（微生物学专业论文）多种不同类型酸性矿坑水中微生物群落结构分析.pdf

硕士学位论文摘要 摘要 酸性矿坑水( a c i dm i n ed r a i n a g e ，a m d ) ，通常含有高浓度的铁、 铝、硅以及重金属离子如铜、锌、砷、金、银、铅、钙等，能引起严 重的水体污染。a m d 主要是通过风化作用以及微生物对一些硫化矿 ( 如黄铜矿，闪锌矿，方铅矿) 的作用形成的。酸性矿坑水中的微 生物可以大大地加速硫化矿物的氧化，而其中某些微生物可以从酸性 矿坑水中筛选出来并用来进行生物浸出。一些研究表明，酸性环境中 的微生物群落组成与矿水的物理化学性状及地理性状有关。为了更好 地了解酸性矿坑水和酸性矿坑水中微生物群落的组成、以及进行酸性 矿坑水的治理和为浸矿细菌的筛选提供理论指导，我们从广西大厂锡 矿采集了两个不同样点的酸性矿坑水，并从江西德兴铜矿、湖南七宝 山铜矿和瑶岗仙钨矿三个不同样地各自取回一个酸性矿坑水样品，对 其中的微生物群落组成进行了分析。 用p c r - r f l p 的方法研究了广西大厂锡矿两个酸性矿水样品t s 和w k 中的微生物群落组成。在两个样品中共检测到5 9 种1 6 sr d n a 的可操作单元( o u ，r ) 。通过对细菌1 6 sr d n a 基因序列的系统发育 树分析，这5 9 种o t u 可以分为4 大类：即n i t r o s p i r a 纲， 7 - p r o t e o b a c t e r i a 纲，a c i d o b a c t e r i a 纲和t z - a p r o t e o b a c t e r i a 纲。同时发 现在t s 样品中，a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ( 5 1 8 )和 l e p t o s p i r i l l u mf e r o o x i d a n s ( 4 6 4 ) ，群落结构十分单一。这与水样 周围生态环境稳定，p h 值低( p h 2 ) ，a s f e 和s 等其它一些重金 属浓度较高有关系。w k 样品中微生物群落较t s 样品复杂一些，除含 有a f e r r o o x i d a n s ( 16 ) ，l f e r o o x i d a n s ( 10 ) 之外，在7 - p r o t e o b a c t e r i a 纲中还含有与浸矿无关的l e g i o n e l l a 类微生物( 1 0 9 6 ) ，在n i t r o s p i r a 纲中含有l f e r r i p h i l u m ( 1 9 ) 。然而w k 样品中的优势种群为 a c i d o b a c t e r i a 类微生物( 4 3 ) 。a c i d o b a c t e r i a 类微生物a m d 环境中 是非常普遍和重要的。w k 样品的微生物群落组成是与其生态环境、 地理化学特性相符合的。 同样通过p c r - r f l p 的方法研究了来自江西德兴铜矿、湖南七宝 山铜矿和瑶岗仙钨矿的微生物种群的结构。共获得了8 5 个1 6 sr d n a 的可操作单元( o u ，r ) ，其中3 6 个o u t 被测序。来自两个铜矿的样 品中有7 个o u t 是两者共有的。而在铜矿和钨矿之间，两者共有的 硕士学位论文 摘要 o u t 较少。另外，有一个o u t 是三者所共有的。1 6 sr d n a 的系统 发育树表明，大多数序列( 6 7 ) 分布在p r o t e o b a c t e r i a 亚纲中，其它 的则分属于n i t r o s p i r a ，a c i d o b a c t e r i a ，a c t i n o b a c t e r i a 亚纲。在种的 水平上，氧化亚铁硫杆菌在两个铜矿样点是优势种群，而s p i n g o m o n a s 在钨矿为优势种群。主成分分析显示地理化学性状相似的地点，其微 生物群落结构也相似。我们的结果也显示，p h 和钨的含量对微生物 群落结构发挥着重要的作用。 总之，通过分析上述几个酸性矿坑水中微生物群落多样性，我们 发现本研究中酸性矿坑水的微生物群落多样性很低；酸性矿坑水中的 微生物多与己知的浸矿微生物相关；酸性环境中的微生物群落组成与 矿水的物理化学性状及地理性状有关；并且样地地理化学属性越相近 的样品中的微生物群落组成也越相似。 关键词：酸性矿坑水，p c r - r f l p ，微生物群落多样性，生物浸矿 硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t a c i dm i n ed r a i n a g e ( h m o ) w a sa c i d i ca n dg e n e r a l l ye n r i c h e dw i t h i r o n ，a l u m i n u m ，s u l f a t ea n dh e a v ym e t a l ss u c ha sc o p p e r , z i n c ，a r s e n i c ， g o l d ，s i l v e r , l e a d ，c a d m i u ma n ds oo n ，w h i c hh a sc a u s e d h a z a r d o u s c o n t a m i n a t i o nt ow a t e ra n dn a t u r e a c i dm i n ed r a i n a g ew a sf o r m e db y c h e m i c a lw e a t h e r i n ga n dm i c r o b i a lr e a c t i o no fm a i nm e t a ls u l f i d e r i c h r o c k ss u c ha sc h a l c o p y r i t e ( c u f e s 2 ) ，s p h a l e r i t e ( z n s ) ，a n dg a l e n a ( p b s ) t h es p e e do ft h eo x i d a t i o nc o u l db ea c c e l e r a t e du pt oah u n d r e dt i m e sb y t h ea c t i o no fb a c t e r i aw h i c hc o u l db es c r e e n e da n du s e df o rb i o l e a c h i n g s o m er e s e a r c hs u g g e s t e dt h a tt h em i c r o b i a lc o m m u n i t yo ft h ea c i d e n v i r o n m e n tw e r ec l o s e l yr e l a t e dt op h y s i c a l - c h e m i c a lc o m p o s i t i o na n d g e o g r a p h yo fm i n ed r a i n a g e t h eg e o c h e m i c a lc o n d i t i o n so ft h ea c i d m i n ed r a i n a g ew e r eh i g h l yv a r i a b l ef r o ms i t e - t o - s i t ea n dt h ec o m m u n i t y c o m p o s i t i o n sr e f l e c t e dt h i sc h a n g ei ng e o c h e m i c a lc o n d i t i o n s t ob e t t e r u n d e r s t a n dt h ea c i dm i n ed r a i n a g ea n dt h em i c r o b i a lc o m p o s i t i o n s t r u c t u r e ，w ec h a r a c t e r i z e dt h em i c r o b i o l o g yo ft w os a m p l e sf r o mt h e d a c h a n gs t a n n u mm i n ei ng u a n g x ip r o v i n c ea n dt h r e es a m p l e sc o m i n g f r o md e x i n gc o p p e rm i n e ，q i b a o s h a nc o p p e rm i n ea n dy a o g a n g x i a n t u n g s t e nm i n e ，c h i n a b a c t e r i as t r u c t u r ea n dc o m p o s i t i o no ft w oa c i dm i n e r a lw a t e r s a m p l e sf r o mt h ed a c h a n gs t a n n u mm i n ei ng u a n g x ip r o v i n c ew e r e s t u d i e db yt h er e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( r f l p ) m e t h o d t h e r ew e r e5 9k i n d so fb a c t e r i ad e t e c t e df r o mt h et w os a m p l e s t h e5 9k i n d so fb a c t e r i aw e r eg r o u p e di n t of o u rd i v i s i o n sa c c o r d i n gt o t h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f16 sr d n ag e n es e q u e n c e s t h e yw e r e ，n i t r o s p i r a ，y - p r o t e o b a c t e r i a ，a c i d o b a c t e r i aa n do t - a p r o t e o b a c t e r i a a c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ( 51 8 ) a n dl e p t o s p i r i l l u m f e r o o x i d a n s ( 4 6 4 ) w e r ea b u n d a n ti nt ss a m p l ew h i c hh a saq u i t el o wd i v e r s i t y i t ss t r u c t u r ew a sc l o s e l yr e l a t e dw i t hc o n s t a n te c o l o g ye n v i r o n m e n t ，l o w p hv a l u e ( 2 ) a n dh i g hc o n c e n t r a t i o no fa s ，f e ，sa n do t h e rh e a v ym e t a l s w ks a m p l eh a da c o m p l e x m i c r o b i a l s t r u c t u r e e x c e p t i n g a f e r r o o x i d a n s ( 16 ) ，三f e r o o x i d a n s ( 10 ) ，i t a l s oc o n t a i n e d l e g i o n e l l a - l i k em i c r o o r g a n i s m s w h i c hh a dn oc o r r e l a t i o nw i t h b i o l e a c h i n ga n dl 玎i p h i l u m ( 1 9 ) b u ta c i d o b a c t e r i a ，a l li m p o r t a n t i l l a n du s u a lg r o u pi na m de n v i r o n m e n t , w a sp r e v a l e n ti nw k s a m p l e m i c r o b i a ls t r u c t u r ea n dc o m p o s i t i o ni nl 仰( s a m p l ew a sc l o s e l yr e l a t e d w i t hi t se c o l o g ye n v i r o n m e n ta n dg e o c h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c s m i c r o b i a lc o m m u n i t yd i v e r s i t yi nt h ed r a i n a g ef r o mt h r e em i n e s ( d e x i n gc o p p e rm i n e ，q i b a o s h a nc o p p e rm i n ea n dy a o g a n g x i a nt u n g s t e n m i n e ，c h i n a ) w a sa l s oa n a l ，7 z e du s i n g16 sr d n ap c r - r f l pa p p r o a c h p h y l o g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h em o s to fm i c r o o r g a n i s m sw e r e c l u s t e r e dw i t ht h ep r o t e o b a c t e r i af a m i l y ，t h er e m a i n i n gw a sa f f i l i a t e d w i t hn i t r o s p i r af a m i l y ，a c i d o b a c t e r i af a m i l y ，a c t i n o b a c t e r i af a m i l y a t t h eg e n u sl e v e l ，a c i d i t h i o b a c i l l u sw a sd o m i n a n tg r o u pi nb o t hy 1 wa n d q b ss a m p l e sb u tg e n u ss p i n g o m o n a s w a sm o s ta b u n d a n ti ny g x s a m p l e m o r e o v e r ，t h ep r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tq b sa n d w h a ds i m i l a rg e o c h e m i c a lc h a r a c t e ra n dm i c r o b i a lc o m m u n i t i e s o u rr e s u l t a l s os h o w e dt h a tp ha n dt u n g s t e nc o n c e n t r a t i o nm a yp l a yt h ek e yr o l et o r e l a t i v ea m o u n ta n dd i s t r i b u t i o no ft h em i c r o b i a lc o m m u n i t i e s i nc o n c l u s i o n ，t h ed i v e r s i t yi nt h ea c i dm i n ed r a i n a g ew a sv e r yl o w c o m b i n e dw i mt h ep c aa n a l y s i sa n dt h ep h y l o g e n i ca n a l y s i s ，t h e m i c r o b i a lc o m m u n i t yo ft h ea c i de n v i r o n m e n tw e r ec l o s e l yr e l a t e dt o p h y s i c a l c h e m i c a lc o m p o s i t i o na n dg e o g r a p h yo fm i n ed r a i n a g e 佬 r e v e a l e dt h a ts i t e sw h i c hh a ds i m i l a rb i o g e o c h e m i c a lp r o p e r t i e sh a d s i m i l a rm i c r o b i a lc o m m u n i t i e s k e yw o r d s ：a c i dm i n ed r a i n a g e ，p c r - r f l p ，d i v e r s i t yo fm i c r o b i a l c o m m u n i t y ，b i o l e a c h i n g i v 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书面使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 作者签名：三态簋 e l 期- 2 坌立2 年月丝一e l 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名_ 王态篮导师签名割堂端 e t 期：2 q q 2 年上月上l e t 硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 1 i 酸性矿坑水( a m d ) 的化学性质以及形成原因 1 1 1 栅的来源及化学性质 金属硫化矿氧化作用导致了金属离子含量丰富的酸性水的产生，由于金属硫 化物的氧化反应为高放热反应，因而这些酸性水溶液温度相对较高。在大部分矿 葛中，最主要的金属硫纯矿物为黄铁矿( f e s 9 。人类逶过对黄铁矿开采潋获褥锈， 银，金，锌和铅等金属，这是因为这些金属通常与黄铁矿混杂在一起，或者存在 于黄铜矿( c u f e s 2 ) ，闪锌矿( z n s ) 和方铅矿( p b s ) 等其它金属硫化物中。矿物的 开采使褥更多的硫化矿表面暴露在空气和水中，从而增加了酸产生的比率，那些 具有低缓冲能力的矿物所在地区所产生的高度酸性的有毒的溶液被称为酸性矿 坑水( a m d ) 。 尽管a m d 是一种高酸性，热的，含有高浓度的硫酸盐和有毒金属离子的极 端环境，但是仍然有锻多的微生物存在于这一环境中，这些微生物在矿石的亚表 层能够形成一个化能自养的生物圈，通过从金属硫化矿物中获得电子供体，从空 气获得c 0 2 ，0 2 ，和n 2 ，以及水与岩石相互作用释放的磷酸盐来维持生存。同 时，这些微生物的活动也能够促进a m d 的形成，是a m d 大量形成的重要原因 嘲。这种a m d 的形成，已经导致了大量的环境污染。同时，在a m d 环境中生 存的微生物对金属的生物浸出也具有重要的意义，这些嗜酸性的微生物能够用于 矿物加工以及在工业生产过程中作为新的生物分子( 特别是酶) 的来源。一些透 过微生物作用导致的金属溶解并隧后从溶液中隧收金属昀方法具有悠久的历史 根源，并且已经被大量地报道n 一1 。同样，使用微生物从矿物中回收铜，金，钴 和铀等金属的研究也被大量报道协钉。利用微生物的作用对矿物进行处理主要出 于两种麓的，一是将不可溶的金属硫化物或者氧化物转变成可溶于水的金属硫酸 盐，或者作为一个前处理过程打开矿物结构，使得其它的化合物能够更好的渗透 矿物以溶解期望的金属。例如，转化存在于靛铜矿( c u s ) 或者辉铜矿( c u 2 s ) 等不 溶性铜为可溶的硫酸铜就属于第一种加工过程，使用微生物除去金包被的毒砂中 的铁，确和硫使褥矿物中保留的金在随后的氰化物处理过程中麓够被更容易的提 取则属予第二种过程，两种方式都是一个氧化的过程，要回收的金属被提取到溶 液的过程称为生物浸出，然而当需回收的金属仍然保留在矿物中时，生物浸出就 是一个不合适的术语，严格的来说这一过程应该称为生物氧化，不过，生物浸出 这一术语在两种过程中都被频繁使用。 硕圭学位论文第一章文献综述 1 1 2 a m d 产生的原因 1 。2 1a m d 产生的物理化学原因 有许多的因子能够影响a m d 的产生，如a m d 这种流体的化学性质，流量， 岩石的类型以及温度都能够部分地影响a l v i d 形成的速率。而矿物表面氧化剂的 供应通过影响黄铁矿分解速率，从丽影响a m d 的形成。典型的氧化剂为氧气和 三价铁离子，但是地下水中的氧浓度相对于全部反应中大量的氧气需求是很少 的： f e s 2 3 。5 0 2 + h 2 0 _ 阱2 s 0 2 + 2 h + ( 1 ) 因此，快速氧化系统中氧气主要来源于空气，实际上，要形成一个典型的a m d ， 每一部分的溶液都必须成百上千次的重复氧化n 。地球化学研究表明三价铁离子 比氧气更直接的参与硫化物的氧化，因此黄铁矿分解的主要途径为亚铁离子被氧 气氧化： 1 4 f “3 5 0 2 + 1 4 i - i + _ 1 4 f e 3 + + 7 h 2 0 ( 2 ) 随后三价铁离子被硫化物还原： f e s 2 + 1 4 f e 3 + + 8 h 2 0 - - + 1 5 f e 2 + + 2 s 0 2 + 1 6 i - i + ( 3 ) 等式( 2 ) 和( 3 ) 的反应之和用于描述一个持续的反应过程，反应( 1 ) 中通过 氧气使二价铁氧化成三价铁离子的过程在低p h 值的条件下速率很慢，因而等式 2 中的反应速率将成为a m d 产生过程中的限速反应 2 1 0 此外，微生物的代谢活 动和矿物溶解能够馒砖l 值降低至2 以下，通过低蠲值选择作用可以使存在于 这一环境中的微生物群落达到最优化。 1 1 2 。2a m d 产生的生物学原因 生理学实验表明，在黄铁矿，含砷黄铁矿，黄铜矿，自铁矿和闪锌矿的分解 过程中，a m d 中的微生物也能够影响硫的氧化速率“一1 ，但是对于微生物一硫化 矿物相互作用的详细机制仍存在着争论。目前认为黄铁矿氧化存在直接和间接两 种途径。 细菌浸矿的直接作用是指细菌吸附于矿物表面，对硫化矿直接氧化分解的 作用。e d w a r d s 建立了一个实验来确定细胞的附着对于细胞噬斑的产生是否是必 须的l ，他们使用了高分辨攀的电子显微镜( s e m ) 观测了f e r r o p l a s m a a c i d a r m a n u s ( 3 7 ) 和a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ( 2 5 ) 对硫化物的分解模式， 当这些细菌存在的时候黄铁矿表面会出现椭圆型的凹斑，然丽，在只有f e 3 + 存在 丽无微生物存在的环境下它们也同样存在，这表明细胞的存在对于凹斑的形成并 不是必须的。在a f e r r o o x i d a n s 作用薛自铁矿和含砷黄铁矿表面以及与 e a c i d a r m a n u s 作用的白铁矿表面没有观察到这种斑点，然而在e a c i d a r m a n u s 包 2 硕士学便论文第一章文献综述 围的含砷黄铁矿表面发现了圆形的深斑存在( o 5u r n ) ，清楚的表明细胞的靠近 能够促进矿物的分解。 目前细菌在矿物表面的作用尚不十分清楚。s c h a e f f e r 认为细菌是以化学吸附 方式在矿物表面作用9 ，但t a k a k u w a 贝, l j 认为是通过物理吸附“们。在支持物理吸 附的研究中，t a k a k u w a 与l o o s d r e c h r v a l l 等人认为静电力是细菌在黄铁矿、元素 硫表面吸附的唯一有效途径，并对细菌对矿物表面接触角及表蘧电性的影响进行 了研究n u ，d e v a s i a 等人通过对细菌、矿物及细菌吸附于矿物表面时表面z e t a 电位的测定表明，细菌和矿物表面的作用使细胞和矿物表面z e t a 电位发生很大变 化“船，证骧细菌的吸附对硫纯矿表面电性有较大影响。在支持化学吸附的研究 中，g o l o v a e h e v a 讶k 为在细菌浸矿过程中细菌可能是通过一层未知黏膜粘附予矿 物表面“柚，o h m u r a 等人进一步推测这种粘膜可能是某种蛋白质，细菌是通过氢 键、离子键、纯学键或蛋白酶与矿物表面进行作用的，c o s t e r t o n 认为细菌是通过 乙二醛，b a r r e t t 等人剿认为可能是通过c o o h ，攥h 2 ，- o h 等基团和矿物表面键 厶1 1 4 1 口 s h r i h a r i 等人研究认为，a f e r r o o x i d a n s 在硫化矿表面的直接浸出作用依赖于 一系列如颗粒粒度、吸附时阎及搅拌速度等物理化学参数，同时，这些因素亦影 响溶液及固体中细菌的生长速度、数量及细菌的性能。s h r i h a r i 对黄铜矿、黄铁 矿细菌浸出试验指出，在这些参数中，颗粒粒度影响最大，当粒度小于1 1 9 m 时，隧着粒度增大，矿物表面细菌吸附数量增加，浸出率会明显提高，认为是缨 菌吸附点变化所致。细菌对硫化矿物浸出的直接作用，可表示为： m s + 2 0 2 = m s 0 4 式中m 为z n ，p b ，c o ，n i 等金属。 b d c r l y 认为，细麓可直接分解矿物，但矿物分解及细菌氧纯产生酶弦为硫 化矿浸出的关键n 钉，即间接作用。 f o w l e r 等利用一个恒定的三价铁离子和亚铁离子浓度的连续流反应器，分 别在存在和不存在a f e r r o o x i d a n s 的情况下来研究是否微生物髓够比在三价铁离 子浓度增加的情况下更好的促进黄铁矿的浸出懈1 ，其研究发现，在细胞存在的 情况下，分解速率更快，意味着浸出酶的存在或者细胞表面f e 3 + 的积聚。e d w a r d s 引导了个对i r o nm o u n t a i n , c 氏u s a 黄铁矿的原位聚集实验并在实验室进行了 富集实验1 1 7 1 w 他们发现细菌倾向予在黄铁矿表面平行的 1 1 0 ) 和 1 0 0 方向，同 时他们还发现a c i d i t h i o b a c i l l u sc a l d u s 对黄铁矿，白铁矿和含砷黄铁矿的吸附是 非随机的7 1 ，没有细胞吸附于黄铁矿中的石英表面，说明细胞的吸附是一种矿物 特异性的反应。这些发现表面细胞在溶液中并不是简单的利用砖秘，丽是存在一 种趋化现象，可能在消融表面的外层存在一个t f 翻a q 梯度。细菌浸矿的间接作 3 硕士学位论文第一章文献综述 用可表示为： f e ( a 靴p 。m x s 铋p 镪p 避憾秽 式中m 为z l l ，p b ，c o ，n i ，b i u 0 2 等n 舳。 此外，还有研究表明微生物的存在对a m d 各种硫化矿有加强原电池效应的 作用。n a t a r a j a n 等人认为细菌的存在使硫化矿物静电位普遍上升，当有铁存在时， 尽管各个矿物的静电位均有上舞，但矿物阕的静电位差加大，从而使阳极矿物分 解加快，加强了原电池效应m 。李宏煦等研究表明呦1 ，除上述作用外，浸矿细 菌吸附于矿物表面，加强了电子转移速率，强化了原电池效应。细菌强化原电池 效应作翔的模型霹用圈说明轻心，细菌附着在阴极区，加强了阴极上氧的得电 子行为，强化浸出过程。另外，细菌氧化f e 2 + 为f e 3 + ，使浸出体系的氧化电位上 升，且吸附于阴极上的f e 3 + 得电子，同样加强阴极区得电子行为，强化原电池效 应。 1 2 酸性浸矿水中微生物的多样性 由于在a m d 环境中，微生物可利用的底物类型非常有限，因此，一些研究 者曾经认为，这些生境的微生物是极其贫乏。a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s 菌曾 被认为是是唯一的浸矿菌株。随着生物浸出产业的不断发展和对a m d 生境中的 微生物多样性的研究不断深入，发现至少有1 1 个原核生物门存在a m d 环境中。 其中主要有化能自养和异养细菌，古菌，真菌，此外也有原生动物存在嚣删。 1 2 1 细蔼 到躁前为止，浸漱体系中发现的细菌( 如图l l 所示) 可以分为4 大类汹1 ： p r o t e o b a c t e r i a ，n i t r o s p i r a ，f i r m i c u t e s 和a c i d o b a c t e r i a 。 现在研究的最多的是y - p r o t e o b a c t e r i a 亚纲中的a c i d i t h i o b a c i l l u s 属细菌和 n i t r o s p i r a 纲l e p t o s p i r i l l u m 属的细麓 在y - p r o t e o b a c t e r i a 亚纲中的a c i d i t h i o b a c i l l u s 属的细菌中，研究得比较多得 是a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s 菌( 简称为0 菌) 和a c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s 菌( 简称为z f 菌) 。 毒 硕士学位论文 第一章文献综述 图1 1 浸出体系中发现的细菌的1 6 sr d n a 基因系统发育树图 a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s 菌被认为是酸性环境中浸矿的主导菌种。早在2 0 世纪7 0 年代，n e l s o n ，t u o v i n e n ，k e l l y ，l e w i s ，m i l l e r ，m u r r 乘l e c c l e s t o n 等研究 指出，彳：厂菌主要代谢是氧化f e 2 + 为f e 3 + 而获得能量，亦可氧化硫化矿物、元素 硫、及可溶硫化合物，如硫代硫酸盐，甚至可氧化溶液中的一价铜离子及二价锡 离子，并对溶液中的c u 2 + ，c a 2 + ，m g + ，f e 3 + ，a u + 等金属离子具有一定的耐受力， 同时固定二氧化碳以生长阻川。该菌种浸矿的适宜温度为3 0 一3 5 。c ，温度过高 或过低，其浸矿性能均下降。 根据浸矿的实际需要m c c r e a d y ，n o r r s 和k e l l y 等人驯化k l d s m 5 8 3 等耐高温或 低温的菌株3 1 。随着基因工程的发展，h a r r i s o n ，b a r r o s 等人培养出a t c c l 9 8 5 9 和a t c c 2 3 2 7 0 等基因工程菌，蚀：厂菌可在较宽的温度范围内实现良好的浸出 效果仰瑚1 。 a c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s 菌也是浸出体系中经常存在的一种菌。它不能氧 化亚铁离子，但能够生长在元素硫及一些可溶性硫化合物上，将浸出过程中产生 的元素硫氧化。研究认为，a t h i o o x i d a n s 能增强4 ：弦，r d 似矗扬珊的浸矿作用汹1 。 硕士学位论文 第一章文献综述 经研究柏1 发现：n i t r o s p i r a 纲l e p t o s p i r i l l u m 属的细菌可以分为三类。 l e p t o s p i r i l l u m 3 国r r o o x d a n s ( g r o u p i ) 渊，l e p t o s p i r i l l u m f e r r i p h i l u m ( g r o u p l i ) 嘲和 l e p t o s p i r i l l u m ( g r o u p l i i ) 删。到目前为止，l e p t o s p i r i l l u m ( g r o u p l i i ) 的细菌只 是在i r o nm o u n t a i n ： 区通过克隆子文库中检测到其存在撕删。 l e p t o s p i r i l l u m 属菌株为革兰茨阴性细菌，螺旋状，具有嗜酸性，端生鞭毛， 最适生长p h 为1 5 1 8 ，严格好氧，专性化能自养，通过将二价铁氧化成三价 铁获得能量，有机质的存在对其生长有抑制作用。能氧化= 价铁离子、黄铁矿， 不能氧化硫和硫的其它还原性化食物灌。 l e p t o s p i r i l l u m 属的3 个类群( g r o u p i ，i i ，a n d i i i ) 在形态、生理生化特性方面无特 征性差异。分子水平上的研究结果显示，l f e r r i p h i l u m 的g + c 摩尔百分比为5 5 至5 8 ，有两个溉操纵子；l f e r r o o x i d a n s 鳇c r + c 摩尔百分比为4 瓣至5 2 9 6 ，有 3 个编码r r n a 的r i l l 操纵子。通过扩增1 6 sr r n a 基因后进行限制性酶切，可 以将这两类菌快速区分开来螨1 。l e p t o s p i r i l l u m 属的三种不同类群生长条件也有 差别。l f e r r o o x i d a n - - 般在p h1 0 以上，3 5 2 2 以下的环境中生长，而l f e r r i p h i l u m 可以在p h1 0 以下，3 5 。c 至4 5 的温度下生长1 。在工业化生物浸提含砷金 精矿的连续氧化罐中，大多数反应在4 0 ( 2 ，p h = l 左右的条件下进行，这样的环 境往往更适于l f e r r i p h i l u m 的生长。2 0 0 2 年，c o r a m 等人的研究显示，从南非 f a i r v i e w 矿区砷黄铁矿连续浸提罐中检测到的螺旋菌都是l f e r r i p h i l u m 蚰。 多年以来，人们一直以为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌0 ，菌) 是浸矿工业中最重要 的微生物。近些年来，随着分子生物学的发展，人们发现，在环境温度较低，铁离 子浓度不高的条件下，如自然界矿山的矿床中及堆浸反应初期，检测到的往往是 a f e r r o o x i d a n 及一些硫氧化细菌。但在许多环境温度较高，王价铁离子浓度高的 条件下，l e p t o s p i r i l l u m 属菌株占浸矿微生物种群的优势，是主要的铁元素氧化 者。如果体系中三价铁离子的浓度一直处于比较高的水平，a f e r r o o x i d a n s 的生长 受到抑制，l e p t o s p i r i l l u m 属菌株一直是反应体系中的优势罄m 1 。 y - p r o t e o b a c t e r i a 亚纲中的a c i d i t h i o b a c i l l u s 属细荫和n i t r o s p i r a 纲 l e p t o s p i r i l l u m 属的细菌均属于革兰氏阴性细菌，而一些革兰氏阳性的嗜酸性细 蓥主要包括a c i d i m i c r o b i u m ，f e r r o m i c r o b i u m 和s u l f o b a c i l l u s 属渖确瑚1 。嗜酸性的 古细菌已经被发现很多年，它们全部属于s u l f o l o b a l e s ，包括s u l f o l o b u s ，a c i d i a n u s ， 6 硕士学位论文第一章文献综述 m e t a l l o s p h a e r a ，a n ds u l f u r i s p h a e r a 属。许多嗜酸性细菌有氧和厌氧条件下都能 进行硫和铁的代谢的事实说明它们对a m d 生物处理具有重要的意义。 1 2 2 古菌 现在在生物浸出体系中发现的古菌仅仅限于两类：t h e r m o p l a s m a t a l e s 和 s u l f o l o b a l e s 。最常见古菌的是t h e r m o p l a s m a t a l e s 科中t h e r m o p l a s m a 属和 f e r r o p l a s m a 属的古菌。在生物浸出体系中检测到的t h e r m o p l a s m a t a l e s 科中古菌 的系统发育树图如1 2 1 所示。 l 图1 2 生物浸出体系中检测到的t h e r t c o p l a s t u n t a l e s 中古茵的系统发育树图 1 2 3 真核生物 已经有少数报道，在a m d 环境中存在真核生物，如，属于c i n e t o c h i l i u m 属的纤毛虫及属于v a h l k a m p f i as p 的阿米巴变形虫。也有一些研究从a m d 地区 分离出了h e t e r o l o b o s e a 和三种鞭毛虫( e u t r e p t i a ls p p ) ，它们通过捕捉矿物上的 氧化细菌生存i s 2 。l u t z 等也在i r o nm o u n t a i n 获得了v a h l k a m p f i as p 克隆。最近， a m a r a lz e t t l e r 等报道了在p n 为2 的西班牙r i ot m t o 河中存在很多的真核生物 群落( 包括藻类) ，在这一地点，真核生物组成了全部有生生命的6 0 。但是， 7 硕圭学位论文 第一章文献综述 还需要弄明白的是，在更加酸性的环境中是否也存在这些非光合作用的原生生 物。 1 3 酸性浸矿水中微生物的特性 3 脚环境中嗜酸性微生物豹一般特征 在a m d 环境中生存的嗜酸性微生物能够在低p h 值条件下生存，具有对强 酸的强耐受能力，嗜酸性微生物的这种能力来源于它们能够进行铁的代谢循环和 进行反向电子传递。铁的循环需要一个低的p h 条件，从而在有氧条件下照铁离 子能够作为电子供体；而在氧浓度降低的条件下，三价铁离子能够作为电子受体。 三价铁离子在中性p h 条件下几乎是不可溶的，而在酸性条件下其溶解度迅速增 加。使用三价铁离子作为电子受体对于嗜酸性微生物来说是非常有用的，但是对 于中性或者中度嗜酸的微生物则禳难利用，这是由于三价铁离子在有氧的中性环 境中很难溶解。 浸矿微生物等嗜酸性微生物的外部环境p h 值很低( e g p h1 0 2 o ) ，然而 在细胞体内其蝉值接近予中性秘h ，这一区别导致在细胞膜两边存在一个急捌下 降的p h 梯度，这一梯度对于进行微生物营养是非常重要的，特别是在利用亚铁 离子等弱还原剂作为电子供体时。自养微生物利用n a d ( p ) h 这类物质去还原碳 源( c 0 2 ) 以生成糖，核酸，氨基酸和其它分子有很高的需求。丽异养细菌豳于剩 用碳源比利用c 0 2 更容易，因此对n a d ( p ) h 要求较低，它们能够从各种营养物 质中获得氢原子来满足其较低的n a d ( p ) h 需求。化能无机自养细菌要求具有很 大的跨膜质子梯度产生形成质子势从而驱动n a d ( p ) h 的合成，这一过程被认为 是一种反向的电子传递或者称力上坡式的电子传递途径1 5 1 1 尽管这一现象在很 多利用铁和硫进行化能自养生物中还没有被研究，但是仍然有很强的证据表明， 当在铁为能源生长时，a f e r r o o x d i a n s 中存在一个独特的细胞色素b c l 复合体，其 功能不同于硫氧化过程中的b c l 复合体，这就是一种特殊的搿u p h i l l 弦途径i 鞠1 1 。 1 3 2 酸性矿坑水中嗜酸性微生物的代谢途径 矿物溶解产生的a m d 被认为是三价铁离子和酸( 典型的硫酸) 导致的一个 化学过程。因此，如采不考虑微生物生存的温度，无论是铁氧化还是硫氧化微生 物，它们都在矿物中的金属浸出过程中扮演着重要的角色，而铁和硫在微生物呼 吸过程中是作为电子供体存在。 1 3 2 2 铁作为能源 皱铁离子很容易被氧化成三价铁离子，在这一途径中皿铁离子作