学位论文 被抑制，加入降解菌液后抑制降低，如果提高施菌量，修复效果更佳。 关键词：氟磺胺草醚；降解菌；生物降解；盆栽试验 - a b s t r a c t - - i ii i a b s t r a c t f o m e s a f e n ，o n eo ft h ed i p h e n y le t h e r s ，b e c o m eo n eo ft h ew o r s tp o l l u t a n t si ns o i l b e c a u s eo fe x t e n s i v eu s i n gi nt h ew o r l d a sar e s u l t , e f f e c t so fd e g r a d i n gb a c t e r i a so n f o m e s a f e na n di t sb i o d e g r a d a t i o nh a sa t t r a c t e di n c r e a s i n ga t t e n t i o n i np r e s e n tr e s e a r c h ， d e g r a d i n gb a c t e r i a sw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e d ，a n di t sd e g r a d a t i o ne f f e c t s w e r e a n a l y z e d h i g h l ye f f e c t i v ed e g r a d i n gb a c t e r i u mo ff o m e s a f e nw e r ei s o l a t e d10s t r a i n sf r o m s o i lw h i c hh a sl o n gt e r ma p p l i e dw i t hf o m e s a f e nt h r o u g he n r i c h m e n tc u l t u r em e t h o d , n a m e db d h f b 2 、b d h f b 5 、b d h f b 6 、b d h f b 8 、b d h f b 9 t h ed e g r a d a t i o n p e r c e n t a g eo ff o m e s a f e n2 5 12 t o8 8 3 2 a f t e rc u l t u r e d 9 6 hi nl i q u i dm i n e r a l m e d i u mc o n t a i n i n g5 0 0m g r l b a s e do nt h em o r p h o l o g i c a la p p e a r a n c e s ，p h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r sa n d 16 s r d n as e q u e n c ea n a l y s e ，t h ed e g r a d i n gb a c t e r i u mb d h f b 2 、b d h - f b 910 0 h o m o l o g o u sw i t h d i f f e r e n tk l e b s i e l l ao x y t o c as e ，b d h - f b 5 、b d h - f b 610 0 h o m o l o g o u s w i t hd i f f e r e n t s h i g e l l a s p b d h f b 810 0 h o m o l o g o u s w i t h p s e u d o m o n a ss p d e g r a d i n gb a c t e r i u mo ff o m e s a f e ng r e wf a s ti ni n o r g a n i cs a l tc u l t u r em e d i u m 0 - 2 4 hi n t h el a gp h a s e ，3 6 4 8 hi nt h ee x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s e ，a n de n di n6 0 ht h e ng o i n t oas t a t i o n a r yp h a s e t h ed e g r a d i n gb a c t e r i u mg r e wf a s tw h e nt h et e m p e r a t u r ew a s 2 8 - 4 0 c ，d e g r a d i n gb a c t e r i u mg r e wb e s tw h e n t h et e m p e r a t u r ew a s3 7 。c w h e nt h ep h v a l u eo f7 0 9 0 ，t h ed e g r a d i n gb a c t e r i u mc a ng r e wa n dg r e wb e s ti sw h e nt h ep hw a s 7 0 t h ea c t i v i t yo fd e g r a d i n gb a c t e r i u mi sd i f f e r e n ti nd i f f e r e n tc u l t u r em e d i u m ，t h e o p t i m u m o fb d h - f b 2 ，b d h f b 8i si n o r g a n i cs a l tc u l t u r em e d i u mw i t hf o m e s a f e ni n i t , t h eo p t i m u mo fb d h f b 5 、b d h - f b 6 、b d h f b 9a r el bc a l t u r ew i t hf o m e s a f e ni n i t d i f f e r e n tc u l t u r em e d i u mw e r eu s e di n t h ea m p l i f i c a t i o nc u l t u r e b i o a s s a ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h es e e d i n ga n dh e i g h to fs e n s i t i v ec r o po f d e g r a d i n gb a c t e r i at r e a t m e n tw e r ec o m p a t i b l ew i t ht h ec o n t r o l ，o nt h ew h o l e ，i t c o n s i d e r e dt h a td e g r a d i n gb a c t e r i u mc o u l dr e c o v e rt h ec o n t a m i n a t i o no ff o m e s a f e n 黑龙江大学硕士学位论文 | 1 i i ii |i i t h er e c o v e re f f e c t so fd e g r a d i n gb a c t e r i u mw e r et h em o s tp r o m i n e n tw h e nt h e f o m e s a f e nc o n c e n t r a t i o nw a s5 0 p , g k gi ns o i l ，啊1 et r e a t m e n tw i t h o u td e g r a d i n g b a c t e r i u mi ni t ，t h ew e tw e i g h t ，d r yw e i g h t , p l a n th e i g h ta r ei n h i b i t e d mr a t eo f d e g r a d i n gb a c t e r i at r e a t m e n t sw o u l dl o w e r , 1 1 1 er e c o v e ra b i l i t ym i g h tb ee v e nb e t t e r w h e nt h ei n t r o d u c t i o no fd e g r a d i n gb a c t e r i aw a si n c r e a s e d k e yw o r d s ：f o m e s a f e n ；d e g r a d a t i n g - b a c t e r i a ；b i o - d e g r a d a t i o n ；p o te x p e r i m e n t i v - - 目录 - n il_m 目录 中文摘要。i a b s tr a c t i 1 目录v 1 绪论1 1 1 除草剂的应用及二苯醚类除草剂的危害l 1 2 微生物降解农药的机理3 1 2 1 酶促反应5 1 2 2 非酶促反应5 1 3 微生物降解农药的研究进展及存在的问题6 1 3 1 基因工程方法应用于降解菌株6 1 3 2 农药酶制剂和固相酶反应器的研究7 1 3 3 农药降解菌的应用效果7 1 3 4 微生物降解农药的研究中存在的问题7 1 4 二苯醚类除草剂的主要微生物类群及其分离筛选方法8 1 5 本实验研究的目的和意义1 0 1 6 本实验研究的主要内容及技术路线1 0 1 6 1 主要研究内容1 0 1 6 2 技术路线1 l 2 材料与方法1 2 2 1 实验材料1 2 2 1 1 供试土壤和种子1 2 2 1 2 主要试剂1 2 2 1 3 培养基1 3 2 1 4 主要仪器设备1 4 2 2 实验方法14 - 黑龙江大学硕士学位论文 i i 2 2 1 氟磺胺草醚降解菌株的富集1 4 2 2 2 氟磺胺草醚降解菌株筛选1 5 2 2 3 高效降解菌降解能力的确定1 5 2 2 4 高效降解菌的鉴定1 6 2 2 5 高效降解菌的最适生长条件的确定2 l 2 2 6 高效降解菌的抗生素敏感性试验2 2 2 2 7 生测方法测定高效降解菌的修复作用2 3 3 结果与分析。2 5 3 1 氟磺胺草醚高效降解菌株富集与筛选一2 5 3 1 1 氟磺胺草醚降解土样的确定2 5 3 1 2 降解菌株的筛选2 5 3 2 氟磺胺草醚高效降解菌的确定：一2 6 3 2 1 氟磺胺草醚的液相色谱定量分析体系2 6 3 2 2 氟磺胺草醚降解菌的复筛2 6 3 3 氟磺胺草醚高效降解菌的鉴定。2 7 3 3 1 氟磺胺草醚高效降解菌的生理生化鉴定2 7 3 3 2 氟磺胺草醚高效降解菌的分子鉴定2 8 3 4 氟磺胺草醚高效降解菌最佳培养条件3 3 3 4 1 不同浓度的氟磺胺草醚对降解菌生长的影响3 3 3 4 2 不同培养基对降解菌的影响3 3 3 4 3 降解菌的生长曲线3 4 3 4 4 温度对降解菌生长的影响3 4 3 4 5p h 值对降解菌生长的影响一3 5 3 5 氟磺胺草醚高效降解菌的抗生素敏感性一3 6 3 6 降解菌的降解特性研究3 6 3 6 1 利用敏感作物生测测定高效降解菌对土壤的修复作用3 6 3 6 2 利用靶标杂草生测测定高效降解菌对土壤的修复作用4 5 目录 讨论5 ：； 结论5 5 参考文献- 5 7 p 付录6 l 致谢6 5 独创性声明6 6 i i 绪论 j m m mi mli 一- fmi i i i i i i i i i i i i i i i i 宣i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 1 绪论 1 1 除草剂的应用及二苯醚类除草剂的危害 化学除草是目前农田杂草防除的最主要手段，其对农业生产的丰收、提高农业 生产效率、改善农民生活质量、降低生产成本和劳动强度等方面起着非常重要的 作用，但除草剂尤其是长残效除草剂的的过量使用给农业生产带来了危害，造成了 重大的经济损失n 1 。( 表i - 1 ) 表1 1 长残效除草剂的应用情况 t a b1 1t h eu s i n go f l o n gr e s i d u a lh e r b i c i d e s 除草剂名称 使用量( 吨) ( 舅瑟) 使用作物后茬影响作物 莠去漳5 0 0 w v 7 3 5 。 3 2 6 6 7 玉豢嚣、 幔、大豆、水稻 甲磺隆1 0 0 w p 6 3 0 4 2 0 小麦、水稻等花生、芝麻、十字花科作物 绿磺隆i o o w p 3 3 02 2 0 小麦、亚麻甜菜、菜豆、油菜、玉米 咪唑乙烟5 0 s l 3 5 0 0 氟磺胺草2 5 0 s l 1 9 5 0 氯嘧磺隆2 5 0 w p 2 2 5 异草松4 8 0 e c 甲氧咪草4 0 s l 唑嘧磺8 0 0 w d g 烟嘧磺隆4 0 s l 嗪草酮7 0 0 w p 2 0 0 大豆高粱、水稻、茄子、草莓 1 3 0 大豆、苜蓿玉米、高粱 2 5 0 3 8 1 2 7 大豆 大豆 大豆 甜菜、高粱、水稻、马铃薯、瓜类 蔬菜、小麦 小麦、大麦、黑麦、高粱 3 3 3 大豆、玉米油菜、甜莱、棉花 2 6 7 玉米小白菜、甜菜、菠菜 9 1 大豆、玉米谷子等 胺苯磺隆5 0 w p 1 0 0 3 3 3 3 油菜 水稻 早在2 0 世纪7 0 年代我国就开始引进技术生产、使用二苯醚类除草剂。在早 期主要使用在水稻田，中后期开始在大豆田使用虎威、克阔乐等。随着国内同类 枷 b 2 螂 枯醚、苯草醚、甲羧除草醚、乙氧氟草醚( 果尔) 、甲氧除草醚、三氟羧草醚( 杂草 焚) 、乙羧氟草醚、氟磺胺草醚( 虎威) 、乳氟禾草灵( 克阔乐) 、氯氟草醚。除了除草 醚和草枯醚由于毒性问题被禁止生产和使用外，其它9 个品种在国外都有生产开 发和登记。国内销售较有影响的品种主要有果尔、虎威、克阔乐、杂草焚等；国 内仿制品并取得正式登记的品种有氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乙羧氟草醚、三氟 羧草醚等。 氟磺胺草醚( 通用名称：f o m e s a f e n ，商品名称：虎威) 化学结构( 图1 1 ) ， 是由英国捷利康公司开发的二苯醚类触杀型除草剂，北方主要用于大豆、果树、 花生等作物地阔叶杂草的防除，由于其良好的除草效果而得到广泛应用。黑龙江 省是农业大省，除草剂每年的使用量较大，是国内除草剂销量最大的省份。2 0 0 4 年全省除草剂总用量3 6 8 7 3 6 t ，约占农药总用量的7 6 4 。其中氟磺胺草醚的使用 量是1 1 9 0 t 嘲，占我省除草剂农药总用量3 2 。其在大豆苗前、苗后使用可很快被 杂草叶部吸收，破坏其光合作用，导致杂草迅速枯萎而死，大豆吸收后可迅速降 解。氟磺胺草醚在土壤中持效期长，大豆田常用的2 5 氟磺胺草醚水剂是一种茎 叶处理的除草剂，推荐剂量为1 5 0 0 m 1 a l m 2 左右，在推荐药量下后茬种植大豆、玉 米、小麦、大麦等作物安全，但种植水稻、南瓜、西瓜、洋葱、番茄、花生、烟 草、菜豆、亚麻等不能保证安全，施用不当或用量过大可导致苗期出现不同程度 的药害症状；旋药两年内不可种植甜菜、油菜、高粱、谷子、向日葵、马铃薯等 作物嘲。 绪论 叩专。一d c 0 2 n h 图1 1 氟磺胺草醚的结构 f i g 1 1t h es 们c t u i r eo f f o m e s a f e n 氟磺胺草醚位居世界除草剂用量的第七位。陆贻通等分析表明，虽然在大豆 和花生植株及果实中未检测出氟磺胺草醚的残留，但是其在土壤中的残留较高 1 。如果施用药量偏高，会对后茬作物造成比较严重的影响m 。 1 2 微生物降解农药的机理 农药的大量使用尤其是长残效除草剂的使用，使极大量的有毒物质进入环境 中，对生态环境乃至人类生活等方面造成不利影响。化学农药在环境中的降解主 要取决于生物因素和非生物因素两个方面，其中因微生物作用而引起的降解过程 称为生物降解( b i o d e g r a d t i o n ) 嘲。最早关于微生物降解农药的报道是a u d u s 关于土 壤微生物对2 ，4 一d 的分解研究嘲。起初人们认为，生物降解的含义就是指土壤、水 体和废水生物处理系统中的需氧微生物对天然或合成的有机物的分解或矿化作 用。随着对有机污染物降解过程的深入研究，生物降解的含义也在不断拓展。由 于微生物在各种生物降解中所起的巨大作用，所以般涉及的生物降解主要是指 微生物降解町。到目前为止，人们已分离了许多可降解农药的微生物，并同时对 除草剂、杀虫剂的微生物降解机理进行了深入的研究，通过近几十年的研究，已 经肯定了微生物在降解土壤和水环境中农药的主要作用，分离得到一批能降解或 转化农药的微生物类群，初步弄清了微生物降解农药的主要作用方式、机制以及 降解途径。这些微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类。其中对细菌的研究较为 深入，其次是真菌。常见的可降解农药的微生物( 表1 2 ) 1 3 1 4 球毛壳霉 ( c h a e t o m i u m g l o b o s u m ) 灭幼脲 甲草胺 【1 6 】 【1 7 1 - 5 i l l u s s p 餮、絮、黧、嚣豁 4 绪论 微生物对农药的代谢方式主要有酶促反应与非酶促反应两种n 引。 1 2 1 酶促反应 微生物自身不能使农药降解，但降解微生物的活动可以使环境p h 变化或产 生某些辅助因子、化学物质参与农药的转化，而引起农药降解。微生物还可以 通过促进光化学反应方式使得农药降解。微生物的降解作用主要是通过其分泌酶 的代谢来完成，其本质为酶促反应，其中包括三类：第一类为广谱性酶的偶然性 代谢；第二种类型为微生物通过共代谢作用使农药降解，所谓共代谢是指微生物 利用营养基质的同时将污染物分解代谢成无害物质，从而达到降解目的。许多研 究表明，由于某些化学农药的结构复杂，单一的微生物不能使其降解，需靠两种 或两种以上的微生物种群的共同代谢来降解心1 勿。其中包括微生物去毒代谢作用， 它是指微生物将农药成份中对自身有毒害的部分降解或转化，在这个生物反应中 微生物不是从农药中获取营养或能源，而是为了自身生存1 。三是利用农药作为 能源适应酶进行的降解代谢叫届1 。常见的降解酶类主要有两类嘲：其一为水解酶类， 如裂解酶、硫基酞胺酶等；其二为氧化还原酶类，如过氧化物酶和多酚氧化酶等。 1 2 2 非酶促反应 非酶促作用作用方式较多，包括以下几个方面：( 1 ) 脱卤作用，是某些脂肪酸 生物降解的起始反应；( 2 ) 脱烃作用，作用发生在农药有烃基连接在n 、o 或s 原 子上；( 3 ) 胺及酯的水解，有些微生物可水解这些化合物中的酰胺和酯键，如苯胺 类除草剂等；( 4 ) 还原作用，由微生物引起的还原作用主要将硝基( - n 0 2 ) 还原成为 氨基( - n h 2 ) ，此外，通过微生物的硫醇类化合物将醌类还原成酚类；微生物的还原 反应还常使带硝基的农药还原成氨基衍生物，如硝基苯还原成苯胺类，这种反应 在某些带芳香环的农药代谢中常见。( 5 ) 环裂解，芳香环可被许多土壤细菌和真菌 降解；( 6 ) 氧化作用，多数微生物可合成加氧酶，使分子氧进入到有机分子，农药 以这种方式被氧化是常见的羟基化过程，在芳烃类化合物的生物降解中尤为重要， 苯环的羟基化是苯环裂解和分解的先决条件；( 7 ) 合成反应，分为缩合和结合两类。 其中缩合反应将有毒分子或其本身的一部分与另一有机化合物结合，从而使农药 1 3 1 基因工程方法应用于降解菌株 通常从自然界筛选出的降解菌，其降解酶活性较低或降解作用比较单一。为 了提高降解酶的活性及降解效率，通过基因工程技术将除草剂等污染物代谢途径 的各种酶引入同一菌株并在其上游引入强启动子，获得基因工程菌株。利用基因 工程技术构建的基因工程菌既具有混合菌的功能，又可以满足纯培养的要求，它 们的生理代谢稳定，生长繁殖及适应能力强，导入的降解酶能够高效表达，是降 解有机污染物的有力手段。构建高效的基因工程菌可以显著提高农药降解效率例。 环境微生物尤其是细菌中的农药降解基因、降解途径等许多农药降解机制的阐明 为构建高效降解性的工程菌提供了理论基础。长残效除草剂的降解主要是酶促反 应过程，这些酶由染色体或质粒编码，因此克隆、表达除草剂代谢途径中的关键 酶基因( 表1 3 ) ，构建基因工程菌株是除草剂高效降解的关键。利用基因工程技 术构建的基因工程菌，可达到高效降解常残效除草剂的目的。 表1 - 3 应用分子生物学方法获得的降解基因 t a bi - 3t h ea v a i l a b l eg e n e sf r o mt h ew a yo f m o l e c u l a rb i o l o g y 绪论 1 3 2 农药酶制剂和固相酶反应器的研究 如果用微生物产生的酶来处理农药而不是直接使用微生物菌株，那么降解效 果更明显，对环境造成的威胁也可以避免。研究已经表明，某些酶比产生此类酶 的微生物菌体本身更能忍受不断变化的环境条件，比如：对硫磷水解酶可耐受高 达1 0 的盐浓度，1 的溶剂浓度和5 0 的温度，而产生这种酶的假单胞菌在这种 条件下却不能生长。然而降解酶是一种蛋白质，在土壤中易发生变性而失活， 降解活性难以长时间维持，而且酶在土壤中的移动性差，应用具有一定的困难， 这样，研制固相酶反应器等问题就成为研究的热点m 1 。 1 3 3 农药降解菌的应用效果 对农药降解菌的应用效果的研究也取得了一定的进展，主要的方法是降解菌 制成菌剂后进行小规模的盆栽试验，再进行大规模的田间试验。王永杰等口钉从活 性污泥中分离到的甲基对硫磷的降解的兼厌气性降解菌种产碱菌属的一个种应用 于盆栽试验，取得了很好的效果。方玲等1 将分离到的微生物制成混合降解菌， 茵剂应用于盆栽和田间试验，所得到的降解效果类似于实验室纯培养试验，降解 效果显著。可见利用农药降解菌制剂解决农药残留问题是可行的，目前，国内已 有较多农药残留降解菌制剂产品获得专利并投入生产使用。 1 3 4 微生物降解农药的研究中存在的问题 微生物降解农药的研究中也存在着一些问题，目前的研究主要集中在实验室 内获得单一纯培养的降解菌株，然后研究它的特性、降解基因及降解效果。然而 这一方法不完全符合实际情况，在多种微生物共存的自然状态下，是通过微生物 之间的共同作用把农药降解。并且，农药残存于土壤、农产品等复杂环境中，即 使在实验室内菌株的降解能力很强，到了自然条件下也可能达不到期望的作用效 果或无法生存。自然环境中的温度、湿度、p u 值等因素变化很大，影响到微生物 对农药的降解。如何克服环境的影响从而充分发挥目标微生物的作用是需要解决 的重大问题。被农药污染的环境广泛存在，对于土壤和水体的污染，微生物很容 易与污染物接触，从而发挥它们的降解功能。但是，对于食品来说，利用微生物 浓度下进行的，农药污染环境中的化合物成分多样，所受污染程度也不同，这给 微生物降解农药化合物带来影响和困难。微生物能否适应污染的环境，这不仅包 括自然环境，还包括到生物之间的相互作用。接种到环境中的微生物受到抑制物 的影响，或受到土壤微生物的影响，甚至受到较强的拮抗作用而不能生长，这些 都可造成微生物不能成为优势菌而失去降解作用。构建多菌株复合系，具有稳定 性和抗污染的优点，但也同样存在降解微生物能否成为优势群体的问题m 1 。 虽然基因工程菌用于污染物处理取得了一定的成果，但是，基因工程菌的应 用研究尚停留在实验室水平，真正投入应用的还很少，而且基因工程菌在实际应 用中存在一些问题，主要包括基因工程菌构建的技术问题和应用安全性问题嘶1 。 利用降解质粒的相容性和自由转移性，可以使一个菌株内存在许多具有高效降解 能力的质粒i 但是，过多的质粒存在于同一菌株细胞中将会增大寄主细胞的负担， 从而减慢菌株生长和繁殖速度，不利于污染物的高效处理。利用原生质体融合技 术进行降解工程菌育种的研究虽取得很好的成绩，但是，利用此技术最主要的困 难是寻找便于检测的遗传标记。常规的遗传标记如抗药性等通过诱变后可得到， 但降解酶活性通过诱变后可能会降低，甚至丧失，这样合适的遗传标记就很难找 到。另一个问题是原生质体融合技术在构建工程菌过程中使得过多或对降解能力 不利的基因整合到菌株中，使得其降解能力下降。通过生物工程技术构建的具 有高效降解能力的工程菌进入自然环境后，存在着很大的生物安全隐患，可能对 人类自身的生存和生态环境的平衡造成不利影响。 1 4 二苯醚类除草剂的主要微生物类群及其分离筛选方法 氟磺胺草醚作为一种高效的二苯醚类除草剂，尤其适用于黄豆等豆类的阔叶 类杂草的早期紧急控制吼鞠蜘。引入中国以后，鉴于它的低用量，高活性，氟磺 胺草醚很快成为最广泛应用于黄豆类作物的除草剂之一。但是，这种除草剂在土 壤中会持续作用很长一段时间，残存于土壤中的药物因其较大的植物毒性会对轮 r 绪论 i i i | 作产生破坏作用。微生物的降解是二苯醚类除草剂在土壤中主要的分解方式m 1 。 迄今为止，已经发现多种二苯醚的降解菌株。k e u m 等人在2 0 0 8 年报导了假单胞菌 属w i t t i c h i i r w l 能够降解甲氧除草醚、除草醚和乙氧氟草醚。固氮菌属c h r o o c o c c u m 能够利用乙氧氟草醚作为生长的唯一碳源1 。1 9 9 4 年，s m i t h g r e e n i e r 和a d k i n s 在 添加甲基二氯苯氧基丙酸的基本培养基中分离出六种具有生长能力的非发酵型革 兰氏阴性杆菌。在木质素存在的条件下，白腐担子菌类采绒革盖菌能够代谢氯代 除草醚和除草醚h 钉。有关多种二苯醚的微生物降解作用的代谢途径已有研究。浅 黄金色单胞菌可使甲基二氯苯氧基丙酸变为二氯苯氧基丙酸和4 ( 2 ，4 二氯苯氧) 苯酚。c h a k r a b o r t y 等人在2 0 0 2 年报道了ac h r o o c o c c u m 对乙氧氟草醚的主要降解途 径，先将硝基还原为氨基化合物，随后进行乙酰化、氧脱烷基化和脱氯作用。k e u m 等人在2 0 0 8 年也发现了硝基二苯醚能够被w i t t i c h i ir w l 降解，是通过对硝基的最 初的还原和氮乙酰化，其后醚键断裂完成的。氟磺胺草醚的降解也已有研究。g s t 介导的巯基共轭对氟磺胺草醚的去毒作用在黄豆的应用中是非常成熟的婶伽。但 是，有关氟磺胺草醚的微生物降解作用，目前仍没有完整的细菌培养资料。 由于残留除草剂对农作物的毒性作用，致使其产量大为降低，因此鉴别土壤 中具有降解氟磺胺草醚能力的微生物的种类极为重要，成为当前研究的热点。 目前，降解菌筛选方法较为相似，降解菌筛选主要流程为：采集土样一富集 培养一驯化一测定纯化菌株的降解率一得到所需的目标菌株一鉴定菌株一菌株的 生长特性一菌剂制备一田间试验。土样多是除草剂生产厂家排污口的淤泥和生产 车间附近及长期使用除草剂的土壤，在这些土壤中的微生物长期受该类除草剂的 驯化，筛选到降解菌的几率比较大h 5 瑚j 刀，还有少数是从实验室自己驯化的土壤中 筛选( 实验室中的驯化是指定期在被驯化的土壤中提高该类除草剂的浓度) 。富集 和驯化使有降解能力的细菌形成优势菌群。驯化完成后，将菌液中的细菌经微生 物学操作将菌落据形态不同进行纯化，进一步划线培养，得到单菌落。将有降解 效果的菌株纯化后接种至含农药的无机盐培养基中进行筛选，用色谱法定量检测 降解率，确定降解率，对优势的降解菌进行深入研究。 黑龙江大学硕士学位论文 1 5 本实验研究的目的和意义 过量的使用化学除草剂尤其是长残效除草剂虽然减少了农业杂草对农业生产 的危害，但相应的也造成了土壤、水体污染，粮食、蔬菜、水果超高的农药残创纠9 1 。 氟磺胺草醚作为具有高度选择性的苗后除草剂，能有效防除大豆、花生田的阔叶 杂草，对禾本科杂草也有一定防效。氟磺胺草醚也是主要长残效除草剂品种之一 嘲，在土壤中不易降解，残留期较长，对后茬敏感作物造成药害，严重影响种植 结构的调整隋哺1 。 我国每年因长残效除草剂残留产生的药害带来的经济损失很大，所以，如何 消除氟磺胺草醚的残留毒性是亟待解决的问题。可利用高效的生物降解技术控制 和消除二苯醚类除草剂残留在农田环境中的污染，细菌作为微生物的庞大类群， 且能较容易地适应不同环境，故而利用细菌降解土壤残留农药的研究报道较多 删。本研究以氟磺胺草醚为供试农药，分离、筛选对氟磺胺草醚具有高效降解能 力的菌株，研究降解菌的生物学特性，并利用盆栽的方法评价其降解效果，为二 苯醚类除草剂的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。 1 6 本实验研究的主要内容及技术路线 1 6 1 主要研究内容 ( 1 ) 氟磺胺草醚高效降解菌株的分离与筛选；( 2 ) 降解菌株的形态、生理生 化及分子鉴定；( 3 ) 降解菌株的的基本生物学特性观察；( 4 ) 通过盆栽试验对降 解菌降解效果评价。 i 降解菌的初筛 l 降解菌的复筛 2 1 ，1 供试土壤和种子 供试土壤：受农药污染的土壤 表2 - 1 土壤编号及来源 t a b2 1t h er e e e s o u r sa n dt h el a n e so f t h es o i l 供试种子：高粱大粒红、玉米东农2 1 ( 购买自黑龙江省农科院) 供试草籽：苘麻、稗草( 采集于黑龙江省哈尔滨市杨马架子) 2 1 2 主要试剂 氟磺胺草醚( 虎威) 2 5 水剂，购自大连松辽农药厂； 氟磺胺草醚标准品含量9 9 0 , 6 ，购自s i g m a 公司； 其余试剂均为分析纯，购自沈阳禹王化玻璃试剂有限公司； 质粒载体：p m d l 8 - tv e c t o r ( 椰) ，生产厂家为t a k a r a ： 受体菌：高效感受态d h 5 a 细菌，本实验室保存； 水2 0 m l 卢戈氏碘液：碘片1 9 、碘化钾2 9 、蒸馏水3 0 0 m l 番红复染液：番红2 5 9 、9 5 7 , 醇1 0 0 m l 取上述配好的番红乙醇溶液1 0 m l 与8 0 m l 蒸馏水混合均匀即成。 2 1 3 培养基 无机盐培养基：n a c l1 0 9 、n h 4 n 0 31 0 9 、k 2 h p 0 41 5 9 、k h 2 p 0 4o 5 9 、m g s 0 4 7 h 2 0 o 1 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，加热充分溶解后1 2 1 高压灭菌1 5 r a i n 。 筛选培养基：以农药为唯一碳源的无机盐培养基是在无机盐培养基灭菌后冷却到 5 0 - 6 0 后向其中加入适量的农药配制成需要的浓度。 l b 液体培养基：胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l1 0 9 ，加入蒸馏水9 5 0 m l ， 用1 0 m o l l n a o h 调p h 至7 0 定容至1 0 0 0 m l ，1 2 1 高压灭菌1 5 r a i n 。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c i5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p n 为 7 2 。 表2 - 2 主要仪器及设备 t a b2 - 2t h em a i ni n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 名称制造商 g e n e a m p p c rs y s t e m9 7 0 0 l c 1 0 a t v p 高效液相色谱高压泵 s p d - 1 0 a v p 高效液相色谱检测器 c b m 1 0 2 高效液相色谱分析仪 v ( ) r t e x 5 振荡混合机 s h b 3 循环水多用真空泵 s i g m a 高速冷冻离心机 l a b om l s 3 0 2 0 高压灭菌锅 天能u v - 2 0 0 0 紫外凝胶成像系统 e c p 3 0 0 0 三恒电泳仪 e p p e n d o r f 微量移液器 s w c y c o 无菌工作台 生物显微镜x s 2 1 2 型 d g - 7 0 1 3 型电热干燥箱 w - 2 0 1 b 数显恒温水浴锅 电热恒温培养箱d n p 9 0 8 2 型 a b l 0 4 - n 电子分析天平 美国p e 公司 日本s h i m a d z u 公司 日本s h i m a d z u 公司 日本s h m 蛾u 公司 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 郑州杜甫仪器厂 美国s i g m a 公司 日本三洋电器 美国伯乐公司 北京六一仪器厂 德国e p p e n d o r f 移液器公司 苏州净化设备有限公司 南京江南光电股份有限公司 大连实验设备厂 上海申胜生物技术有限公司 上海精宏实验设备有限公司 梅特勒托利多仪器 有限公司 2 2 实验方法 2 2 1 氟磺胺草醚降解菌株的富集 参考摇瓶培养法富集技术m ，在驯化培养前进行富集培养。每个土样取5 9 ， 分别加到含有氟磺胺草醚s 0 m g l 的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，使用2 5 0 m l 三 角瓶，装量1 0 0 m l ，在3 0 恒温摇床上18 0 r m i n 振荡培养过夜。取富集培养液按 照1 0 的转接量分别加到含有氟磺胺草醚5 0 m g l 的液体基础无机盐培养基中( 以 氟磺胺草醚作为唯一碳源) ，使用2 5 0 m l 三角瓶，装量1 0 0 m l ，在3 0 恒温摇床 上1 8 0 r m i n 振荡培养( 培养条件下同) ；每隔7 1 0 天取培养物接种到新鲜的培养 - 1 4 材料与方法 基中，转接量为1 0 ，期间不断补充农药提高农药的浓度至5 0 0 m g l ，连续培养 3 0 天，驯化培养结束。 2 2 2 氟磺胺草醚降解菌株筛选 2 2 2 1 降解菌的初步筛选 将最终驯化培养产物，按1 0 的接种量，接种到氟磺胺草醚浓度为5 0 0 m g l 的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，3 0 。c 恒温摇床上18 0 r m i n 振荡培养过夜，应用固 体无机盐培养基，灭菌后冷却到5 0 , - - 6 0 c $ 1 1 入农药使其终浓度与富集培养基相同， 制作平板，取富集培养液分别稀释1 0 、1 0 - 2 、1 0 3 、1 0 4 、1 0 一、1 0 、1 0 。7 、1 0 。8 倍，各取1 0 0 p l 涂布于加农药的无机盐平板上，置于3 0 。c 恒温培养箱中培养嘲1 。 2 2 2 2 降解菌的分离纯化 挑取生长较好的菌落进行三区划线根据菌落外观特征把不同的菌划线纯化三 次，得到纯化的菌株，以获得纯培养。上述优选菌株经初筛、复筛和纯化，将分 离的菌株作为本研究的目标菌株，接种于试管斜面培养基4 。c 保存。同时将具有降 解效果的菌株接种于5 0 m l 加农药的无机盐液体培养基中，在3 0 恒温摇床 1 8 0 r m i n 振荡培养9 6 h ，将培养液经过处理后，应用高效液相色谱检测其农药残留 量。 2 2 3 高效降解菌降解能力的确定 氟磺胺草醚在固体平板上只看到生长的茵落，观察不到透明圈现象，所以培 养基中残留农药量要使用高效液相色谱法进行测定。 2 2 3 1 试样的前处理 取降解反应后的培养液，将培养液按甲醇：水：无水乙酸= 6 0 ：4 0 ：0 0 5 的 比例，直接向培养液( 视为水) 中加甲醇和无水乙酸，充分混匀；用玻璃注射器吸取 一定量用0 4 5 1 a n 的微孔滤器将液体过滤到进样瓶中，待测。 2 2 3 2 氟磺胺草醚液相色谱分析条件 确立液相色谱条件：色谱柱( 2 5 c m x 4 6 m m ( i d ) ) 不锈钢柱，内填c 1 3 ( 5 r u n ) ， 温度室温，检测波长2 9 0 h m ，流动相为甲醇：水：乙酸= 6 0 ：4 0 ：0 5 ( ) ，流速 降解率的计算方法：由色谱仪软件根据标准曲线计算样品中氟磺胺草醚的残 留量，再人工求出其降解率。 氟磺胺草醚降解率( ) = 1 一( 实测残留量对照样实测残留量) i x l o o 。 2 2 4 高效降解菌的鉴定 2 2 4 1 形态特征鉴定 菌落形态观察：不同种类的细菌在相同成分或状态的培养基上的生长特征各 异，因此可作为鉴定细菌的依据之一。配制牛肉膏蛋白胨培养基，灭菌后倒平板， 待凝固后将幼龄菌种划线接种在平板上3 0 c ，恒温培养1 0 1 6 小时，观察并记录 菌落形态、质地、边缘形状、光学特性以及菌落颜色等蛳1 。 革兰氏染色 取一干净的载玻片，滴一滴生理盐水于载玻片中央，用接种环以无菌操作从 过夜培养的平板中取少许待测菌落于水滴中，混合均匀并涂成薄膜，室温自然干 燥。待菌液干燥后，将载玻片的涂面朝上，通过火焰2 3 次，以使细胞质凝固，固 定细胞形态，使之牢固附着在载玻片上。固定好后，滴加结晶紫( 以刚好将菌膜覆 盖为宜) 初染i m i n ，用水冲净结晶紫后，用碘液冲去残水，然后用碘液覆盖l m i n ， 水洗，9 5 7 , 醇脱色约2 0 s ，然后滴加番红复染约2 m i n ，水洗，用滤纸吸去载玻片 上的残水，镜检观察菌体形状、大小及颜色。菌体若为红色，则为革兰氏染色阴 性；菌体若为蓝紫色，则为革兰氏染色阳性。 芽孢染色 取一个干净的小试管，用接种环挑取2 3 环菌台于试管中，搅拌均匀，制成浓 的菌悬液。加孔雀绿染液2 3 滴于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管 置于沸水浴的烧杯中，加热染色15 2 0 m i n 。用接种环挑取试管底部菌液数环于洁 材料与方法 净的载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3 次温热固定，水洗，直至流出 的水无绿色为止。用番红染液染色2 - 3 m i n ，倾去染液并用滤纸吸干残液，干燥后 镜检，芽孢呈绿色芽孢囊及菌体成红色。 2 2 4 2 生理生化鉴定 生理生化鉴定参照伯杰细菌鉴定手册进行嗽1 ，选取微生物鉴定常用的指 标进行鉴定：乙酰甲基甲醇p - ) 试验，菌膜形成试验，淀粉水解，明胶液化，甲 基红，七叶苷，尿酶试验以及糖醇的发酵( 蔗糖、水杨苷、山梨醇和乳糖) 等。 v p 试验 培养基：蛋白胨5 9 ：葡萄糖5 9 ；磷酸氢二钾5 9 ：蒸馏水1 0 0 0 m l 。 方法：接种后于3 0 c 培养2 4 小时，每管加质量分数4 0 k o h1 5 滴，再加质 量分数5 荼酚1 0 滴，振荡，然后