（微生物学专业论文）具有纤维素酶活性的酿酒酵母工程菌株构建研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导f ，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：啦日期：论文作者签名：一! ! g日期： 洲j “ 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东人 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：王塑叠 导师签名：i 型丞堡垒 日期：型 些至奎兰塑苎堂垡堡壅 摘要 丝状真菌瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 是目前发现的对纤维素降解最有效的 菌种之一。纤维素酶系含有三大类组分：内切葡聚糖酶( e n d o g l u c a n a s e e g ) 、纤 维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e ，c b h ) 并t l 葡萄糖苷酶( g l u c o s i d a s e s ) ，不同的纤维素 酶组分通过相互之间协同作用降解纤维素。纤维素酶的基因克隆及其在酿酒酵母 中的高效表达对发酵工业尤其是啤酒生产具有重要意义。本论文把强力降解纤维 素的瑞氏木霉的纤维素酶基因转入酿酒酵母中，构建了能分泌纤维素酶、且在遗 传_ 二稳定的酿酒酵母工程菌株。 采用p c r 技术分离得到了酿酒酵母的m e t l o 基因的启动子和终止子序列； 将瑞氏木霉内切纤维素酶i ( e g i ) c d n a 基因分别插入到酵母p g k l 和m e t l o 基因 启动子和终止子之间，构建了具有不同拷贝数的e g l 表达分泌质粒p r s 4 1 5 m e 、 p r s 4 1 5 p e 和p r s 4 2 5 p e ，通过电转化使重组质粒转移至实验室酿酒酵母菌株 h 1 5 8 中，分别得到了3 株重组酵母h l m 、h l p 和h 2 p 。在3 株重组酵母中，重 组内切纤维素酶i 都能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达。在y p d 培 养基中三株重组酵母生长速率大致相同，h l m 、h l p 与h 2 p 的胞外e g i 酶活力 分别达到7 0 4 ，1 2 6 7 和1 2 5 0 u m l ，它们都能在一定程度上利用麦芽汁中的b 一 葡聚糖，其利用程度分别比h 1 5 8 高出1 7 8 、2 4 - 3 和2 7 。 从瑞氏木霉c d n a 文库中分离得到了瑞氏术霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶i ( c b h i ) c d n a 基因，将该基因分别连接到酿酒酵母表达载体p a j 4 0 1 和p v t i o o _ u 上，转化酿酒酵母h 1 5 8 ，得到了表达c b h l 的重组酵母菌株h p c 和h a c 。h p c 和h a c 胞外c b h i 酶活力分别为4 u l 和3 5 u l 。 构建了同时表达c b h l 和e g l 的重组酵母菌株h m e p c ，比较了h m e p c 和 h i m 对纤维素底物的降解情况，发现前者的滤纸酶活比后者提高了1 4 3 。 由于高产纤维素酶的重组啤酒酵母菌株可以有效地水解麦芽汁中的b 一葡聚 糖，使啤酒的滤过性和最终啤酒的质量得到改善；而部分或完全消除啤酒酵母 m e t l o 基因( 编码酿酒酵母亚硫酸盐还原酶的一个亚基) 的活性应导致亚硫酸盐 积累，其结果可增强啤酒抗氧化的能力，同时增加啤酒风味的稳定性。本论文的 最终目的足利用同源重组和定位整合技术把瑞氏木霉e g l 基因整合到啤酒酵母 些蔓茎堂堡兰兰堡笙苎 染色体上m e t t o 基因位点，构建m e t l o 基因被敲除、而缮f 在m e t l o 启动子控制 卜- 进行表达的重组啤酒酵母菌株。 用g 4 1 8 抗性质粒进行转化，探索了酿酒酵母工业菌株转化的条件。当g 4 1 8 的浓度为1 5 0 , g r 川，收获细胞o d 6 0 0 值为1 2 1 5 时，使用电穿孔法得到的转 化子数可达1 0 0 0 个u gd n a ，初步解决了工业酵母菌株转化效率低的问题。为 实现e g l 单拷贝定位整合至工业酵母染色体上m e t l o 位点，我们把c e n a r s 质 粒p r s 4 1 5 m e 线性化后，与含g 4 1 8 抗性标记的自主复制型质粒p a l 5 t x 进行共 转化。共转化系统的建立为进一步的工业菌株改造奠定了基础。对于整合了e g l 的重组啤酒酵母工业菌株的挑选和验证工作正在进行中。 关键词：瑞氏木霉，内切纤维素酶i ，外切葡聚糖纤维二糖水解酶i ，酿酒 酵母，共转化，定位整合 山东大学硕上学位论义 a b s t r a c t t h ef i l a m e n t o u sf u n g it r i c h o d e r m ar e e s e ii so n eo ft h em o s te f f i c i e n to r g a n i s m s w h i c hc a i ld e g r a d ec e l l u l o s e t h ec e l l u l a s es y s t e mc o n s i s t se s s e n t i a l l yo ft h r e et y p e s o fe n z y m e s ：( 1 ) e n d o l 4 - 日一d g l u c a n a s e s ( e g ) ，( 2 ) e x o l ，4 一一d g l u c a n a s e s ，a l s o c a l l e d1 4 b d c e l l o b i o 时d r o l a s e s ( c b h ) a n d ( 3 ) 1 , 4 1 3 一d g t u c o s i d a s e s d i 能r e n t c e l l u l o l y t i ce n z y m e sc o o p e r a t ei nd e c o m p o s i n ge e l l u l o s e t h ec l o n i n go fc e l l u l a s e g e n e sa n dt h e i rh i g he x p r e s s i n gi ns a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ei so fg r e a ts i g n i f i c a n c ei n f e r m e n t a t i o ni n d u s t r ye s p e c i a l l yb e e r sp r o d u c t i o n t h ee g la n dc b h lf r o mzr e e s e f w e r et r a n s f e r r e dt o 曼c e r e v i s i a e a n dc e l l u l a s e s p r o d u c i n gs c e r e v i s i a ee n g i n e e r i n g s t r a i n sw i t hs t a b l eh e r e d i t yw e r ec o n s t r u c t e d t h e p r o m o t e ra n d t e r m i n a t o ro fm e t l o g e n ef r o m sc e r e v i s i a ew e r eo b t a i n e db y p c r t os t u d yt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tp r o m o t e r sa n dc o p yn u m b e r s ，t h ee g lc d n a g e n ef r o mt h ezr e e s e iw a si n s e r t e db e t w e e nt h ep r o m o t e ra n dt e r m i n a t o rr e g i o n so f e i t h e rt h em e t l oo rp g k lg e n eo fy e a s t t h ee g lg e n ew a st r a n s f e r r e dt o 墨c e r e v i s i a e o nac e n a r sp l a s m i dp r s 4 1 5o ram u l t i c o p yp l a s m i dp r s 4 2 5 ，a n dw a s e x p r e s s e d i nr e c o m b i n a n t 曼c e r e v i s i a eh l m h l pa n dh 2 p a 1 1t h et h r e er e c o m b i n a n ty e a s t s t r a i n ss e c r e t e de g i b y t h e g u i d e o ft h e s i g n a lp e p t i d e i t s e l f d i f f e r e n t b e n d o g l u c a n a s ea c t i v i t i e sw e r eo b t a i n e d i nh l m ，h l pa n dh 2 p “m 7 0 4 ，1 2 6 7a n d 1 2 5 ou m lr e s p e c t i v e l y , t h o u g ht h eg r o w t hr a t e so ft h e mi nr i c hm e d i u mw e r es i m i l a r t h eh y d r o l y z i n gd e g r e e so ft h r e er e c o m b i n a n ty e a s ts t r a i n so f 0 一g l u c a n si nw o r t w e r eh i 【g h e rt h a nh 1 5 8 r e a c h i n g1 7 8 2 4 3 a n d2 7 r e s p e c t i v e l y t h ec b h lg e d ew a so b t a i n e db yp c rf r o mzr e e s e ic d n a1 i b r a r ya n dw a s i n s e r t e di n t ot h e 曼c e r e v i s i a ee x p r e s s i o nv e c t o rp a j 4 0 1a n dp v t l 0 0ut oc o n s t r u c t t h ee x p r e s s i o nc a s s e t t eo fc b h l t h ec b h lg e n ew a st r a n s f e r r e dt osc e r e v i s i a eo nt h e d i f f e r e n te x p r e s s i o np l a s m i d s a n dc b h lw a sp r o d u c e db yr e c o m b i n a n t 工c e r e v 面i a e s t r a i n sh p ca n dh a cw i t h c e l l o b i o h y d r o l a s e s a c t i v i t i e s4 u la n d3 5 u ，l r e s p e c t i v e l y c b h ia n de g ic o - e x p r e s s i n gr e c o m b i n a n ts c e r e v i s i a es t r a i nh m e p cw a s c o n s t r u c t e d t h ef i l t e rp a p e r a c t i v i t yo fh m e p c i n c r e a s e d1 4 3 t h a nt h a to fh l m b a r l e y0 一g l u c a n sp r e s e n ti nw o r tr e d u c eb e e rf i l t e r a b i l i t ya n dc a u s eh a z e sa n d g e l a t i n o u sp r e c i p i t a t e si nt h ef i n i s h e db e e r ar e c o m b i n a n t b r e w e r sy e a s tw i t ha b i l i t y o f s e c r e t i n gb g l u c a n a s e w o u l d e f f i c i e n t l yh y d r o l y z e t h e s e b g l u c a n s i n s a c c h a r o m y c e sy e a s t s m e t l oe n c o d e sas u b u n i to fs u l f i t er e d u c t a s e p a r t i a l o rf u l l e l i m i n a t i o no fm e t l og e n ea c t i v i t yi nab r e w e r sy e a s t sw o u l dr e s u l t ei ni n c r e a s e d s u l f i t ea c c u m u l a t i o n b e e rp r o d u c e dw i t hs u c hy e a s t sw o u l ds h o wi n c r e a s e df l a v o r s t a b i l i t ya n db eq u i t es a t i s f a c t o r y t h eu l t i m a t ea i mo ft h i s w o r ki st oc o n s t l a a c ta r e c o m b i n a n tb r e w e r sy e a s ts t r a i ni nw h i c ht h ee g lg e n ei si n t e g r a t e di n t ot h em e t l o 山东大学硕士学位论文 l o c u sa n de x p r e s s e du n d e rt h em e t l o p r o m o t e rb ys i t e d i r e c t e di n t e g r a t i o na n dg e n e r e p l a c e m e n t t h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fb r e w e r sy e a s tw a se s t a b l i s h e db yi n v e s t i g a t i n g t r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o n s t h ee f f i c i e n c yb ye l e c t r o p o r a t i o nr e a c h e d1 0 3t r a n s f a r m a n t s gd n au n d e rt h et r a n s f o r m m i o nc o n d i t i o n so ft h ec o n c e n t r a t i o no fs e l e c t i o nm a r k e r g 4 1 8a t1 5 0u g m ia n dt h eh a r v e s t e de e l 】d e n s i t ya to 1 3 6 0 0 1 2 1 5 t bi n t e g r a t e s i n g l e c o p ye g lg e n ei n t ot h ey e a s tc h r o m o s o m e t h ec e n ，a r sp l a s m i dp r s 4 1 5i s l i n e a r i z e da n dc o t r a n s f o r m a t e di n t ob r e w e r sy e a s tw i t ha na u t o n o m o u s l yr e p l i c a t i o n p l a s m i dd a l 5 t xw i t h g 4 1 8 一r e s i s t a n c e g e l i e t h e s ee x p e r i m e n t r e s u l t sm a d et h e p r e p a r a t i o nf o rt h el a t e rr e f o r m a t i o no f t h ei n d u s t r i a ls t r a i n s t h e s c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o n o fr e c o m b i n a n tb r e w e r sy e a s ts t r a i n sw i t h t a r g e t e de g lg e n e i su n d e r t a k i n g + k e y w o r d s ：t r i c h o d e r m ar e e s e i e n d o - b g l u c a n a s ei ，c e l l o b i o h y d r o l a s e i ， s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，c o t r a n s f o r m a t i o n ，s i t e d i r e c t e di n t e g r a t i o n d 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 纤维素物质是地球上最丰富的可再生资源，植物材料的主要组分除了半纤维 素和木素以外，就是纤维素。纤维素物质占地球总生物量的4 0 ，它由b 一1 , 4 一 键连接的葡萄糖单位长链组成，这些长链再形成更复杂的纤维素结构。将纤维素 物质转化为人类社会所需要的糖类、乙醇及其它化工产品是对可再生资源利用中 的一项重要内容，与人类生存有密切关系。纤维素降解生物对维持地球上的碳素 循环至关重要。它们产生的纤维素酶可以把结晶纤维素水解成纤维寡糖，最终降 解为葡萄糖并被生物体进一步转化利用。 1 1 瑞氏木霉纤维素酶的分类及工业用途 瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 是一种嗜温型腐生丝状真菌，它是一种研究得 很清楚而且非常有效的纤维素分解菌。它能产生一个包含不同纤维素水解酶的家 族，其底物特异性和作用方式各不相同，但它们都水解在纤维素底物中连接葡萄 糖单元的1 3 1 , 4 一键。它们都是胞外糖蛋白，被大量高效地分泌至培养集中。 根据木霉纤维素酶系在纤维素降解过程中的作用可以分为三类：( 1 ) 内切 一l ，4 一b d - 葡聚糖酶( e n d o g l u c a n a s e ，e g ) ：( 2 ) 外切一1 ，4 一b d 一葡聚糖酶，又称1 , 4 p d 一纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e s ，c b h ) ；( 3 ) 1 , 4 1 3 - d 一葡萄糖瞢酶 ( g l u c o s i d a s e s ) ( m e p e n t t i l ae ta l ，1 9 8 7 ) 。内切纤维素酶能够通过内部随机攻击碳水 化合物链而水解可溶的替代性纤维素，如经常用来确定内切葡聚糖酶活性的底物 羧甲基纤维素( c a r b o x y l m e t h y l c e l l u l o s e ，c m c ) ，但对高度有序的结晶纤维素活力 较低。外切纤维素酶对替代纤维素无效但能够降解结晶纤维素，从纤维素链的非 还原末端或还原末端剪切纤维二糖单位。葡萄糖苷酶能把其它酶产生的纤维二二糖 和其它短的纤维寡糖水解成葡萄糖( s t a h a l b e r g e ta 1 1 9 8 8 ) 。 瑞氏木霉能产生大量的内切和外切纤维素酶，但葡萄糖苷酶的活性很低。其 产生的内切纤维素酶组分主要有e g i 和e g i i i ，外切纤维素酶缎分主要有c b h i 和c b h i i ，它们的基因序列和蛋白质级结构已经清楚( s a l h e i m oe ta 1 1 9 8 8 ： p e n t t i l ame ta 1 1 9 8 6 ) 。根据蛋白质氨基酸序列相似性分析，纤维素酶分为6 个家 族。瑞氏木霉e g i i i 属于a 族，c b h i i 属于b 族，e g i 和c b h i 属于c 族( h e n r i s s a t e ta 1 1 9 8 9 ) 。 山东大学硕_ _ 【_ _ 学位论文 从酶学性质上看，e g i i i 的k i n 值比e g i 的低两个数量级，而e g i 的转换数 ( t o n ) 却比e g i i i 的高两个数量级，结果这两种酶的催化效率( t o n k m ) 却在同 一个数量级) z ( s a l h e i m o e ta 1 1 9 8 8 ) 。成熟的e g i 由4 3 7 个氨基酸残基组成，另有 2 2 个氨基酸的信号肽，它的催化区位于蛋白质的n - 末端，纤维素结合结构域 ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 位于c 一末端，分子量为5 0 k d ( p e n t t i l am e ta 1 1 9 8 6 ) 。成熟的e g i i i 由3 9 7 个氨基酸组成，第3 2 9 位谷氨酸残基是活性位点中 的必需氨基酸( m a c a r r o n e ta 1 1 9 9 3 a ) 。其分子量是4 8 k d ，p i 值为5 1 。在p h4 5 之间表现较高的活性。在p h 4 8 时c m c a s e 活性最高。在3 0 。c 时，酶蛋白在p h 3 0 8 0 之间稳定。而在5 5 时，它的稳定p h 范围仅在4 0 6 3 之间。在瑞氏 木霉产生的内切葡聚糖酶中以e g i h 的催化效率最高( g o y a l1 9 9 1 ；m a c a r r o ne ta 1 1 9 9 3 b ；s t a h l b e r g e ta 1 1 9 9 3 ) 。 为明确e g 和c b h 纤维素酶系的关系，p e n t t i l a m 等人将e g l 全长c d n a 与 c b h l 基因序列比较，发现e g i 蛋白由4 3 7 个氨基酸组成，另有2 2 个氨基酸的信 号肽，与c b h i 蛋白序列有4 5 相同。其最保守的区域在c 端，显示7 0 同源 性。数据显示两蛋白在基因复制中由同一祖先发展而来。两基因都含两个内含子， 但它们无保守性。e g i 序列含有六个n 一糖基化位点，在c 末端的一个o 一糖基 化区域同c b h i 的c 末端很相似( p e n t t i l am e ta 1 1 9 8 6 ) 。t e n r i k s s o nh 等则报道 c b h i 和e g i 在结构上也非常类似，它们的酶活性位点都包含在手性识别物中 ( h e n r i k s s o nh e ta l ，1 9 9 6 ) 。 由于瑞氏木霉具有降解纤维素和半纤维素的完全酶系，它被传统地用于生产 各种酶制剂，如纤维素酶、淀粉酶等，其工业规模的生产工艺己比较成熟。由瑞 氏木霉生产的纤维素酶类已被用于食品和饲料工业，如用于淀粉加工、动物饲料、 乙醇发酵、啤酒酿造、果汁的提取等。最好的菌株可产生胞外纤维素酶蛋白的量 比一般细菌高几百倍( k n o w l e s e ta 1 1 9 8 7 ；u u s i t a l o1 9 9 1 ) 。 近几年来，纤维素酶还用于制浆、造纸和纺织工业( 曲音波等，1 9 9 7 ；q u y i n b o a n dg a o p e i j i1 9 9 8 ；n e v a l a i n e n1 9 9 2 ) 。在造纸工业上，纤维素酶可用于改善纸浆 的性能，如提高脱水速度、纸张的光滑度、撕裂系数和抗拉系数等( j i a n ge t a 1 1 9 9 8 ) 。以纤维素酶为主要成份的混和酶己成功地用于各种回收纸的脱墨。酶法 脱墨产生的最高亮度级的产品比例由常规脱墨的不足2 0 提高到8 0 以上。在 山东大学钡士学位论文 纺织业和洗衣业中，采用低剂量的内切纤维素酶进行各种表面处理。它代替浮石 对牛仔服装进行砂沈，可增加洗衣机的负载，缩短处理时间，不需除去浮石，防 止石头对机器和牛仔服装的机械磨损，有利于蓝色染料从纤维表面的磨光，同时， 保证了服装的强度( w r i g h t1 9 9 8 ) 。 1 2 酿酒酵母的遗传工程 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是研究得最彻底的真核微生物，它有助 于我们对真核细胞生物学乃至人类生物学的研究。几个世纪以来，酿酒酵母已被 用于食品和酒精饮料生产，如今它也应用于制药工业中的大量不同工艺。酿酒酵 母因其非致病性而非常受欢迎，由于它在可消耗产品生产中的长久应用历史，诸 如酒精和烘酪酵母，它已被分类为g r a s 生物( g e n e r a l l yr e g a r d e d a ss a f e ) 。另外， 使用酿酒酵母在生物技术领域应用的另一重要途径是它对重组d n a 技术基因修 饰的易感性，而1 9 9 6 年出版的酿酒酵母全基因组序列( g o f f e a ua ，1 9 9 6 ) 的得到 使其应用更为便利。 酿酒酵母菌株改良的传统方法包括：1 ) 诱变育种，即利用物理、化学等诱 变因素，诱发基因突变，然后根据育种目标，从无定向突变株中筛选出具有某一 优良性状的突变株；2 ) 采用杂交、转化和转导等遗传学方法，使微生物发生基 因重组以增加优良性状的组合，或导致多倍体的出现。但是这些方法存在缺点： 随机性大、问接、费时、耗人工。 然而，基于重组d n a 技术的基因工程育种则可以弥补上述缺点，可以定向、 直接地将有用的遗传信息输入微生物细胞，从而实现定向育种。微生物的基因工 程育种一般采用两种方式：1 ) 引入新的基因，使菌株获得新的性状；2 ) 定向诱 变( s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) ，即在体外使基因的特定区域有效地突变，置换受体 菌该基因的野生型拷贝，改良菌种的某一性状。 1 2 1 酿酒酵母的遗传转化系统 1 2 1 1 酵母转化的筛选标记 自从1 9 7 8 年建立了酵母转化方法( h i n n e ne ta 1 1 9 7 8 ) ，重组d n a 技术不仅 用于实验酵母也用于工业酵母。酵母转化最常用的是基于内源2 u 质粒复制起点 的高拷贝自主复制质粒( b r o a c h ，1 9 8 3 ；v o l k e r t e ta 1 1 9 8 9 ) 。染色体上高频率的同源 重组技术( o r r - w e a v e r e t a 1 1 9 8 1 ) 、基因融合技术( g u a r a n t e ，1 9 8 3 ；r o s e a n d 山东火学硕上学位论文 b o t s t e i n 1 9 8 3 ) 、构建含中心粒功能和质粒a r s ( 自主复制) 序列的环状微染色 体( c a r b o n ，1 9 8 4 ) 和构建含端粒d n a 序列的人工染色体等技术也被用于酵母转 化。这些技术大大地促进基因表达和染色体功能的研究，也为传统菌株改良和外 源蛋白生产的研究提供了技术支持。 筛选标记的选择主要是依转化的宿主菌株的遗传特性而定。经常采用的是必 需的生物合成酶的基因，并且与宿主的隐性缺失互补，如l e u 2 ，h i s 4 ，t r p i 。很 明显，宿主菌染色体必须有标记基因的缺失突变，而转化的质粒载体含有该基因， 而且只限于转化特定的突变菌株。显性筛选标记可用啤酒酵母本身的基因( 如 c u p l ) 、或采用非酵母的抗性基因( 如g 4 1 8 ) 。 与单倍体实验酵母的转化不同，工业菌株的转化并不基于带自养标记突变株 的互补。因为很难从多倍体工业株中获突变体，而且诱变则会干扰菌株的生化性 状。表1 1 为一些用于筛选转化株的显性标记，如抗氯霉素、g 4 1 8 、 s m ( s u l f o m e t u r o nm e t h y l ) 和铜( h a d f i e l de ta 1 1 9 8 6 ；y o c u m ，1 9 8 6 ；c a s e y e ta 1 1 9 8 8 a b ：h e n d e r s s o ne ta 1 1 9 8 5 ) 。这些基因使转化子和天然敏感株相比，具有对 抗生素或其它致死物质的耐受力。如s c e r e b i s i a e 中编码铜螯合因子( c o p p e r c h e l a t i n ) 的c u p l 基因有多个拷贝，它使对铜敏感的酵母具备了耐受性，从而在 含铜培养基上筛选到转化子。酵母i l v 2 基因的突变等位基因( 编码缬氨酸和异 亮氨酸生成途径中一种酶) ，是酵母转化细胞具有耐受除莠剂s m 能力。编码酵 母杀伤因子( z y m o c i n ，k i l l e r t o x i n ) c d n a 的表达能自动筛出含该质粒的转化子。选 择标记中还有些来源于酵母( 表1 1 ) ，如s d i a s t a r i c u s 的d e x l ( 编码葡糖淀粉 酶) 、s c e r e v i s i a e 的m e l l ( 编码b 一半乳糖苷酶) 分别使转化子能在淀粉和蜜二 糖中生长。 些墨查兰里主竺垡堡奎 表1 1 酵母转化使用的显性遗传标记 基吗来源 表达产物筛选表璀 ( g e n e 】( 5 0 u r c e )( g e n ep r o d u c t ) ( s e l e c t i o n ) 矗p t b a c t e r i a lp l a s m i d k a n a m y c i n g 4 | g ( g e n e t i c i n ) ( k i n 2 ) ( t n 9 0 3 , t n 5 ) p h o s p h o t r a n s f e r a s e r e s i s 协n e e a p h b a c t e r i a lp l a s m i d h y g r o m y c i n b h y g r o m y e i n b ( h m 8 ) ( p k c 2 0 3 )p h o s p h o t r a n s f e r a s e r e s i s t a n c e c a tb a c t e r i a lp l a s m i d c h l o r a m p h e n i c o lc h l o r a m p h e n i c o l ( c m “)( t n g )a c e t y l t r a n s f e r e s e r e s i s t a n c e p m rb a c t e r i a lp l a s m i dn o td e f i n e d p h l e o m y c i n ( t n 5 )r e s i s t a n c e a r o a8 a c t e r i a ie n o lp y r u v y l s h i - g l y p h o s a t e k i m a t 。p b o s p h a t e r c s l s t a n c d h f rb a c t e d a lm o u s e d i b y d r o f o l a t e m c t h o t r c x a t e r e d u c t a s er e s i s t a n c e t c m ly e a s tr i b o s o m a l p r o t e i nl 3 t r i c h o d e r m i n r e s i s t a n c e t t i n ry e a s u d p n a c e t y l g l u c o s -t u n i c a m y c i n a m i n e1 ，p - t r i 盯1 5 f e r s l l 辨r e s i s t a n c e m g ry e a s tn o td e f i n e d m e t h y l g l y o x a l r e s i s t a n c e c u p ly e a s t c o p p e r c h e i a t i n c o p p e r r e s i s t a n c e p o f l y e 8 s tc i n n a m i ca c i dc i n n a m i ca c i d d e c a r b o x y l a s e 代s i s t a n c e l l ，v 2y e a s t a e e t o h y d r o x ys u l p h o m e t a m n a c i ds y n t h a s e m e t h y l l c s k s t a n c e k l l k iy e a s tk i l l e rt o x i n r e s i s t a n e et d ( c d n a ) i m m u n i t yf a c t o r k i l l e rt o x i n d e x ly e a s t a m y l o g l u c o s l d a s e g r o w t ho n ( s t a 2 ) d e x 廿i n m e l ly e a s td g a l a c t o s i d a s e g r o w t ho n r a e l i b i o s e i 2 1 2 酵母转化机制 工业酵母的转化频率低子实验酵母，且转化频率变动性很大，常依赖于菌株 的特性和筛选的方法。常用的转化方法包括原生质体法( 1 - i i n n e n e ta 1 ，1 9 7 8 ) 、醋 酸锂法( i t oe ta 1 ，1 9 8 3 ) 和电穿孔转化法( m e i l h o cc ta l ，1 9 9 0 ) 。很明显，与整合型 质粒比较，整合转化频率比在染色体外自主复制并且在细胞内为多个拷贝的质粒 的转化率要低几个数量级。在整合型转化中，筛选标记必须足够强以使得即使转 9 山东大学碗上学位论文 化细胞只整合极少甚至一个拷贝的外源基因也能筛选出。己报道用于单拷贝的转 化子筛选的选择标记有c m 7 和s m ( h a d f i e l d e ta 1 1 9 8 6 ；c a s e y e ta 1 1 9 8 8 a b 1 。 尽管咀2p 质粒为基础的自主复制质粒在多倍体和二倍体菌株中的稳定性 要高于单倍体，但它们在非选择条件下被认为是不稳定的( f u t c h e ra n dc o x ，1 9 8 4 ； m e a de ta 1 ，1 9 8 6 ；p a n c h a le ta 1 ，1 9 8 7 ) 。例如带c u p l 基因的质粒在放大啤酒酵母 菌株( c a n t w e l le ta 1 ，1 9 8 5 ；e n a r ie ta 1 ，1 9 8 7 ) 中是相当稳定的，但在淡色啤酒酵母 株中是不稳定的。尽管经常有报道这些自主复制质粒在某些受体细胞中有足够的 稳定性，但是如果稳定性是一重要因素的话，应首选整合外源基因到酵母染色体 e 这一方案。 可利用无酵母复制起点但含有与酵母基因组某些序列同源的d n a 序列的载 体来进行整合。通过重组，同源序列整入酵母染色体相应位点。如果转化前，在 酵母来源的序列区域将载体线性化可提高整合率( o r r - w e a v e r e ta 1 ，1 9 8 3 ) 。由于整 合会破坏染色体上的位点，基因通常插入非必需位点如接合所需的h o 位点 ( y o c u m ，1 9 8 6 ) 或核糖体r n a 位点( 在基因组上有一百个以上的拷贝) ( f u j i i e ta 1 ， 1 9 9 0 ) 。但是，整合到必需位点如l e v 2 ，i l v 2 ，p g k l 或a d h l ，似乎也能被接 受，因为菌株染色体组的多拷贝使它们的等位基因仍保持完整。至今还元大量的 整合后表达良好的实例，因此很难确定最适合整合及基因有效表达的位点，也还 不明确工业酵母的多倍体或双倍体的性质是否对整合的d n a 有不良影响。 整合是有益的，不仅因为整合d n a 的稳定性，而且因为通过整合可以获得 仅含少量外源d n a 的菌株。通常使用的载体含有在e c o l i 中扩增所需的细菌序 列。但是这些序列不允许存于最终的食品发酵中。 运用以下的整合转化方案可以去除受体基因组中整入的外源非目的基因序 列。图1 1 阐明y o c u m ( 1 9 8 6 ) 描述的方法，即设计某一整合型载体通过体内重组 的方式整入染色体，同时去除非目的序列。载体携带g 4 1 8 抗性标记和l a c z 标记， 转化予在生色底物x g a l 平板上产生蓝斑。利用g 4 1 8 抗性和蓝色获得初始转化 子，再通过筛选g 4 1 8 敏感性和白斑获得因同源重组而丢失多余序列的重组克隆。 如果基因需整合到靶位点的其它拷贝上，上述菌株可利用g 4 1 8 抗性再转化。同 理任何在单拷贝状态下能产生相应表型的选择性标记如氯霉素抗性基因 ( h a d f i e l de ta 1 ，1 9 8 6 ) 也能用该“丢弃( j e t t i s o n i n g ) ”法。 生奎查兰堡主兰堡堡苎 l t xi 州zs 暑l咖m ti l l f l t _ - 。- - - i ! z ：2 ：2 j - l l l 2 l l g l l l l 目- c i ：2 ：2 i - - ：】- i i i - e ；：2 ：2 ：；：2 ：! ；：j - - 一一t 州一 - _ 钾 州i t i_ 1一 t h 蜘i l 悯s c r e e 帕n i n i 嗍gf o rc 2 数d w h 瓶l t g 柏xa | 蛐i n t e g r a l e d i n t oc i 甘a m o n o 翻怕啊n 的噶秘响嘲 l t h t h e8 1 r a i n 图1 1 目的基因整合到酵母染色体上的示意图 在第。次整合后，再次通过同源重组，产生两种类型的重组子 一半为无非必需序列( 选择标记和l a c z 基因) 的重组子 一些至奎兰塑主兰堕堡奎 c o t r a f 憾f o r r r u z t i o n s e l e c t l o nf o rt 嘻n 刚咖m i s e l ， i m n o o f c a l l s c l i r r y i n gg o n ex i g r o w t hi nn o n - s e l e c t i r ec o n d i t i o n s s c r e e n l n go fs e l - c e l l s i 一- 一 p r o m i l e n e xt e r m - _ _ - 弓三己2 臣匿蚕墨匿蒌蓥e z 2 z - 一 g e n ex s t a b l yi n t e g r a t e d i n t oc h r o m o s o m e n o o x t r a g e n o u as e q u e n c t m l e f ti nt h es t r a i n 图1 2 用共转化的方法将目的基因整入酵母基因组的示意图 1 2 山东大学预士学位论文 利用共转化也能获得整合( 图1 2 ) ，此时转化所需的选择标记在一种可自主 复制的质粒上，而目的基因在另一线性分子上。当