（动物遗传育种与繁殖专业论文）小鼠胚胎sry基因的rna干涉研究.pdf

摘要 为了研究s t y 基因的调控网络，采用s i r n a 技术使s t y 基因沉默，探讨了有 效沉默s t y 基因的途径和最佳条件。 我们设计、合成针对小鼠s r y 基因的发夹状寡核苷酸链，退火后连入真核表达载 体p s i l e n c e r4 卜c m vn e ov e c t o r ，构建以小鼠s t y 基因为靶点的s i r n a 干涉载 体p s i l e n c e r4 1 s t y 2 1 7 及p s i l e n c e r4 1 s r y 5 6 5 ，通过尾静脉注射法将载体质粒 导入妊娠小鼠体内，于小鼠妊娠第1 1 5 天，即1 1 5d p c ( d a y sp o s tc o i t u m ，性交 后天数) 取出胚胎，采用双重p c r 法对胚胎进行性别鉴定，鉴定为雄性的胚胎采用 半定量r t - p c r 法检测s t y 基因的表达量，研究不同干扰序列、不同注射时间及注 射剂量对s t y 基因表达量的影响。 研究结果，确定了质粒的最佳注射时间为9 5d p c ，注射剂量为2 0 瞻，注射干 扰质粒p s i l e n c e r4 1 s r y 5 6 5 对s r y 基因的抑制效率达8 5 左右。表明：s i r n a 可以显著抑制雄性胚胎s t y 基因的表达。 关键词：s i r n a ；s t y ；小鼠胚胎：基因沉默 s t u d yo nt h er n a i n t e r f e r e n c eo fs r y i nm o u s e e m b r y o s a b s t r a c t i no r d e rt os t u d yt h er e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f s r yi ns e xd e t e r m i n a t i o n ，w em a d eu s e o ft h es i r n at e c h n i q u et os i l e n c et h es r ye x p r e s s i o ni nm o u s ee m b r y o s t w os i r n a e x p r e s s i o nv e c t o r sw e r es y n t h e s i z e d ，p s i l e n c e r 4 1 l s r y 2 1 7a n dp s i l e n c e r4 1 s r y 5 6 5 t h e s i r n ae x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ei n j e c t e di n t og e s t a t e dm o u s et h r o u g ht a i lv e i n t h es e xw a s i d e n t i f i e db yp c r ，a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f 跚g e n ew a sd e t e r m i n e du s i n gr t - p c r t e c h n i q u ei nt h em a l em o u s ee m b r y o sa t 11 5d p c ( d a y sp o s tc o i t u m ) t h et i m e - a n dd o s e - d e p e n d e n te f f e c t sw a ss t u d i e d t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a to n eo ft h es i r n ae x p r e s s i o n p l a s m i d s ，p s i l e n c e r 4 t s r y 5 6 5 ，c o u l di n h i b i t t h es r y g e n ee x p r e s s i o ns i g n i f i c a n t l y e i g h t y - f i v ep e r c e n ti n h i b i t i o nw a so b t a i n e dw h e ni n j e c t i n g2 0g gs i r n a v e c t o ra t9 5d p c k e yw o r d s ：s i r n a ；s t yj m o u s ee m b r y o ：g e n es i l e n c i n g d ir e c t e db y ：p r o f d a oe r j i p r o f l i nx i u k u n ， a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：z h a oj i n h o n g ( c o l l e g e o f a n i m a l s c i e n c e a n d m e d i c i n eo f i n n e r m o n g o l i a a g r i c u l t u r a l u n i v e r s i 机h u h h o t , 0 1 0 0 1 8 ) 图l 图2 图3 图4 图5 图6 图7 图8 图9 图1 0 图1 1 图1 2 插图和附表清单 船r 基因及侧翼序列图， 小鼠s r y 基因结构及定位图 哺乳动物性别决定、性别分化因子之间作用模式图 r n a 干扰原理图， p s i f e n c e r4 卜c m vn e o 载体图 质粒电泳图谱 i i 5d 不同胚胎d n a 电泳图， 小鼠胚胎p c r 性别鉴定结果图 ， 小鼠i i 5d 雄性胎儿r n a 电泳图 不同靶序列对s t y 基因的表达影响电泳模式图 注射时间对s t y 基因表达量的影响图 s i r n a 表达质粒对s t y 基因抑制作用的量效关系模式图 0 0 0 n n卯嬲鹪四乱驼 l 置豇乱豇n l 良口；加n 他 缩略语表 a m p ( a m p i c i l l i n ) b p ( b a s ep a i r ) d d i o ( d is t i l i e dd e i o n i z e dw a t e r ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) d p c ( d a y sp o s tc o i t u m ) d s r n a ( d o u b l e s t r a n d e dr n a ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e c o l i ( e s c h e r i c h i ac o l i ) e d t a ( e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t a t i ca c i d ) h c g ( h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n ) m i n ( m i n u t e ) n t ( n u c l e o t i d e ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p 髑g ( p r e g n a n tm a r es e r u m ) p r o k ( p r o t e i n a s ek ) p t g s ( p o s t t r a n s c r i p t i o n 8 lg e n es i l e n c i n g ) s i r n a ( s m a l li n t e r f e r e n c er n a ) s h r n a ( s h o r th a i r p i nr n a ) r i s c ( r n ai n d u c e dg e n es il e n c ec o m p l e x ) r n a i ( r n ai n t e r f e r e n c e ) r p m ( r o u n dp e rm i n u t e ) r t p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e ) s ( s e c o n d ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) t r i s ( t r i h y d r o x y m e t h l a m i n o - m e t h a n o ) u ( u n i t ) p g ( m i c r o g r a m ) p l ( m i c r o li t r e ) ； 姗( m i c r o m e t e r ) 氨苄青霉素 碱基对 重蒸去离子水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 性交后天数 双链r n a 溴化乙啶 大肠杆菌 7 , - - 胺四乙酸 人绒毛膜促性腺激素 分钟 核苷酸 聚合酶链式反应 孕马血清 蛋白酶k 转录后基因沉默 小干扰r n a 短小发夹r n a r n a 诱导的基因沉默复合物 r n a 干涉 转每分钟 逆转录聚合酶链反应 秒 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷 单位 微克 微升 微米 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 哺乳动物性别决定是由y 染色体上s r y ( s e x - d e t e r m i n i n gr e g i o no ft h ey c h r o m o s o m e , s r d 基因决定的【l 】。众多研究表明：s r y 基因突变引起人或其它哺乳动 物性腺发育受阻。将小鼠暨y 基因导入x x 雌性小鼠受精卵，可使其向雄性化转变， 包括支持细胞的分化、迁移，并发育形成睾丸【2 】。这说明s t y 基因是性别决定的核心 基因，直接诱导精巢发育，对睾丸发育起着关键性的作用口1 。尽管s t y 基因的发现已 有近2 0 年的历史，但跚的靶基因还没有鉴别出来，它对下游基因调控的具体机理 尚不清楚。由于s t y 基因仅在胚胎发育过程中短暂表达，难以建立供分析、鉴定的体 外细胞培养系统，迄今为止在此方面的研究主要集中于对性腺发育缺陷的基因突变 体的分析和对跚转基因小鼠的研究【4 】，采用s i r n a 技术沉默s t y 基因的相关研 究尚未见报道。 r n a 干涉( r n a i n t e r f e r e n c e ) 技术口】是使基因沉默的重要工具。但由于小鼠s r y 基因的表达具有特殊性只发生在胚胎发育特定阶段，因此干扰s t y 基因的表达具有 一定困难，我们构建了s i r n a 干涉载体，探讨了有效沉默s t y 基因的干扰序列及导 入途径和剂量，确定了恰当的导入时间点，使正常雄性胚胎s r y 基因的表达量明显 下调。本研究结果使s t y 基因功能缺失，为进一步研究其对下游基因调控机理奠定 了基础，使从反向遗传学的角度研究s r y 基因成为可能。 1 1s r y 调控机制的研究进展 几千年来，人类一直在探索决定性别的奥秘。由于科学水平的限制，很难解释 性别决定的原因。进入本世纪以来，随着科学技术的发展和更新，特别是细胞遗传学、 分子生物学理论的发展，关于性别决定已逐渐成为一种科学。1 9 9 0 年s r y 基因的发 现是生命科学史上的一大突破，使性别决定机制的研究步入正轨，随后人们继续探讨 性别决定的分子机理，通过对性反转、基因突变或缺失及胚胎期雄性特定表达模式的 研究，先后发现d m r t l 6 1 、s o x 9 78 1 、s f l 9 1 、 7 1u o l 、l i m i 1 “、l h x 9 1 2 】和删朋1 3 1 4 】 等基因对动物性别的决定和性器官的分化也起着重要作用。其中s r y 基因是雄性发 育的关键基因，在性别决定过程中扮演“开关基因”的角色，目前普遍认为性别决定 过程可能是以s r y 基因为主导，由系列上游或下游基因参入和协调的级联反应过 程，至于控制c r y 表达的因子及控制s r y 的因子目前还不十分清楚，下面就s r y 及性 别相关基因的结构和功能及其相互作用调控网络的研究作一综述。 1 1 1s r y 基因的发现： 2 0 世纪6 0 年代，人们才认识到哺乳动物的性别决定依赖于y 染色体，y 染色体 具有强烈的雄性化作用，使胚胎的性腺原基发育成睾丸，因此，人们认为y 染色体上 携带有一个编码睾丸决定因子的基因( t e s t i s d e t e r m i n gf a c t o r ，t d f ，小鼠以t d y 2 小鼠胚胎s t y 基因的r n a 干涉研究 表示) ，经过近4 0 年的探索，性别决定理论终于在9 0 年代取得了突破性的进展。1 9 9 0 年s i n c l a i r ，g u b b a y 等首先克隆到y 染色体的性别决定基因s r y ( s e xd e t e r m i n g r e g i o no fy ) ，并加以命名【l5 1 ，在人类为s r r , 小鼠为s t y , 1 9 9 1 年k o o p m a n 等将含 有1 4k b 的s r y 基因片段作为转基因导入x x 雌性胎鼠中，结果部分小鼠产生了性反 转口j ，其大小、体重、交配行为与正常x y 雄鼠无异，尽管这种小鼠的睾丸比正常小 鼠的小，且不育、不产生精子，交配也不孕，但这一研究结果说明，s r y 基因是最佳 的t d f 候选基因，具有t b f 期望的性质。1 9 9 2 年报告了瑚，为一个外显子的单拷贝 基因，其i v l g 同源盒内的突变导致了人类4 6 ) ( 1 完全女性化的病例【1 6 】，进一步支持 了s r y 就是t d f 的判断。 睾丸决定因子的验证1 1 7 】： 1 ) s o u t h e r nb l o t t i n g 显示x y 型性别决定的真兽亚纲哺乳动物的y 染色体上 都有这一保守的s r y 同源序列。 2 ) s r y 基因的定位符合作为t d f 的要求。s r y 基因位于y 染色体短臂距拟常 染色体区界3 5k b 一个极小的范围内，与t b f 的位置相同。即使是以x x 染色体为遗 传背景，它的存在也足以使雌性个体发育为雄性，如转s r y 基因雌性小鼠( x x ) 可发育 为雄性小鼠( x x ) 。 3 ) s r y 基因表达具有时间特异性和空间特异性。小鼠s l y 基因大约在交配后 1 1 5d ( 睾丸形成前的极短时间) 在胚胎的尿生殖脊内低水平表达。p c r 检测也表明 s r y 基因在1 0 5d 前并不进行表达，在胎儿性腺发育阶段也不进行表达。所以，s t y 基因在性别决定中具有开关功能这与t d y 预期的功能是一致的。 4 ) 遗传学证据也表明s r y 基因是t d f 的最佳候选基因。一例x y 女性，她的y 染色体正常，她的性反转是由于s r y 基因h m gb o x 丢失四个核苷酸导致h m gb o x 阅 读框移码突变，编码了无功能的蛋白质。 1 1 2s r y 基因的结构、定位 1 9 9 3 年h u as u 等采用逆向遗传学方法对s r y 基因的结构等进行了初步鉴定 【i 剐。人类的s r y 基因位于y 染色体短臂距拟常染色体区3 5k b 的区段内只有1 个长8 5 0b p 的外显子。该基因有2 个多聚腺苷酸位点( 从t 从a ) 和2 个转录起始 位点，其问是一开放阅读框架( o r f ) ，可编码2 0 4 个氨基酸的蛋白质，其中包括能与 d n a 结合的h m g ( h i g hm o b i l i t yg r o u p ) b o x 基因序列在基因的5 端和3 端的 两侧分别是长达1 1k b 和1k b 的a t 区。在掰陛因上游非翻译区及富含g c 区 内还有两个蜀盯蛋白质的结合位点删c s + 和s r yc s 一。s r y 基因的启动子序列 位于s r y 基因上游3 1 0b p 的富含的g c 区域内。小鼠的s r y 基因也只有单个外显 子，位于1 个2 8k b 的单一序列的延伸部分，侧翼是1 个至少1 5k b 的长反向 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 重复序列。如图l 所示，该基因在哺乳动物中具有高度的保守性。迄今为止人们在 兔、猩猩、牛、马、猪、虎、大熊猫等许多动物中都找到了驸y 基因的同源基因。 s a y c s - s r y - c s + 一 睁 5 at e - j - , , 3 k - i 耐 i 卜 i i i 叫 围ls 靠y 基因及测器序列国( 鄙波等，1 9 9 5 ) i 。l ：，。，寓含a t 嚣t r ，r e s i o no f s h u n d ；i n ta t ) h ：s r y 撼因结构编码越 r e g i o no fs r y8 e r i es tr g c t u t e c o d i n 8 ) ：多聚腺苷酸位点【s i t eo fp o l y jl a 。b ：富古g c 区( r e g i o no fa b u n d a n tg o ) s r y - c $ - 。 s r 十c s + ：蛋臼结合也点is i t eo fp t 哦e i 矿b 量) 一。一一：两个转录起始挝点 t 可口s i t e so fl 曙n ，c r 啦如n i n h i a t i o n ) 无论是小鼠的s t y 基因还是人类的s r y 基因都位于y 染色体短臂上【l 引，小鼠的 s t y 基因处于一个至少1 7k b 的倒置重复序列内部，s t y 基因两侧的碱基序列几乎 是等同的( 图2 ) ，而人类的甜j ，基因则位于距拟常染色体区界3 5k b 的区段内，两 侧无倒置重复序列。由于人类s r y 基因的特殊位置，即紧靠x 染色体和y 染色体发 生配对、交换的拟常染色体区，所以人类比小鼠更易出现由于不正常的染色体互换而 造成的性反转现象。 图2 小鼠s r y 基因缩构厦定位( k o o p m a n ，1 9 9 5 ) s a 。s d ：接头受俸接头供体tr e c e p t o ro f t i c i n d o n a t o r 时 d r i n j 图右辩阴影区：徊置重复序列i n v e r s i o nr e p e a t 翱_ q u f 聃) ，圈rh m gb 露f ：单一序列毯2 8 k b ) e 斯誊i 口口 西稿n g t t 和q n t 2 - s k b ) l 4 小鼠胚胎s t y 基因的r n a 干涉研究 1 1 3 册 ，的作用与功能 s r y 基因是y 染色体上的性别决定序列，是主宰性别的睾丸决定因子，在雄性发 育过程中起着总开关的作用，船y 基因的瞬间表达产物能激发支持细胞分化和使双功 能的胚胎性腺发育成睾丸。研究表明，s r y 基因是转录因子，激活下游的11 4b p 启 动子，进而使下游苗勒氏体抑制物基因( m i s ) 表达，导致抗苗勒氏管激素( a m h ) 分 泌，从而抑制苗勒氏管发育，同时s r y 基因作用于间质细胞，使之分泌睾酮产生雄 性结构，而在雌性中由于缺乏s r y 基因，则导致x 染色体短臂d d s ( 剂量敏感性反 转基因) 位点基因的转录，促进卵巢发育，使中肾管退化。 1 1 4 辨r 的表达 1 9 9 0 年s t y 转基因小鼠的研究中发现，大约于性交后1 2 5d 的小鼠胚胎出现 代表睾丸发育的第一个肉眼可见的信号即从生殖嵴分化产生的睾丸索【2 0 】。这种表达发 生在支持细胞中，引起支持细胞分化产生s e r t o l i 细胞以小鼠为材料进行了最精确 的个体发育方面的研究，检测到s t y 在性交后1 0 5 - - 1 2 5d 于生殖嵴体细胞表 达，1 1 5d 是高峰时间【2 1 2 3 s r y 基因除在生殖脊中表达外，在成体睾丸中也表达， 开始于小鼠出生后2 1 2 8d 。这时的表达依赖于睾丸生殖细胞的存在，并伴随着精 原细胞的出现和第一次生精功能高峰的产生。尽管s r y 基因的表达在生殖脊中相对 较弱，但它在成体睾丸中的表达是中等水平，而且通过n o r t h e r n 杂交可检测到。但 与生殖脊中s t y 基因的表达相比，s t y 在睾丸的表达，其转录产物9 0 为环状 r n a 2 4 1 ，不同于胚胎生殖嵴。推测环状r n a 可能为一种无功能的r n a 存在，以调节 其转录水平，它特异性地存在于精原细胞的胞浆中。 1 1 5 册r 调节性腺分化机制 尽管钾r 基因的发现已有近2 0 年的的历史，但s r y 如何调节性腺分化机制还 不清楚【2 5 】。目前认为s t y 在性腺发育中起到遗传开关的作用，它的表达将引起一系 列的级联反应，可启动未分化x y 性腺在4 8h 内完成精巢形态分化。其主要过程包括 s e r t o l i 前体细胞增殖，中肾内源性细胞和内源性相关细胞向性腺迁移，雄性特异的 微管化( v a s e u l i z a t i o n ) 以及其它细胞的分化，进而形成雄性特异的两个区；精索( 基 质细胞包围着s e r t o l i 细胞) 和间质区( 包含l e y d i g 细胞) 2 6 j ，很多实验表明s t y 的表达水平对于性别决定是个关键因素具有高度敏感的剂量效应田】，k o i c h i r o l 2 ” 等( 2 0 0 4 ) 通过对老鼠胚胎性别分化过程中s t y 表达量和s t y 的5 端甲基化程度 的研究，认为在老鼠的性腺发育过程中，机体可以利用d n a 甲基化的方式调控8 r y 基因表达。新近的研究发现s r y 蛋白发挥正常的生物学效应必须完全到达细胞核内 才能完成【2 8 】。在s r y 蛋白的h m g 区域有2 个核定位信号( n u c l e a rl o c a li z a t i o n s i g n a l s n l s s ) ，分别是n 一末端n l s 和c 一末端n l s ，这两个信号彼此靠近。钟y 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 蛋白进入细胞核是由胞质中的i m p o r t i nb ( i m p b ) 蛋白和另外的目前仍不明确的途 径介导的例。野生型s r f 蛋白完全在细胞核内，突变型的簖r 蛋白部分在核内，多 数存在于细胞质中。细胞核内s r y 蛋白的低水平导致了x y 男性患者的性反转。 性别决定过程可能是以s r y 基因为主导，由一系列上游或下游基因参入和协调 的级联反应过程，在炉，s f l ，s p l 等基因产物的作用下，中胚层发育成为具有双 向潜能的生殖嵴。雄性胚胎在s r y 的作用下启动s o x g , d m r t l ，d m r t 2 等下游基因， 促使原始生殖腺分化为睾丸；而雌性胚胎则在双倍蜊肌作用下形成卵巢。 1 1 6s r y 上游调控因子 张t f w t l 基因于1 9 8 9 年被克隆，位于染色体ll p l 3 。该区带的缺失引起w a g r 综合 症( w i i m s 瘤、无虹膜、尿生殖系畸形智力发育迟缓) ；基因点突变引起更为严重的 d e n y s d r s h 综合症( w i l m s 瘤，肾小球肾病，性腺发育异常) 提示该基因在性腺肾脏 发育及肿瘤抑制中起作用 3 0 】。w t l 基因的表达出现在发育第9d 胚胎的中胚层，随 后出现在性腺嵴的支持细胞。口”基因基因敲除小鼠的性腺在胚胎发育1 1d 之前似 乎是正常的，i ld 上皮显著变薄，1 2d 开始凋亡，表明w t i 对性腺分化是必需的。 w t l 基因有1 0 个外显子，通过不同的剪接及翻译方式可得到1 6 种同工蛋白。在涉 及胚胎发育的基因调节中起重要作用，r t l 的作用方式是作为转录活化剂。炉”基因活 化s f 7 的表达，从而间接调节性腺的形成。w t l 能活化内源性的d a x l 启动予，胛y 删朋途径是哺乳动物性别决定过程中的早期事件。 野， s f l 核激素受体超家族成员之一，在肾上腺皮质性腺等合成甾体激素的组织中均 表达。在肾上腺性腺的分化中也起着重要的调节作用。其基因f t z - f 1 位于9 q 3 3 d “。 s f l 在胚胎期的表达有显著的性别差异，在胚胎1 2d 之前其表达水平在两性间并无 差异，当雄性小鼠的曲细精管开始分化时，即胚胎1 2 5 1 5d ，s f l 在赛托利细胞 的表达达高峰，而雌鼠卵巢中s f l 则持续处于低水平，直到出生后才增加。这种时 间和性别上的表达差异与m i s 基因表达嵴苗勒管退化一致。凡z - w 基因敲除雌雄小 鼠都缺乏性腺，肾上腺，却有输卵管，子宫，阴道等苗勒管衍化器官，这表明s f l 在 胚胎早期维持生殖导管的发育，随后调节睾丸m r s 的产生。s f l 蛋白属于核受体家 族，具有该家族的保守功能区，如d n a 结合区的两个锌指结构，识别d n a 的a g g t c a 单元：羧基端配体结合区的月p 2 反式激活区和富含脯氨酸区等【3 2 1 。 m r s 是s f l 下游靶基因，其启动子- 8 4 到一1 0 3 区域的m 2 m i s r e l 位点含 有c c a a g g t c a 序列，为s f l 结合区。该结合区的突变导致塞托利细胞系报告基因表 达降低。f f f l ，舳糟，g a t a 4 等还通过直接的蛋白间相互作用增强s f l 对m i s 的 6 小鼠胚胎s t y 基因的r n a 干涉研究 转录活性。小鼠d a x i 表达的启动子上也发现了s f i 的反应元件。并发现凡z - 刀基 园失活的小鼠d a x l 表达显著降低，表明s f i 控制d a x i 基因的转录( 3 3 】。 除性腺外，在下丘脑内侧核及垂体促性腺细胞也发现有s f i 的表达，其靶基因 为糖蛋白激素n 亚单位。物吁z 用基茵敲除小鼠垂体促性腺细胞功能严重受损，下 丘脑腹内坝0 核出现显著的形态异常，表明s f i 在生殖系统发育的多个层次上发挥作 用口0 】。 g a t a 4 属转录因子g a t a 家族，在小鼠胚胎l1 5d 出现，整个胚胎期睾丸塞 托利细胞呈持续高表达：而在雌性小鼠胚胎1 3 5d 卵巢分化时表达迅速下降。这表 明该因子在早期性腺分化中起作用。在m i s 。的启动子区域发现了g a t a 元件，邻 近8 f i 结合位点g a t a 4 通过与蜊直接作用。共同调节m i s 的转录【3 4 1 。 d a x ! d a x i 是核激素受体超家族中的一员，d a x i 基因数目的变化是人类性反转的一个 原因，这种性反转被称为计量敏感型性别反转。其中x y 个体之所以发育为雌性是由 于x 染色体短臂的x p 2 1 出现加倍所造成的。关于删肌和s r y 如何拮抗竞争性地 控制靶基因活性，已有一些实验证据支持如下的性别决定模型：d a x j 可以和核激素 受体超家族中s f i 形成杂二聚体。s f i 对于早期生殖腺的发育是必须的，睾丸执行各 种功能所必须的各种基因的表达也需有5 h 的存在，如穆勒氏抑制基因的表达，甾醇 类激素基因的表达等。d a x i 通过与蜊结合，改交了s f i 的性质，使它不能再激活 靶基因。除了谢尔托立氏细胞外，删朋和删总是同时表达，而且前者有调节后者 活性的功能。所以，在卵巢发育中，d a x l 和s f i 的二聚体抑制了第二性睾丸决定基 因，如s o x 9 等的表达。而在x y 个体的生殖腺中，肼y 也许通过改变d n a 构象而阻 止了s f i 和d a x i 杂二聚体的形成，或者阻止杂二聚体与靶基因的装配，同时又保证 踟仍具有激活与转录激活靶基因的活性。可是当删朋高水平或者对于s r y 提前 表达时。删朋将优先与s 卯结合，或优先与s r y 结合，防碍s f i 靶基因的正常表达， 因此，诸如s o x 9 等基因将永远不能达到阀值水平，保证谢尔托立氏细胞的分化，个体 发育为雌性，出现性反转现象。 1 1 7s r y 下游基因 s o x 9 s t y 作为转录因子可调节下游基因，从而启动原始性腺发育成睾丸，s t y 表达后 即可见到s o x g , f g f g , d h h , 与v n n i 等基因的表达【”3 6 】生殖嵴细胞内的直接靶基因尚 未得到证实，它对下游基因调控的具体机理还不清楚。在小鼠体内s t y 表达后即可 见到s o x 9 的表达大量增加，并由细胞质向细胞核内迁移p ”，进一步的研究发现 s o x 9 转基因x x 雌性鼠可产生睾丸并具有正常的s e r t o l i 细胞及l e y d t g 细胞，这提 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 示s o x 9 可代替s t y 基因的功能，或者y 的作用仅是提高s o x 9 的表达量p 钔。通 过5 矿m y c 6 的遗传工程鼠检测s t y 和s o x 9 的表达时序，m y c 6 作为一个标记。红 绿荧光单克隆抗体揭示了两种蛋白的不同的表达时序：在早期，s t y 首先在生殖嵴中 启动表达，此后不久$ o x 9 开始表达；当s o x 9 继续表达时，s t y 的表达关闭。这 研究结果揭示s o x 9 可能是s t y 的下游重要的性别决定基因。 d 融r | 1 近年来报道了2 0 余例由于9 号染色体短臂远端缺失引起的两性畸形，提示在 这一区域存在性别决定基因。随后在人类染色体9 p 2 4 3 发现了d m r t i 和d m r t 2 , 编码保守的转录调节区d m ，以剂量依赖方式决定睾丸分化，在男性的表达高于女性。 小鼠胚胎l i 5dd m r t i 在两性胚胎均有表达，至1 4 5d 在睾丸表达明显高于雌性 卵巢。结合人类d m r t i 突变引起性反转，表明d m r t i 是睾丸分化所必需的，可能位 于s r y 的下游【3 1 1 w t i ，s f i ，s p l 是s r y 上游表达，维持双向分化潜能的生殖嵴体细胞生长：s r y 则启动s o x g , d g r t l ，d m r t 2 等下游基因，促使原始生殖腺分化为睾丸；而在d a x i 作用下原始生殖腺分化为卵巢，目前对性别决定中所涉及的基因及其调节机制还远未 明了。 1 1 8 各因子相互作用及关系 上游基因的突变将影响s r y 基因的表达水平，从而导致性腺发育不全、畸形或 无性腺。s r y 在胚胎发育过程中的表达受$ f i 及s p i 的调控，s f l 属于核受体家族， c 一末端含有与d n a 分子结合的锌一指结构域；s p i 是一种转录因子，可与d n a 分子 上的g c 丰富区结合，对多种基因发生调控作用1 4 2 】，在性别发育早期s f i 与s p l 可 与s r y 基因上的启动子相互作用，从而启动s r y 基因的表达，s f i 基因敲除小鼠可 出现性腺发育障碍【4 3 j 。 哪些基因参与对s r y 进行调控，目前了解的甚少。美国学者最近的工作表明s t y 基因的正常表达受到胰岛素受体基因家族的调控，作者将小鼠功能有重叠的胰岛素受 体( 如础i nt e o e p t o r , 翻，胰岛素样生长因子l 受体( i n s u l i n i k eg r o z t hf a c t o t t e o e p t o e , i g f l r ) 和胰岛素受体相关受体( i n s u l i nr e c e p t o rr e l a t e d 坩c 印f d ， i r r ) 进行了三重基因敲除，观察到x y 雄性小鼠出现了性反转，性腺呈现卵巢特性，s t y 和：o x 9 的表达显著下降，雄性特异性劈子标志物p 4 5 0 s c o ，i n s l 3 ；d h h , 埘四和$ o x 9 在性腺组织中消失，而出现了卵巢特有的分子标志物f i g a 和w r i t 4 m 。表明性别决 定需要胰岛素信号途径的调节。 8 小鼠胚胎s t y 基因的r n a 干涉研究 o t ：来丹侄蛙腺；也卵盛：t l 卑兔：一轻希剐e 侉甩：i 蓑器i 略箍馆馏 o t ：如衄k r 嘲汹阳畦o ：删埘；t - 矧k 一：6 h 遁f m = l ：日疆埘醛b a 圈3 哺乳动物性别决定、性别分化因子之间作用模式图。 t e v o s i a n 等还发现，小鼠s t y 的表达需要翻7 a 4 ( 侧朋z i n c - f i n g e r t r a n s c r i p t i o nf a c t o r4 ) 和辅助因子f 0 6 2 ( f r i e n d o f 翻7 柳的协同作用1 4 5 】。5 研7 作 为雄性发育的总开关基因( m a s t e rs w i t c h ) ，其表达将启动下游一系列诱导精巢分化 的遗传变化和细胞活动。采用r t p c r 技术比较两种不同性别小鼠在胚胎性别发育过 程中的表达谱，发现跚基因的表达在n 5d p c 达到高峰，与x x 雌性小鼠相比， x y 雄性小鼠多种基因在发育1 2 1 4d p c 中的表达量明显升高：利用基因芯片技术测 定小鼠胚胎发育过程中性别相关基因的表达规律1 4 6 1 ，也得到了类似的结果，在性腺发 生分化之前，雄性与雌性小鼠多数基因的表达谱类似，但在1 2 5d p e 之后雄性与雌 性小鼠胚胎中多种基因的表达出现显著变化，其中s t y 与s o x 9 仅在雄性小鼠的睾 丸中表达。性别决定过程可能是以鲫j ，基因为主导由一系列上游或下游基因参入 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 和协调的级联反应过程。如图3 所示 综上所述，哺乳动物的性别决定是个层次调控过程，册j ，基因并非决定性别的 唯一基因。但它是睾丸决定因子，在性别决定中起关键作用，它一方面对其它基因表 达进行调控，另一方面又受控于其它位于x 染色体或常染色体上的基因，通过基因 间相互协调作用，实现其在雄性的性别分化中的控制作用。目前，s r y 的上游控制基 因，其下游靶基因及具体的作用机制等诸多方面都需要进一步的深入研究，相信随着 对这一基因的深入认识，必将促进家畜性别决定研究和畜牧业生产的发展。 1 2r n a 干涉在哺乳动物中的应用进展 r n a 干涉( r n ai n t e r f e r e n c e ) 简称r n a i ，是双链r n a ( d o u b l es t r a n d e d r n a ，d s r n a ) 分子在m r n a 水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。自1 9 9 8 年被发现以来，一直是分子生物学研究的热点，现已成为研究基因功能的重要工具， 显示出使特定基因表达缄默的价值，在反向遗传学研究中发挥重要作用。 1 2 1r n a j 的发现 1 9 9 0 年，n a p o l ic d 及其同事在矮牵牛中发现了种转基因同时抑制自身和相 应内源基因表达的基因沉默现象f 4 ”。他们本欲通过加入外源色素合成基因拷贝而产生 出更深的紫色牵牛花，但是实验并未达到预期的结果，有的转基因植物开出了全白或 部分白的花，这表明色素的合成不是被增强了，而是被关闭了。事实上，不仅导入的基 因没有表达，植物自身的色素合成基因也失活了，这种现象被称为基因的共抑制 ( c o s u p p r e s i o n ) 现象。 1 9 9 4 年，m a c i n o 和c o g o n i 发现将合成类胡萝卜素所需的基因导入粗糙红色链 孢霉，导致3 0 的转化细胞中霉菌本身的基因失活 4 引，并将其称之为基因的静息作用 ( q u e l l i n g ) 。 1 9 9 5 年，康乃尔大学的s ug u o 博士在试图阻断秀丽新小杆线虫( c e l e g a n s ) 中 的p a r - 1 基因时，发现了一个意想不到的现象1 4 9 】。她们本是利用反义r n a 技术特异性 地阻断上述基因的表达，同时在对照实验中给线虫注射正义r n a ( s e n s er n a ) 以期观 察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了脚。基因的表达途径。 这是与传统上对反义r n a 技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外 以合理解释。 1 9 9 8 年2 月，华盛顿卡耐基研究院的的f i r e 和麻省大学医学院的m e l l o 才 首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，s ug u o 搏士遇到的正义 r n a 抑制基因表达的现象，以及过去的反义r n a 技术对基因表达的阻断，都是由于体 外转录所得r n a 中污染了微量双链r n a 而引起。当他们将体外转录得到的单链r n a 1 0 小鼠胚胎s t y 基因的r n a 干涉研究 纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应交得十分微弱，而经过纯化的双链r n a 却正好 相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达同。该小组将这一现象称为r n a 干涉( r n a i n t e r f e r i n g ) 。在随后的短短几年中，r n a 干涉现象被广泛地发现于真菌、脉胞菌、 拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 2 0 0 1 年，e l b a s h i r 等人对哺乳动物r n a 技术有所突破，他们发现应用小于3 0 b p 的r n a 在哺乳动物中可以通过r n a 介导的沉默复合体( r i s c ) 成功介导r n a i ， 并不引起前面提到的干扰素途径，开拓r n a 干扰研究的新纪元，并将这种能够高度特 异性抑制哺乳动物基因表达的r n a i 称为小干扰r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a s 。 s i r n a ) 。 1 2 2f l n a i 的作用机制 r n a i 现象最初是在对植物和线虫的研究中发现的，r n a i 是通过双链r n a ( d o u b l e s t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 介导同源靶m r n a 的特异性降解，从而导致转录后 水平的基因沉默( p o s tt a n s c n p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) ，当p t g s 应用于动 物及即称为r n a i ，迄今r n a i 的详细机制和过程还不十分清楚f 5 “，目前认为此过程 可分为以下4 步： 1 ) 双链r n a 的切割：外源d s r n a 被d i c e r 酶切割成约2 2n ts i r n a ： 2 ) 沉默复合物的形成：s i r n a 以其独特的结构形成r n a 诱导的沉默复合物 ( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) ； 3 ) r i s c 的激活：s i r n a 的解旋及r i s c 的变构激活； 4 ) 靶m r n a 的降解：r i s c 中引导s i r n a s 特异性识别并切割与之互补的m r n a ， 导致靶m r n a 的降解。如图4 所示： 1 2 3r n a i 的特征： r n a i 是一种在动植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程，由 于被抑制基因同源的d s r n a 所启动，是生物基因组抵抗转座子或病毒之类的外来遗 传元件入侵的一种保护性机制，具有以下四个重要特征【5 ”： 1 ) r n a i 属于转录后水平的基因沉默机制，迄今为止的研究认为r n a i 对染色体 d n a 序列的复制和转录过程不产生任何影响： 2 ) 具有高度的序列特异性，最近将人工合成的s i r n a s 短小r n a ，是r n a i 过 程中直接起作用的分子) 转入宿主细胞的实验表明，即使s i r n a s 中只有一个碱基与 靶序歹g 错配，也会使干涉效应大大减弱： 3 ) 具有抑制基因表达的高效性，可以引起该基因缺失突变的表型；而且远选少于 内源m r n a 数量的d s r n a 就可以实现完全的抑制效应，即其发生过程中存在着正反馈 的信号放大效应： 内蒙古农业大学硕士学位论文11 4 ) r n a i 的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持，而且在某些生物中( 比如线 虫) 具有遗传性。 图4r n a 干涉原理圈 1 2 4s i r n a 的制备方法 1 2 4 i 化学合成法 e l b a s h i r 等嘲首次将化学合成的s i r n a 用于r n a 干扰的研究，他们用t t 代替3 粘端的u u ，所得2 1n ts i r n a 成本较低，同时可以增加稳定性。此后，多数研究 者均使用此种结构的s i r n a 。化学合成法合成的s i r n a 质量可靠，纯度高，可以进 行多种修饰。然而，化学合成的方法有着明显自身的缺点，即只能产生短暂的效应， 并且对靶m r n a 的特定序列有着很强的选择偏向性，需要多次试验才能筛选到有较强 作用的s i r n a 另外r n a 合成的费用也相当昂贵。