（有机化学专业论文）基于核酸适体的dna生物传感器及分子机器的研究.pdf

f iyibililliillll71111114111iitotlllfl4itlll5lltllf3illlul 基于核酸适体的d n a 生物传感器及分子机器的研究 摘要 本论文利用核酸适体与目标的特异结合作用，开展基于核酸适体的d n a 生 物传感器、分子机器及逻辑门的研究，用于生命活性小分子三磷酸腺苷、单 磷酸腺苷，蛋白质凝血酶、腺苷脱氨酶的检测。本工作主要研究了基于凝血 酶和硫代三聚氰酸金纳米粒子( t c a - a u n p l 网状结构双放大效应的化学发光 d n a 生物传感器、以蛋白质和小分子作为激发物的双功能d n a 分子机器以及以 单磷酸腺苷) 和腺苷脱氨酶o 徊) 为激发物的电致发光逻辑门。本论文共分为 五章： 第一章，概述了d n a 生物传感器的设计原理、分类，介绍了d n a 生物传感 器的研究现状以及分子机器的研究进展。 第二章，研究了凝血酶和硫代三聚氰酸会纳米粒子网状结构的双重放大作 用：首先是凝血酶通过与其适体的特异性结合而标记到p b s 纳米粒子上，其次 是t c a - a u n p 网状结构使每个夹心式结构上能覆盖更多的a u 纳米粒子。在此基 础利用l u m i n 0 1 a u 3 + 体系进行化学发光检测，在l u m i n o l 。a u 3 + 体系的最适发光条 件下，对靶d n a 的检测范围为2 0 x 1 0 d 6 m o l l 到3 5 x 1 0 4 m o l l ，检测限能达到 1 o x l o 6 m o l l 。 第三章，研究了以蛋白质和小分子作为激发物的双功能d n a 分子机器的研 究，六条单链d 蝴过碱基互补形成镊子，c 和d 分别包含两种不同目标适体结 构，e 和f 其两端修饰了电化学发光分子和猝灭基团作为镊子闭合或打开的指示 信号。此时镊子处于闭合状态，电化学发光分子和猝灭基团距离比较近，使发光 猝灭。当加入核酸适体的目标，使其与c 和d 链反应，能将后者从分子机器主体 上剥离下来，自身变为适体目标形式的燃烧废物，使得e 和f 链打开，从而发光 增强。当再次加入c 和d 链时，使其分别与a 股和b 股的自由碱基杂合配对，就使 得这个分子机器呈现关闭状态，这时镊子是闭合的。在这里，目标充当“燃料” 的作用，实现其循环工作。核酸适体突破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存 储和转运载体的认识，利用其结构的多样性可实现类似抗体的分子配体或分子探 针的功能。由于适体适用范围广，可用于不具免疫原性的小分子和生物体内不稳 定或强毒性的靶标物的检测。 第四章，研究了以a m p 和a d 为激发物的电致发光逻辑门，由于适体具有多 样性和复杂性，并且能与其配体发生特异性结合，所以可以用于逻辑门的构建。 将修饰了电化学发光分子和猝灭基团的生物大分子、细胞等物质的核酸适体固定 在电极上，当加入生物大分子、细胞时，适体结构发生变化，使发光基团与猝灭 基团的位置发生变化，从而使逻辑门的输出信号发生变化。本实验设计的逻辑门 操作是建立在a m p 与其适体的特异性结合以及a d 对a m p 脱氨基作用的基础上 的。加入a m p 能与其适体发生特异性结合；) j 入a d 可以催化a m p 脱氨基，改变 a m p 的结构，破坏其与适体的结合。最终，利用电致化学发光分析输出信号。 本实验进行了进一步的改进，通过猝灭基团的引入，降低了背景干扰，提高了检 测的灵敏度。 结论部分，对全文内容进行了总结。 关键词：d n a 生物传感器；化学发光；分子机器；逻辑门 s t u d i e s0 nd n ab 1 0 s e n s o r sa n d m o l e c u i 气rm a c h i n e sb a s e do nn u c l e i c t h i st h e s i ss t u d i e do nd n a b i o s e n s o r s ，m o l e c u l a rm a c h i n e sa n dl o g i cg a t e sb a s e d o nn u c l e i ca p t a m e r so w i n gt oi t ss p e c i f i cb i n d i n gt ot h et a r g e t s ，w h i c hc a l lb eu s e dt o t h e d e t e c to fb i o a c t i v es m a l lm o l e c u l a r s a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( a t p l a n d a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e ( a m p ) ，p r o t e i n s - - - t h r o m b i na n da d e n o s i n ed e a m i n a s e t h i sp r e s e n tw o r km a i n l ys t u d i e do nc h e m i l u m i n e s c e n c ed n ab i o s e n s o r sb a s e do n d u a l a m p l i f i c a t i o no ft l l r o m b i na n dt h i o c y a n u f i ca c i d g o l dn a n o p a r t i c l en e t w o r k , l o g i c - b a s e dd u a l f u n c t i o n a ld n a t w e e z e r sw i t l lp r o t e i na n ds m a l lm o l e c u l e sa s m e c h a n i c a la c t i v a t o r sa n de l e e t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s e e n c e l o g i cg a t ew i t h a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ea m pa n da da sa c t i v a t o r s t h ew h o l et h e s i sc a nb ed i v i d e di n t of i v ec h a p t e r s ： c h a p t e r1t h i sc h a p t e ri n t r o d u c e dt h ed e s i g np r i n c i p l ea n dc l a s s i f i c a t i o no fd n a b i o s e n s o r s ，a n da l s oi n t r o d u c e dt h ep r e s e n tr e s e a r c ho ft h ed n ab i o s e n s o ra n dt h e r e c e n ta d v a n c e si nt h es t u d yo fm o l e c u l a rm a c h i n e s c h a p t e r2 t h e s t u d y o nc h e m i l u m i n e s c e n c ed n ab i o s e n s o r sb a s e do n d u a l - a m p l i f i c a t i o no ft h r o m b i na n dt h i o c y a n u r i ca c i d g o l dn a n o p a r t i c l en e t w o r k t h i s t h e s i ss t u d i e dt h ed u a l a m p l i f i c a t i o ne f f o r t so ft h m m b i na n dt h i o c y a n u r i ca c i d g o l d n a n o p a r t i c l en e t w o r k , f i r s t ，t h et h m m b i nl a b e l e do nt h ep b sn p st h r o u g ht h es p e d f i c i n t e r a c t i o nw i t hi t sa p t a m e r s ；s e c o n d ，t c a a u n pn e t w o r ki n t r o d u c i n gm o r ea u n p s c a p p e df o re a c hs a n d w i c hf o r m a t t h ec ld e t e c t i o no fd n aw a st a k e no u tw i t ht h e u s eo fl u m i n o l a u s y s t e m o nt h eo p t i m u mo fl u m i n o l - a u 3 + s y s t e m ，t h et a r g e t d n ac a l lb ed e t e c t e di nt h er a n g eo f2 o 1 0 - 1 6 mt o3 5 1 0 。1 。i m w i t hal i m i to f d e t e c t i o n ( l o d ) a sl o w a s1 o x l o 。1 6m c h a p t e r3t h es t u d yo nl o g i c - b a s e dd u a l f u n c t i o n a ld n at w e e z e r sw i t h p r o t e i na n ds m a l lm o l e c u l e sa sm e c h a n i c a la c t i v a t o r s n et w e e z e r sc o n t a i n e dt w o s y m m e t r i c a lc o m p o n e n t s ，a n ds i xd n as t r a n d s ( at of ) w e r eh y b r i d i z e dt of o r mt h e d o s e ds t a t e i ns t r a n d sca n dd ，t h e r ei sa8 一b a s e r e c o g n i t i o nr e g i o nt h a t i s c o m p l e m e n t a r yt oi t sa p t a m e r s t r a n de a n dfa r el a b e l l e da tt h e5 a n d3 e n d s 丽t h f l u o r o p h o r ea n di t sq u e n c h e ra s f u n c t i o n a lc o m p o n e n t s i nt h ed o s e ds t a t et h e f l u o r o p h o r ea n dq u e n c h e ra r ec l o s et oe a c ho t h e ra n df l u o r o p h o r ec a nb eq u e n c h e d e f f i c i e n t l y i nt h es t r a n d sc a n dd ，t h e r ei sa r e c o g n i t i o nr e g i o nt h a ti sc o m p l e m e n t a r y t 0i t s i n p u t ，d r i v i n g t h et w e e z e r st o o p e n s t a t ea n d r e l e a s e i n g t w oi n e r t d o u b l e - s t r a n d e dw a s t ep r o d u c t s s ot h et w os t r a n d sea n dfa r ef a ra w a yf r o me a c h o t h e ra n dt h eq u e n c he f f i c i e n c yi sl o w ，s ot h ec ls i g n a li n c r e a s e di ni n t e n s i t yr e l a t i v e t ot h a tf o rt h ed o s e ds t a t e w h e nt h es t r a n d sca n ddw e r ea d d e da g a i n ，t h e y c o m p l e m e n t a r y 丽ms t r a n d saa n db ，d r i v i n gt h et w e e z e rt o c l o s e ds t a t e i nt h i s p r o c e s s ，t h et a r g e tm o l e c u l a r sw e r es e w e da st h ef u e lt oa c h i e v et h ec y c l i n go p e r a t i o n o ft h et w e e z e r t h en u c l e i ca p t a m e r sc h a n g e dt h et r a d i t i o n a lr e c o g n a t i o no fn u c l i e c a c i d ，w h i c hw a su s e dt os t o r a g ea n dc a r r yt h eg e n e t i ci n f o r m a t i o n d u et o t h e i r d i v e r s i f i e ds t r u c t u r e s ，a p t a m e r sc a l la c h i e v et h es i m i l a rf u c t i o na st h el i g a n d so f a n t i b o d ya n dm o l e c u l a rp r o b e s n ea p t a m e r sh a v em a n yp o t e n t i a la p p l i c a t i o n s ，s u c h a st h ed e t e c t i o no fs m a l lm o l e c u l a r sw i t h o u ti m m u n i z a t i o na n dt h et a r g e t sw h i c ha r e u n s t a b l eo rt o x i c c h a p t e r4 ，n l es t u d yo ne l e e t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s e e n c el o g i cg a t ew i t h a m pa n da da sa c t i v a t o r s n u c l e i ca c i da p t a m e r sa r ei m p o r t a n tm a t r r i a l sf o rt h e c o n s t r u c t i o no fl o g i cg a t e ，b e c a u s et h e i rd i v e s i t ya n dc o m p l e x i t y t h e yc a nb i n d s p e c i f i c a l l yw i t ht h e i rl i g a n d s t h en u c l e i ca p t a m e r sl a b e l l e dw i t hf l u o r o p h o r ea n d q u e n c h e rw e r ei m m o b l i z e do nt h ee l e c t r o d e s w h e nt h et a r g e t sw e r ea d d e di n ，t h e d i s t a n c eb e t w e e nf l u o r o p h o r ea n dq u e n c h e rw a sc h a n g e d ，s ot h eo u t p u ts i g n a l so ft h e l o g i cg a t ea l s oc h a n g e d ，1 1 l el o g i cg a t ed e s i g n e di nt h i st h e s i sw a sb a s e do ns p e c i f i c r e c o g n i z a t i o no fa m pt oi t sa p t a m e ra n dt h ed e a m a t i o no fa d w h e na m p w a s a d d e d ，i tb i n d e d 丽mi t sa p t a m e rs p c i f i c a l l y ；t h ea d d i t i o no fa dc a t a l y t i c st h e d e a m a f i o no fa m p ，w h i c hc h a n g e dt h es t r u c t u r eo fa m p ，t h e r e f o r ，t h ea m pw o u l d n o tb i n dw i t hi t sa p t a m e r f i n a l l y ，t h eo u t p u ts i g n a lo ft h el o g i cg a t ew a sd e t e c t e db y e l e e t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s e e n c ea n a l y s i s af u r t h e ri m p r o v m e n tw a st a k e no u t b yt h ei n t r o d u c t i o no ft h eq u e n c h e r b yt h i sw a y ，t h eb a c k g r o u dn o i s ew a s d e c r e a s e d a n dt h es e n s i t i v i t yw a si m p r o v e de f f i c i e n t l y c h a p t e r5w a st h ec o n c l u s i o no ft h ew h o l ew o r k k e yw o r d s ：d n ab i o s e n s o r ；c h e m i l u m i n e s c e n c e ；d n at w e e z e r ；l o g i cg a t e 目录 第一章前言1 1d n a 的结构一1 2d n a 生物传感器的研究2 2 1 生物传感器2 2 2 d n a 生物传感器2 2 3 纳米粒子在d n a 生物传感器中的应用3 3 核酸适体3 3 1 核酸适体的特点3 3 2 核酸适体的筛选”4 3 3 核酸适体生物传感器4 4 化学发光生物传感器的研究4 4 1 化学发光分析基本原理及特点”5 4 2 化学发光生物传感器的分类”6 4 3 化学发光生物传感器的特点”6 4 3 化学发光生物传感器的研究现状及前景展望7 5 逻辑门9 6d n a 分子机器的研究。9 6 1 基于适体的分子机器1 0 6 2 分子机器的荧光检测“1 0 7 电致化学发光1 0 8 本论文的研究目的和意义1 1 第二章基于凝血酶和硫代三聚氰酸一金纳米粒子网状结构双重放大 作用的d n a 化学发光生物传感器1 3 1 弓l 言1 3 2 实验部分小1 4 2 1 仪器与试剂1 4 2 2 实验方法1 5 2 2 1 水溶性p b s 纳米粒子的制备及修饰1 5 2 2 2 a u 纳米粒子的制备及凝血酶适体( s 5 ) 修饰”1 5 2 2 3 捕获探针在磁珠上的固定1 6 2 2 4 杂交法制备目标产物及其信号的放大1 6 2 2 5 化学发光检测1 6 2 3 发光检测的条件选择”1 7 2 3 1a u 3 + 催化l u m i n u o l 化学发光反应体系最佳条件的选择1 7 2 3 2 a u 3 + 催化l u m i n u o l 化学发光谱图的测定1 7 3 结果与讨论1 8 3 1 构建夹心式结构和信号放大的原理1 8 3 2 制备的金及硫化铅纳米粒子的特性1 9 3 3l u m i n o l 、a u 3 + 体系化学发光最佳条件的选择2 0 3 3 1 加样顺序对l u m i n 0 1 a u 3 + 体系化学发光强度的影响”2 0 3 3 2l u m i n o l 浓度对l u m i n 0 1 a u 3 + 体系化学发光强度的影响2 1 3 3 3l u m i n o l 标液的p h 值对l u m i n o l - a u “体系化学发光强度的影响2 1 3 4 a u 纳米粒子的最适粒径的选择2 2 3 5 靶d n a ( s 2 ) 的选择2 2 3 5 1 靶d n a ( s 2 ) 的浓度与化学发光强度之间的线性关系”2 3 3 5 2 加入不同的靶d n a 发光信号的对照2 5 3 6t c a 浓度对化学发光检测的影响2 6 3 7d n a 生物传感器的重现性2 7 4 _ 、结一2 8 第三章以蛋白质和小分子作为激发物的双功能d n a 分子机器的研 究“”2 9 1 引言2 9 2 实验部分3 0 2 1 仪器与试剂3 0 2 2 实验方法3 1 2 2 1 凝血酶和a t p 竞争得到输入d n a 序列3 1 2 2 2 分子机器的构建和操控3 2 2 2 3 分子机器的荧光检测3 2 2 2 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳3 2 3 结果与讨论3 2 3 1 双功能分子机器的设计原理一3 2 3 2 处于关闭和打开状态的分子机器的荧光特性一3 4 3 3 分子机器与s s d n a ( e 和f ) 的荧光特性比较3 5 3 4 激活剂的量对分子机器荧光强度的影响”3 6 3 5 分子机器激发波的选择3 7 3 6 分子机器的聚丙烯酰胺凝胶电泳3 9 3 7 分子机器的重复操作4 1 3 8 体系中激活剂的选择性一4 2 3 9d n a 逻辑门操作的构建4 3 4 j 、结4 4 第四章以单磷酸腺苷和腺苷脱氨酶为激发物的电致化学发光逻辑门 的研究4 5 1 引言4 5 2 实验部分4 5 2 1 仪器与试剂“4 5 2 2 实验方法4 6 2 2 1r u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) n h s 的制备4 6 2 2 2r u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) 一s s d n a 的制备4 7 2 2 3 二茂铁标记s s d n a ( s 3 ) 4 8 2 2 4 玻碳电极的预处理4 8 2 2 5 多壁碳纳米管的处理及多壁碳纳米管修饰电极的制备4 8 2 2 6 多壁碳纳米管修饰电极表面s s d n a 的固定4 8 2 2 7 电致化学发光检测4 9 m 3 结果与讨论4 9 3 1 实验原理4 9 3 2 缓冲溶液对多壁碳纳米管修饰电极电致发光检测的影响”5 0 3 3p h 值对多壁碳纳米管修饰电极的影响5 1 3 4 a m p 的量对电致化学发光强度的影响5 1 3 5 多壁碳纳米管修饰电极的选择性5 1 3 6s s d n a 固定时间对电致发光的影响5 2 3 7 电致化学发光( e c l ) 谱图比较5 3 3 8 逻辑门操作的构建5 5 3 9 逻辑门操作的重复性5 6 4 小结”5 7 第五章结论”5 8 参考文献”6 0 致谢6 8 硕士期间发表论文6 9 声明”7 0 i v 青岛科技人学研究生学位论文 第一章前言弟一早月i j吾 核酸一种由核苷酸构成的生物大分子，在生物体内，常用来携带遗传信息或 作为细胞内部结构的组成部分。根据其组成中戊糖的不同，核酸分为核糖核酸 ( r i b o n u c l e i ca c i d ，r n a ) 和脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 。d n a 是生物 遗传的主要物质基础，具有贮存和传递遗传信息的作用。从1 9 5 3 年w a t s o n 和 c l a r k 发现d n a 的双螺旋结构【l 】建立生物遗传基因的分子机理以来，有关d n a 分子的识别、测序一直为人们所关注。d n a 的结构和组成特性，决定了它在生物 转化过程中具有特异性的识别能力、强大的催化能力以及高度的灵敏性，故而可 以用于发展d n a 生物传感器、d n a 分子机器以及逻辑门【2 卅。 1d n a 的结构 d n a 的基本单元是4 种脱氧核苷酸，脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键彼此相 连。脱氧核苷酸由脱氧核糖、磷酸根和碱基3 种成分组成。脱氧核糖是在2 7 位没 有羟基的五碳糖。碱基主要有嘧啶碱和嘌呤碱两类。嘧啶碱有两种：胞嘧啶 ( c y t o s i e n ) 和胸腺嘧啶( t h y m i n e ) 。嘌呤碱也有两种：鸟嘌呤( g u a n i n e ) 和腺嘌呤 ( a d e n i n e ) 。磷酸基团连在脱氧核糖的3 7 位羟基或5 位羟基，碱基连在脱氧核糖的 1 7 位。 d n a 的一级结构是由数量极其庞大的4 种脱氧核糖核苷酸即：腺嘌呤脱氧核 苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸以及胸腺嘧啶脱氧核苷酸，通过3 7 ， 5 磷酸二酯键连接起来的直线或环形多聚体。 w a s t o n 和c r i c k 在1 9 5 3 年提出了d n a 分子的双螺旋结构模型( 即d n a 的二 级结构、) ：两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕，嘌呤和嘧啶碱位 于双螺旋的内侧，两条链依靠碱基之间的氢键结合在一起。d n a 的构象主要有a 型、b 型、c 型、d 型、e 型和z 型。其中a 型、b 型、c 型、d 型和e 型均为 右手螺旋，只有z 型是左手螺旋。w a s t o n 和c r i c k 发现的是b 型d n a 。对于b 型d n a 而言，碱基位于双螺旋的内侧，具有疏水性，由磷酸二酯键形成的多核 苷酸主链位于外侧，是亲水性的。d n a 还可以在二级结构的基础上形成三级结构， 即d n a 分子( 双螺旋) 通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括二级结构单元间的 相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及d n a 的拓扑特征。生物体内 基于核酸适体的d n a 生物传感器及分子机器的研究 的d n a 通常是与蛋白质结合，以复合物的形式存在的。 2d n a 生物传感器的研究 2 1 生物传感器 传感器是一种能对物理、化学刺激做出响应并将其转化成为可以检测的信号 的设备。它至少应包括两个部分：目标识别单元和信号转化单元。目标识别单元 可以是化学物质也可以是生物物质，可以使有机小分子、多肽、蛋白质、核酸、 糖类，甚至是完整的生物细胞，但是必须保证这一单元具有高度的亲和性( 检测限 低) 、特异性( 干扰小) ，活性范围宽、响应快、保存期限长，最好是能用同一类型 的识别单元检测多种物质。信号转化单元能将目标识别过程转化成为诸如发光、 电化学之类的可以检测的信号【7 l 。 生物传感器是一种以固定在基质上的生物敏感材料作为识别单元的多功能 元件i 团。其基本原理是利用生物敏感材料具有特异的目标识别能力，对测定物质 具有较高的灵敏度和选择性：生物敏感材料构成分子识别部分，被识别的信息再 经过信息转换器形成可检测的信号输出。生物传感器核心是由生物敏感材料和信 息转换器，如示意图1 1 所示。生物敏感材料可以是固定化的酶、抗体、微生物、 细胞或组织等；信号转换器一般有电化学测量装置、热敏电阻器、场效应管( f e t ) 、 光敏二极管、光纤、压电元件、s a w 元件等。 待 测 物 示意图1 1 生物传感器组成【9 l s c h e m e1 - 1t h es t r u c t u r eo fb i o s e n s o r d 根据生物敏感材料的识别属性的不同，生物传感器可分为d n a 传感器、免 疫传感器、酶传感器、核酸适体传感器与受体传感器等。 2 2d n a 生物传感器 2 青岛科技人学研究生学位论文 由于d n a 结构对辅因子的结合具有高度的灵敏性，是构建生物传感器的一 种重要的材料i l o l 。d n a 生物传感器是以固定在固体表面的d n a 作为探针与靶 d n a 通过碱基互补配对结合在一起，从而将生物反应过程转化为发光信号或电化 学信号。d n a 生物传感器不仅能测定d n a 的浓度，还能识别部分碱基的排列顺 序，可确定微生物的种属，这是一般生物传感器所不具备的特性。按转换信号的 不同可以将d n a 生物传感器分为d n a 电化学传感器、d n a 光学传感器、d n a 压电传感器等三类。 同其它生物传感器一样，d n a 生物传感器包含目标识别单元( d n a ) 和能量转 换单元两部分。目标识别单元主要用来感知样品中是否含有( 或含有多少) 待测物 质，能量转换单元则将识别器件感知的信号转化为可以观察记录的信号f 如电流大 小、频率变化、荧光和光吸收的强度等) 。在待测物、目标识别单元以及能量转换 单元之间由一些生物、化学、生化作用或物理作用过程彼此联系。 2 3 纳米粒子在d n a 生物传感器中的应用 纳米粒子具有稳定性高、便于标记以及价格便宜的优点，所以在d n a 和蛋 白质检测中可用来作为氧化还原标- 、记_ t 1 1 , 1 2 l ，常采用的检测方法是：以纳米粒子作为 标记物，用强氧化性的溶剂将其溶解后，用电化学或化学发光分析检测金属离子 1 1 3 q 5 j 。近几年就有报道，用具有电化学或光学特性的金属纳米粒子和半导体纳米 粒子作为标记物进行d n a 检测，有效的克服了放射性同位素、荧光以及酶标记 物的诸多缺点，如安全问题、灵敏性差、稳定性低等【1 e 2 0 。 3 核酸适体 近年来研究发现，d n a 和r n a 不仅起遗传信息存储和传递的作用还可以籍 自身形成的空间结构与其它类型的分子相互作用，利用寡核苷酸问的严格的识别 和亲和力而设计的人工合成寡核苷酸适体( a p t a m e r ) 的出现，使抗体抗原反应发 生新的革命性变化，弥补了现有抗体的不足。也为生物传感器的传感器发展开辟 了一条新的道路。 适体是一段由2 5 8 0 个碱基组成的单链寡核苷酸片段，可以是d n a 也可以 是r n a 2 1 , 2 2 ，也称为核酸适体、适配体、适配子等。而核酸适体传感器是利用核 酸适体与靶分子的识别进行相关物质检测的生物传感器。近年来，核酸适体传感 器的研究得到了飞速的发展，在核酸适体传感器的设计、分析特性如灵敏度、线 性范围和稳定性的改善，以及应用范围等研究方面取得了显著的进展【2 3 l 。 3 1 核酸适体的特点 3 基丁核酸适体的d n a 生物传感器及分子机器的研究 核酸适体的特点主要体现在以下几个方面： ( 1 ) 高亲和力、严格的识别能力和反应的特异性：寡聚单链r n a 或d n a 能 形成多种热力学稳定的三维空间结构，使得其与靶分子很较强的亲和力。核酸适 体与配体之间有很大的接触面积，配体方面极其细微的变化可被适体感知形成了 识别的高特异性。 ( 2 ) 与靶序列作用的广泛性：适体所结合的靶不仅限于蛋白质与核酸还能作 用于酶、基因调节因子、生长因子、抗体、植物凝集素、病原菌、完整的病毒颗 粒等。适体也用于小分子量物质的检测，包括有机染料、金属离子、药物、氨基 酸、辅因子、抗生素、氨基糖苷、核酸碱基类似物、核苷酸等。 ( 3 _ ) 用于诊断试验的普遍性：靶分子与适体的结合类似抗原与抗体形成的复 合物，其结合信号可以通过多种方式表现，可通过标记物检测结合信号，如酶标 记、放射性标记、荧光标记与生物素标记，另外还可以应用流式细胞技术、传感 器、荧光偏振、分子灯塔以及毛细管电泳等检测手段，其应用的广泛性远胜过抗 体。 3 2 核酸适体的筛选 富集配体系统进化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o n o fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a l e n r i c h m e n t s e l e x ) 技术是2 0 世纪9 0 年代初发展起来的一项新的组合化学技 术，是系统论与分子生物学相结合的产物。核酸适体的筛选过程就是通过 s e l e x 技术实现的，首先利用s e l e x 技术从核酸库中得到核苷酸片段，再 经聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 进行扩增，最后排列成 一个特定的识别单元【2 4 。2 6 1 。 3 3 核酸适体生物传感器 核酸适体生物传感器是一种能够连续和可逆地进行识别的装置，也可以视作 信息采集和处理链中的一个逻辑元件。主要是由接收器、电子线路和换能器三部 分组成，经过电子系统的放大处理和显示，就可以对待测物质进行定量检测。 待测物质通过具有分子识别功能的接收器时，固定在接收器上的亲和配基与 待测生物分子相互作用的瞬间发生能量转移，经过换能器，这种能量会以光或电 等物理信号的方式输出，经过电子系统的放大处理和显示，就可以对待测物质进 行定性检测。 4 化学发光生物传感器的研究 化学发光是指当基态分子吸收化学反应释放的能量跃迁成激发态，处于激发 4 青岛科技人学研究生学位论文 态的分子以光辐射形式返回基态时产生的光。化学发光分析就是根据化学发光反 应在某一时刻的发光强度( 如峰值强度) 或发光总量确定反应中相应组分含量的分 析方法。 4 1 化学发光分析基本原理及特点 化学发光( c l ) 是化学物质在特定化学反应中产生的光辐射现象。通过高能中 间体的分解在化学反应中激发单态分子形成的，分子被激发后不稳定，它要释放 出多余能量而回到基态，其中部分的能量即以发光形式释放出来的【2 7 1 。因此，一 个化学发光反应包括激发过程和发光过程。一些激发态分子能量也会通过系问串 跃和系内串跃消失，因此，化学发光反应的效率是： o c l = b c e o e m ( 1 ) 式中，t b c l 为化学发光效率，西c e 为生成激发态的效率，t h e m 为激发态发 光效率。o e m 和o c e 定义分别为： o e m = 发光的分子数生成激发态的分子数但) o c e = 生成激发态的分子数参加反应的分子数 ( 3 ) 从( 1 ) 、( 2 ) 、( 3 ) 式得化学发光效率o c l 等价于生成磷光和荧光的量子效率。 即o c l = 发光的分子数参加反应的分子数 h ) 化学发光分析测定的物质可以分为三类：第一类物质是化学发光反应的反应 物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂、抑制剂或者增敏剂；第三类物质是 偶合反应中的反应物、增敏剂或者催化剂等。通过标记方式利用这三类物质还可 以测定其他人们感兴趣的物质，进一步了扩大化学发光分析的应用范围。 常用的化学发光体系有：光泽精化学发光反应体系、鲁米诺化学发光体系、 高锰酸钾化学发光反应体系、钉( 田联吡啶配合物化学发光反应体系、过氧草酸 酯类化学发光反应体系、铈( m 化学发光反应体系等。 鲁米诺的化学发光机理一般被认为是研究的比较的透彻的，实际上，到目前 为止，其被氧化的中间产物还没有得到统一结论，只是确定了最终发光的物质是 氨基邻苯二甲酸盐离子。鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 化学名为3 氨基邻苯二甲酞阱，它的性 质稳定、结构简单、无毒、水溶性好，是最早使用和应用最广泛的化学发光试剂 之一。在碱性条件下可被k m n 0 4 、k 3 f c ( c 6 、h 2 0 2 、k 1 0 4 、n a c l 0 、活性氧等 氧化，发出波长为4 2 5n m 。鲁米诺的不足是氧化发光的反应速度比较慢，可以向 体系中加入某些酶类或无机催化剂，如微过氧化物酶、辣根过氧化酶、过氧化氢 酶等酶类；细胞色素c 、血红